在轉(zhuǎn)基因植株中表達HaAK基因dsRNA的RNAi載體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明具體涉及一種在轉(zhuǎn)基因植株中表達棉鈴蟲Ha4K的雙鏈RNA (dsRNA)的RNAi載體及其在沉默棉鈴蟲靶標(biāo)基因中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在我國，目前對棉鈴蟲進行噴施殺蟲劑仍然是主要防治手段。高毒高殘留農(nóng)藥的濫施，不僅導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)品質(zhì)量下降，棉鈴蟲抗藥性的增加，而且已危及人們的生命安全和健康。因此，生產(chǎn)上迫切需要發(fā)展安全、有效、新型的策略來控制害蟲種群的危害。
[0003]RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指進化過程中，由雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)誘導(dǎo)同源 mRNA 高效特異性降解的現(xiàn)象(Fire et al.，1998) ο 在線蟲中通過喂養(yǎng)表達 dsRNA 的細(xì)菌(Kamath et al., 2001 ；Timmons et al.，2001)，或從溶液中吸食dsRNA (Tabara et al.，1998)，或者通過顯微注射(Fire et al.，1998)，均能觸發(fā)干擾基因表達沉默，且RNAi的表型至少可以遺傳2代(Grishok et al.，2000)。dsRNA作為細(xì)胞內(nèi)源性基因表達調(diào)節(jié)物通過降解mRNA發(fā)揮作用，已發(fā)展成為控制有害病原物的重要工具。
[0004]近年來，利用轉(zhuǎn)基因植物介導(dǎo)的抑制昆蟲基因表達的RNAi技術(shù)迅速成為國內(nèi)外研宄熱點。Mao等(2007)分離了棉鈴蟲參與棉毒素(棉酚)解毒的P450基因。用表達相應(yīng)dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物喂食后，棉鈴蟲P450基因的表達顯著降低，對棉酚的耐受性大大減弱。再用含有棉酚的飼料或棉花葉片喂食，這些棉鈴蟲生長緩慢，甚至死亡。Baum等(2007)使用cDNA基因文庫方法從玉米根蟲中篩選出290個在昆蟲生命活動中發(fā)揮必要生物功能的基因作為dsRNA的候選靶標(biāo)，研宄結(jié)果表明最有效的是V型ATP酶(V_type ATPase)，其能夠在極低的濃度(1.82ng/cm2)攝食24小時內(nèi)快速引起根蟲的特異RNAi沉默反應(yīng)。通過對玉米進行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因玉米，使其表達出以玉米根蟲關(guān)鍵酶為靶標(biāo)的dsRNA，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因玉米的根部遭受的破壞要比對照減少50% (Baum et al.，2007)。在植物中表達害蟲關(guān)鍵功能基因的雙鏈RNA，通過昆蟲取食植物，將dsRNA傳遞到昆蟲體內(nèi)，能夠特異地抑制昆蟲防御基因的表達，使RNA干擾抗蟲植物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用成為可能。
[0005]在昆蟲中，那些編碼重要蛋白的功能基因是RNAi很好的靶標(biāo)。在植物中表達針對這些基因的雙鏈RNA (dsRNA)，通過昆蟲取食植物時，將雙鏈RNA傳遞到昆蟲體內(nèi)，能夠特異地抑制相應(yīng)昆蟲關(guān)鍵功能基因的表達，從而導(dǎo)致昆蟲的生長和發(fā)育缺陷，甚至殺死昆蟲。
[0006]本發(fā)明克隆棉鈴蟲能量代謝的關(guān)鍵酶基因一一精氨酸激酶基因HaAK，以其為靶標(biāo)基因，利用Gateway技術(shù)，以植物RNAi表達載體pANDAHK35為基礎(chǔ)，構(gòu)建出針對于靶標(biāo)基因HaAK的植物遺傳轉(zhuǎn)化的RNAi載體，在農(nóng)桿菌的介導(dǎo)下，培育出表達HaAK的dsRNA的轉(zhuǎn)基因擬南芥，棉鈴蟲取食轉(zhuǎn)基因擬南芥之后，對一齡幼蟲致死率高達55%，對三齡幼蟲的生長發(fā)育有明顯的抑制作用，且取食轉(zhuǎn)基因擬南芥后棉鈴蟲體內(nèi)HaAK基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯的低于對照。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于針對棉鈴蟲對農(nóng)業(yè)作物嚴(yán)重的危害情況，提供選取棉鈴蟲能量代謝關(guān)鍵基因-精氨酸激酶基因HaAK為RNAi的靶標(biāo)基因來防治棉鈴蟲。
[0008]本發(fā)明的第一方面是提供一種在轉(zhuǎn)基因植株中表達棉鈴蟲HaAK的dsRNA的RNAi載體。
[0009]本發(fā)明的另一方面是提供基于針對HaAK靶標(biāo)基因，利用植物介導(dǎo)的RNAi對棉鈴蟲幼蟲生長發(fā)育的影響。
[0010]本發(fā)明的技術(shù)方案在于采用一種在轉(zhuǎn)基因植株中表達棉鈴蟲HaAK的dsRNA的RNAi載體，該載體是由HaAK片段以正反兩個方向插入植物表達載體pANDA35HK中構(gòu)建而成，其中兩個HaAK基因片段之間包含一fgus linker fragment。
[0011]所述的植物表達載體為pANDA35HK質(zhì)粒；所述質(zhì)粒載體包含植物篩選標(biāo)記基因NPT-1I與HPT，所述的HaAK是棉鈴蟲的精氨酸激酶基因，其中，HaAK基因片段的正反向片段均為從棉鈴蟲中克隆獲得的HaAK的全長cDNA序列。
[0012]本發(fā)明的技術(shù)方案還在于采用一種含有棉鈴蟲HaAK基因RNAi載體的宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞包括大腸桿菌細(xì)胞、農(nóng)桿菌細(xì)胞或者植物細(xì)胞。
[0013]本發(fā)明的技術(shù)方案還在于采用一種棉鈴蟲HaAK基因RNAi載體在沉默靶標(biāo)基因表達中的應(yīng)用，從含有棉鈴蟲HaAK基因RNAi載體的大腸桿菌細(xì)胞提取質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌細(xì)胞，通過農(nóng)桿菌侵染擬南芥，并最終獲得轉(zhuǎn)基因植株。通過將轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株進行對比，結(jié)果顯示，棉鈴蟲取食轉(zhuǎn)基因擬南芥之后，對一齡幼蟲致死率高達55 %，對三齡幼蟲的生長發(fā)育有明顯的抑制作用，且取食轉(zhuǎn)基因擬南芥后棉鈴蟲體內(nèi)HaAK基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯的低于對照。
【附圖說明】
[0014]圖1為質(zhì)粒pANDA 35HK_dsHaAK的示意圖。
[0015]圖2為轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的檢測。圖中，M表示是Marker ; I表示是對照植株；2_8表示是轉(zhuǎn)基因陽性植株。
[0016]圖3為轉(zhuǎn)基因植株表達HaAK dsRNA的Northern blot檢測。I表示是對照植株；
2-9表示是轉(zhuǎn)基因陽性植株。Actin為內(nèi)參基因。
[0017]圖4飼喂轉(zhuǎn)基因植株對一齡棉鈴蟲幼蟲的致死率。I齡棉鈴蟲幼蟲，以正常的擬南芥為對照，以不同轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)tdsHaAK-6，AtdsHaAK-8 and AtdsHaAK-1l為實驗組飼喂1-3天對棉鈴蟲的致死率。
[0018]圖5飼喂轉(zhuǎn)基因植株對三齡棉鈴蟲幼蟲體重的影響。以正常的擬南芥為對照，以不同轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)tdsHaAK-6，AtdsHaAK-8 and AtdsHaAK-1l為實驗組飼喂3齡棉鈴蟲幼蟲1-5天其體重的增加量的影響。
具體的實施方式
[0019]實施例1，HaAK基因的克隆:
[0020](I)取棉鈴蟲1-2頭，用TRIzol法提取總RNA ；
[0021](2)合成cDNA第一條鏈；
[0022](3)從棉鈴蟲轉(zhuǎn)錄組中獲取基因片段序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對之后，根據(jù)其序列利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計F1/R1 ；
[0023](4)Fl:5' -ATGGTGGACGCCGCAACAAT-3'；
[0024](5)R1:5, -TTACAGCGACTTCTCAATT-3'。
[0025](6)以步驟⑵合成的棉鈴蟲cDNA第一條鏈為模板，以(4)、(5)中引物進行RT-PCR 擴增。RT-PCR 反應(yīng)程序為:94°C 變性 5min ;35 個循環(huán)(94 °C lmin，56°C lmin，72 °C lmin) ；72 °C 1min。反應(yīng)體系(25 μ L):10XEx PCR Buffer 2.5 yL,2.5mM dNTPMixture 2.0 μ L，10 μ M 上游引物 FlI μ L，10 μ M 下游引物 RlI μ L，cDNA 模板，2 μ L，5U/ μ LEx Taq 0.5 μ L? ddH20 16 μ L。
[0026](7)PCR產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用膠回收試劑盒回收純化目的片段。
[0027](8)將步驟(7)回收純化的目標(biāo)片段與PMD18-T質(zhì)粒相連接，反應(yīng)體系如下:2XBuffer5.0 μ 1、pMD18_T Easy Vector 0.5 μ I, PCR 產(chǎn)物 3.5 μ 1、T4DNA 連接酶 1.0 μ I，上述成分混勻后16°C連接過夜，獲得pMD18-HaAK質(zhì)粒。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài)，步驟如下:取一管_70°C保存的感受態(tài)細(xì)胞，冰盒上融化，加入10 μ I連接產(chǎn)物，輕搖混勻，冰浴30min ;42°C熱激90s后迅速置冰浴2min，加入400 μ I液體LB，37°C 150rpm振蕩培養(yǎng)45min ;取200 μ I培養(yǎng)液均勻涂布于涂有氨芐青霉素(100mg/L)平板上，37°C靜置培養(yǎng)12ho挑取平板上長出的單克隆，在含有氨芐青霉素(100mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中37°C、220rpm培養(yǎng)16h，經(jīng)引物F1/R1進行PCR鑒定為陽性克隆后，全自動序列儀進行測序(由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成)，獲得的棉鈴蟲精氨酸激酶基因的核苷酸序列登錄 GenBank (登錄號:⑶937510)。
[0028]實施例2，RNAi植物表達載體的構(gòu)建
[0029](I)以克隆獲得的棉鈴蟲HaAK基因序列為基礎(chǔ)，設(shè)計特異性正向引物F2:5 ' -CACCATGGTGGACGCCGCAACAAT-3 '(在特異性引物Fl加上四個堿基)，以Rl:5' -TTACAGCGACTTCTCAATT-3 '為反向引物，用 Prime STAR TM HS DNA 聚合酶對質(zhì)粒pMD-HaAK進行PCR擴增。擴增反應(yīng)體系為(總體系25 μ L):5 XPrime STAR酶0.25 μ L，5 X Prime STAR Buffer 2.5 μ L，dNTPs 2 yL,引物 F2/R1 各 I μ L，模板 pMD 18-HaAK0.5 yL,補 ddH20 至 25 yL。擴增條件為:94 °C 5min，30 個循環(huán)(94 °C lmin, 5