本發(fā)明屬于重組抗體技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一對真核表達載體的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

CD14有mCD14和sCD14兩種類型，是細胞表面的糖蛋白，其生物學功能主要是識別、結(jié)合LPS或LPS/LBP復合物，介導LPS所致的細胞反應(yīng)，在LPS性炎癥反應(yīng)、內(nèi)毒素休克等病理反應(yīng)中起重要作用。篩選出能識別CD14分子的抗體，對研究CD14分子的功能及整個通路都具有重要作用。若能夠完全封閉CD14的功能，特異性的阻斷CD14與LPS及LPS/LBP復合物結(jié)合，就能夠防止或中止LPS性炎癥反應(yīng)、內(nèi)毒素休克等病理反應(yīng)的發(fā)生，對于臨床治療內(nèi)毒素血癥、內(nèi)毒素休克等也將會較好的應(yīng)用前景。

噬菌體展示單鏈抗體將抗體可變區(qū)基因片段插入到噬菌體外殼蛋白基因中，表達的抗體可變區(qū)與噬菌體外殼蛋白融合并展示于噬菌體表面，從而實現(xiàn)了抗體基因表現(xiàn)型和基因型的連接。通過對目的抗原的淘選，從抗體庫中篩選出識別目的抗原的抗體，獲得的抗體基因可以用于進一步改造。

膜蛋白表達成本較高，常規(guī)的抗體制備方法，無論是單克隆抗體還是多克隆抗體，均需要制備大量的膜蛋白用于免疫和檢測。用噬菌體展示的抗體庫的篩選方法，只需要少量的抗原就可以完成篩選和檢測。同時，由于膜蛋白本身結(jié)構(gòu)的復雜性，外源表達的膜蛋白在構(gòu)象上并不能完全模擬細胞表面的膜蛋白，導致用外源蛋白免疫的方法制備的抗體不能很好識別細胞表達的膜蛋白。用細胞直接作為抗原免疫小鼠后，小鼠的免疫系統(tǒng)直接識別細胞表面的膜蛋白，這個天然狀態(tài)的膜蛋白誘導產(chǎn)生的抗體能更好地識別膜蛋白。結(jié)合噬菌體展示抗體庫可以高通量篩選的優(yōu)點，可以細胞免疫后的抗體庫中快速篩選出識別膜蛋白的抗體。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一，為此，本發(fā)明的一個目的在于提供了一對真核表達載體的構(gòu)建技術(shù)，旨在完整表達能夠識別CD14蛋白的嵌合抗體。

需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一對能夠完整表達出完整的可識別CD14蛋白的嵌合抗體的真核表達載體，包括以下步驟：

1.獲取CD14抗體重鏈及輕鏈可變區(qū)序列：

利用PBMC細胞免疫小鼠后，提取脾臟mRNA，設(shè)計特異性引物擴增重鏈和輕鏈可變區(qū)，構(gòu)建抗體可變區(qū)文庫，篩選抗體噬菌體文庫，得到重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因。

2.構(gòu)建重鏈真核表達載體：

設(shè)計引物用于PCR擴增重鏈可變區(qū)，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI酶切位點分別對回收的PCR產(chǎn)物和pFUSEss-CHIg-hG1空載體進行37℃雙酶切過夜，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析回收純化后，在T4DNA連接酶作用下16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化液涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜，次日隨機挑取8個平板上單克隆菌落進行菌落PCR，篩選陽性單克隆菌落擴增提取質(zhì)粒，進一步對質(zhì)粒進行雙酶切及測序鑒定。

3.構(gòu)建輕鏈真核表達載體：

設(shè)計引物用于PCR擴增輕鏈可變區(qū)，用限制性內(nèi)切酶AgeI和NcoI酶切位點分別對回收的PCR產(chǎn)物和pFUSE2ss-CLIg-hk空載體進行37℃雙酶切過夜，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析回收純化后，在T4DNA連接酶作用下16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化液涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜，次日隨機挑取8個平板上單克隆菌落進行菌落PCR，篩選陽性單克隆菌落擴增提取質(zhì)粒，進一步對質(zhì)粒進行雙酶切及測序鑒定。

4.共轉(zhuǎn)染293T細胞表達CD14抗體:

將獲得的兩種載體通過PEI轉(zhuǎn)染293T細胞，獲得含有重鏈和輕鏈的細胞株，通過抗生素篩選含有兩種質(zhì)粒的細胞株，培養(yǎng)細胞株，得到嵌合抗體。

5.嵌合抗體的純化

1)取親和層析柱，水洗10倍柱床體積；

2)用10倍柱床體積乙酸鈉緩沖液洗滌層析株；

3)取細胞培養(yǎng)液，4℃12000rpm離心10min,收集上清，用0.45μm的濾膜過濾；

4)取5mL細胞培養(yǎng)基上清與等量的乙酸鈉緩沖液混合；

5)以0.5mL/min的速度上樣，收集穿透；

6)上樣結(jié)束后，繼續(xù)以乙酸鈉緩沖沖洗至G250檢測無色；

7)用冰乙酸洗脫緩沖沖洗柱床，搜集洗脫峰；

8)迅速用飽和碳酸鈉調(diào)洗脫峰pH至中性；

9)若上樣體積較大，邊洗脫邊加飽和碳酸氫鈉；

10)用10倍體積的超純水洗滌1層析柱；

11)用10mL NaCl-疊氮鈉緩沖封閉層析柱，置于4℃?zhèn)溆茫?/p>

12)將洗脫峰超濾濃縮到血清等體積，裝入透析袋。

13)置于5L PBS中4℃透析過夜；

14)次日換液一次(5L PBS)；

15)6h后取出樣品，4℃,12000rpm離心10min，收集上清，置于4℃暫存；

16)取出4μL抗體，用SDS-PAGE檢測抗體的純化。

17)用Nanodrop測定抗體的濃度。

6.嵌合抗體的Western blot檢測

1)樣品制備，取THP-1細胞，去掉培養(yǎng)基后用PBS進行清洗，按106加入500μL上述RIPA蛋白抽提液裂解細胞，取上清。

2)取勻漿液加入等體積2×上樣緩沖液混勻，煮沸8min后上樣，進行10％SDS-PAGE電泳分離蛋白，恒定電壓140伏，電泳至溴酚藍染料快到玻璃板邊緣時；

3)將變性分離蛋白條帶電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC膜，美國Millipore產(chǎn)品)上，恒定電流100毫安，持續(xù)時間1h；

4)取出NC膜，用4％PBSM封閉1h，PBS洗三次后，加入用4％PBSM稀釋100倍后的本發(fā)明的可溶性單鏈抗體P1A8溶液，37℃保溫孵育1h；

5)BST和PBS分別洗膜三次，10min/次，加入PBSM稀釋(1:5000)的HRP/E tag conjugate抗體，37℃保溫孵育1h；

6)PBST和PBS分別洗膜三次，10min/次，加入超敏ECL化學發(fā)光底物，顯色拍照。

結(jié)果如圖1所示，本發(fā)明的P1A8抗體可以從THP-1細胞裂解液中特異性識別CD14蛋白。

7.嵌合抗體的免疫熒光檢測

1)使用交聯(lián)劑，4％預(yù)冷的多聚甲醛覆蓋細胞，室溫固定15min，避光；

2)吸去多聚甲醛后，用PBS洗4遍，每次3min。

3)10％正常非免疫山羊血清(PBS稀釋)室溫封閉30min。

4)配制一抗：用5％正常山羊血清稀釋一抗(P1A8)，至終濃度為0.1μg/μL；

5)加入一抗液覆蓋細胞，4℃孵育過夜，避光。

6)取出細胞復溫至室溫，用PBS洗4遍，每次3min；

7)配制熒光標記二抗：用5％正常山羊血清稀釋二抗，稀釋比例為1:300；

8)加入二抗，室溫孵育45min(避光)；

9)吸去多余二抗，PBS洗4遍，每次3min。

10)配制DAPI液：用PBS稀釋DAPI原液，稀釋比例為1:100；

11)加入DAPI染液覆蓋細胞，染色1min。

結(jié)果如圖2所示，本發(fā)明的P1A8抗體可以檢測HepG2細胞細胞表面的CD14蛋白。

本發(fā)明采用了分子生物學和基因工程的辦法，構(gòu)建了CD14嵌合抗體基因的真核表達載體，通過誘導表達，親和層析，獲得了純化的嵌合抗體。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。

附圖說明

圖1 CD14嵌合抗體的Western blot驗證

圖2 嵌合抗體IF驗證

具體實施方式

下面詳細描述本發(fā)明的實施例。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。

實施例一

1.獲取CD14抗體重鏈及輕鏈可變區(qū)序列

利用PBMC細胞免疫小鼠后，提取脾臟mRNA，設(shè)計特異性引物擴增重鏈和輕鏈可變區(qū)，構(gòu)建抗體可變區(qū)文庫，篩選抗體噬菌體文庫，得到重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因，重鏈可變區(qū)DNA序列如SEQ ID NO:1所示，輕鏈可變區(qū)DNA序列如SEQ ID NO:2所示。序列。主要步驟如下：(1)動物免疫及脾細胞總RNA提取以PBMC為免疫原免疫小鼠三次，在取小鼠脾臟前3天加強免疫一次。測定抗血清效價，取效價高的小鼠，取脾組織提取總RNA；(2)反轉(zhuǎn)錄得到抗體的cDNA；(3)根據(jù)抗體可變區(qū)兩端的保守序列設(shè)計特異性引物，引物序列見表1.分別以引物VH對和引物VL對擴增重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，反應(yīng)條件如下:94℃預(yù)變性5min,94℃45s,58℃1min,72℃45s,共進行30個循環(huán),72℃延伸10min。在設(shè)計引物時分別在重鏈可變區(qū)的下游引物序列和輕鏈可變區(qū)的上游引物序列引入linker序列，linker是重復三次排列組合的4個甘氨酸和1個絲氨酸((Gly4Ser)3)的15肽序列對應(yīng)的45bp的基因序列，詳見引物序列(該處缺少)；在重鏈可變區(qū)的上游和輕鏈可變區(qū)下游的引入酶切位點SfiⅠ和NotⅠ酶切位點；(4)全長單鏈抗體(scFv)基因的組裝以linker序列為接頭，通過SOE-PCR將重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的片段連接起來，PCR程序如下:首先在常規(guī)PCR反應(yīng)體系(50μL)中加入等摩爾VL、VH基因,94℃預(yù)變性5min,94℃45s,68℃1min,72℃45s,共進行10個循環(huán),72℃延伸10min；以此產(chǎn)物為模板,以引物scFv for和scFv back進行二次PCR,94℃預(yù)變性5min,94℃45s,60℃1min,72℃45s,共進行30個循環(huán),最后72℃延伸10min，得到單鏈抗體的ScFV片段；(5)噬菌體單鏈抗體表面展示文庫的構(gòu)建分別對scFv基因和pCAN TAB5E噬菌粒載體進行Sfi Ⅰ、Not Ⅰ雙酶切并連接,轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細胞并涂板,37℃過夜培養(yǎng)后進行菌落計數(shù),估算庫容量；將剩余轉(zhuǎn)化菌液擴大培養(yǎng),加入M13KO7輔助噬菌體37℃靜置感染30min后,離心沉淀菌體細胞,用2×YT-AK培養(yǎng)基重懸,37℃震蕩培養(yǎng)過夜,離心取上清液,加入PEG/NaCl冰浴1h,離心并重懸沉淀,經(jīng)0.45μm濾膜過濾后所得即為初級噬菌體抗體庫；(6)噬菌體單鏈抗體庫的親和富集與免疫篩選將所得初級噬菌體抗體庫加入CD14蛋白包被的免疫管中,37℃靜置孵育1h,洗滌,100mmol/L三乙胺洗脫與抗原吸附的噬菌體,隨后立即加入1mol/L Tris(pH8.5)進行中和,以此感染對數(shù)生長期TG1,經(jīng)培養(yǎng)后收集菌體細胞,再次加入M13KO7輔助噬菌體進行感染,重復上述富集程序3次,挑取單菌落擴大培養(yǎng),進行菌液PCR鑒定和單克隆Phage-ELISA鑒定。鑒定正確的菌液進行測序。得到重鏈和輕鏈可變區(qū)的序列。

注:＊V H for中含S fi Ⅰ酶切位點,VL back中含Not Ⅰ酶切位點；VH back及VL for中下劃線部分為(Gly4Ser)3序列；序列中簡并堿基符號為W＝A/T；S＝G/C；M＝A/C；R＝A/G。

2.分別構(gòu)建重鏈輕鏈真核表達載體(使用pFUSE2載體)分別設(shè)計用于擴增重鏈可變區(qū)，引入一對特異性引物，上游引物為，如SEQ ID NO:15所示

引物序列為：

5’-CTTGGAATTCGAGGTGAAGCTCAAGGAGTCT-3’；

下游引物為，如SEQ ID NO:16所示

引物序列為：

5’-GAATCTCGAGTGTCGACACGGTGACCGTGG-3’；

(下劃線分別為EcoRI和XhoI酶切位點)。以篩選出來的抗體基因作為模板，用上述引物及Pfu DNA聚合酶進行PCR擴增，反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性2min、94℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s，共35個循環(huán)，最后72℃終延伸5min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分析回收純化。

真核表達載體pFUSE2/CD14重鏈的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI酶切位點分別對回收的PCR產(chǎn)物和pFUSEss-CHIg-hG1空載體進行37℃雙酶切過夜，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析回收純化后，在T4DNA連接酶作用下16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化液涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜，次日隨機挑取8個平板上單克隆菌落進行菌落PCR，篩選陽性單克隆菌落擴增提取質(zhì)粒，進一步對質(zhì)粒進行雙酶切及測序鑒定。

設(shè)計用于擴增輕鏈可變區(qū)的上下游引物，

上游引物為，如SEQ ID NO:17所示

引物序列為：

5’-CGTCACCGGTGACGTCGTGATGACCCAGTCT-3’；

下游引物為，如SEQ ID NO:18所示

引物序列為：

5’-AATTCCATGGGCGCTTGATTTCCAGCTTGG-3’；

(下劃線分別為AgeI和NcoI酶切位點)。以篩選出來的抗體基因作為模板，用上述引物及Pfu DNA聚合酶進行PCR擴增，反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性2min、94℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s，共35個循環(huán)，最后72℃終延伸5min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分析回收純化。

真核表達載體pFUSE2/CD14輕鏈的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶AgeI和NcoI酶切位點分別對回收的PCR產(chǎn)物和pFUSE2ss-CLIg-hk空載體進行37℃雙酶切過夜，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析回收純化后，在T4DNA連接酶作用下16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化液涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜，次日隨機挑取8個平板上單克隆菌落進行菌落PCR，篩選陽性單克隆菌落擴增提取質(zhì)粒，進一步對質(zhì)粒進行雙酶切及測序鑒定。

3.共轉(zhuǎn)染293T細胞表達CD14抗體

將獲得的兩種載體通過PEI轉(zhuǎn)染293T細胞，獲得含有重鏈和輕鏈的細胞株，通過抗生素篩選含有兩種質(zhì)粒的細胞株，培養(yǎng)細胞株，得到抗體，主要步驟如下：.采用堿裂解法提取pFUSEss_CHIg重鏈表達質(zhì)粒和pFUSE2ss_CLIg輕鏈表達質(zhì)粒，兩種質(zhì)粒等比例混合后進行.細胞轉(zhuǎn)染與抗體表達。

1)轉(zhuǎn)染前細胞傳代2次以上，大于活率95％，轉(zhuǎn)染前一天將細胞傳代，保證第二天的細胞匯合度達到80％-85％；

2)轉(zhuǎn)染當天細胞換培養(yǎng)體積一半的新鮮培養(yǎng)基(無添加)，準備好DNA稀釋液和PEI稀釋液；

3)將DNA稀釋液和PEI稀釋液混合，靜置5min后加入293T細胞中；

4)放于37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5)轉(zhuǎn)染24h后補充一半體積的完全培養(yǎng)基；

6)轉(zhuǎn)染48h可以取樣檢測抗體是否表達；

7)根據(jù)檢測情況確定收樣時間。

4.嵌合抗體純化

1)取親和層析柱，水洗10倍柱床體積；

2)用10倍柱床體積乙酸鈉緩沖液洗滌層析株；

3)取細胞培養(yǎng)液，4℃12000rpm離心10min,收集上清，用0.45μm的濾膜過濾；

4)取5mL細胞培養(yǎng)基上清與等量的乙酸鈉緩沖液混合；

5)以0.5mL/min的速度上樣，收集穿透；

6)上樣結(jié)束后，繼續(xù)以乙酸鈉緩沖沖洗至G250檢測無色；

7)用冰乙酸洗脫緩沖沖洗柱床，搜集洗脫峰；

8)迅速用飽和碳酸鈉調(diào)洗脫峰pH至中性；

9)若上樣體積較大，邊洗脫邊加飽和碳酸氫鈉；

10)用10倍體積的超純水洗滌1層析柱；

11)用10mL NaCl-疊氮鈉緩沖封閉層析柱，置于4℃?zhèn)溆茫?/p>

12)將洗脫峰超濾濃縮到血清等體積，裝入透析袋；

13)置于5L PBS中4℃透析過夜；

14)次日換液一次(5L PBS)；

15)6h后取出樣品，4℃,12000rpm離心10min，收集上清，置于4℃暫存；

16)取出4μL抗體，用SDS-PAGE檢測抗體的純化；

17)用Nanodrop測定抗體的濃度。

5.用Western blot方法檢測本發(fā)明的篩選出來的抗體P1A8，其方法按下列步驟進行：

1)樣品制備，取THP-1細胞，去掉培養(yǎng)基后用PBS進行清洗，按106加入500μL上述RIPA蛋白抽提液裂解細胞，取上清；

2)取勻漿液加入等體積2×上樣緩沖液混勻，煮沸8min后上樣，進行10％SDS-PAGE電泳分離蛋白，恒定電壓140伏，電泳至溴酚藍染料快到玻璃板邊緣時；

3)將變性分離蛋白條帶電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC膜，美國Millipore產(chǎn)品)上，恒定電流100毫安，持續(xù)時間1h；

4)取出NC膜，用4％PBSM封閉1h，PBS洗三次后，加入用4％PBSM稀釋100倍后的本發(fā)明的可溶性單鏈抗體P1A8溶液，37℃保溫孵育1h；

5)BST和PBS分別洗膜三次，10min/次，加入PBSM稀釋(1:5000)的HRP/E tag conjugate抗體，37℃保溫孵育1h；

6)PBST和PBS分別洗膜三次，10min/次，加入超敏ECL化學發(fā)光底物，顯色拍照；

結(jié)果如圖1所示，本發(fā)明的P1A8抗體可以從THP-1細胞裂解液中特異性識別CD14蛋白。

6.用免疫熒光檢測本發(fā)明篩選出來的抗體P1A8，其方法按下列步驟進行：

1)使用交聯(lián)劑，4％預(yù)冷的多聚甲醛覆蓋細胞，室溫固定15min，避光；

2)吸去多聚甲醛后，用PBS洗4遍，每次3min；

3)10％正常非免疫山羊血清(PBS稀釋)室溫封閉30min；

4)配制一抗：用5％正常山羊血清稀釋一抗(P1A8)，至終濃度為0.1μg/μL；

5)加入一抗液覆蓋細胞，4℃孵育過夜，避光；

6)取出細胞復溫至室溫，用PBS洗4遍，每次3min；

7)配制熒光標記二抗：用5％正常山羊血清稀釋二抗，稀釋比例為1:300；

8)加入二抗，室溫孵育45min(避光)；

9)吸去多余二抗，PBS洗4遍，每次3min；

10)配制DAPI液：用PBS稀釋DAPI原液，稀釋比例為1:100；

11)加入DAPI染液覆蓋細胞，染色1min。

結(jié)果如圖2所示，本發(fā)明的P1A8抗體可以檢測HepG2細胞細胞表面的CD14蛋白。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。

<110> 武漢金開瑞生物工程有限公司

<120>一對真核表達載體的制備方法及其應(yīng)用

<130> 2016

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 357

<212> DNA

<213>重鏈可變區(qū)序列

<400> 1

atggcccaga tccagttgct gcagtctgga gctgagctgg taaggcctgg gacttcagtg 60

aagatatcct gcaaggcttc tggctacacc ttcactaact actggctagg ttgggtaaag 120

cagaggcctg gacatggact tgagtggatt ggagatattt accctggagg tggttatact 180

aactacaatg agaagttcaa gggcaaggcc acactgactg cagacacatc ctccagcact 240

gcctacatgc agctcagtag cctgacatct gaggactctg ctgtctattt ctgtgcaaga 300

gacgataggt acgactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357

<210> 2

<211> 336

<212> DNA

<213>輕鏈可變區(qū)序列

<400> 2

gacattgtgc tgacccagtc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60

atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 120

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct 180

gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatcctccc 300

acgttcggtg ctgggaccaa gctggaaatc aagcgc 336

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcggcccagc cggccatggc csaggtycag ctkcagcagt ctgga 45

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcggcccagc cggccatggc cgakgtrcag cttcaggagt argga 45

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcggcccagc cggccatggc cgargtgaag ctggtggart ctggr 45

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcggcccagc cggccatggc csaggtccar ctgcagsary ctggr 45

<210> 7

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tccagaaccg ccaccgccgc taccgccgcc acctgmrgag acdgtgasca grgtc 55

<210> 8

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tccagaaccg ccaccgccgc taccgccgcc acctgmrgag acdgtgastg argtt 55

<210> 9

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agcggcggtg gcggttctgg aggcggcggt tctgayatgc agatgacmca gwc 53

<210> 10

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agcggcggtg gcggttctgg aggcggcggt tctramattg tgmtgaccca atc 53

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

actagtcgcg gccgcgtcga cagcmcgttt cagytccary tt 42

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

actagtcgcg gccgcgtcga cagcmcgttt bakytctatc tttgt 45

<210> 13

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgcaattcct ttagttgttc ctttctatgc ggcccagccg gccatggcc 49

<210> 14

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ggttccagcg gatccggata cggcaccgga ctagtcgcgg ccgcgtcgac 50

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cttggaattc gaggtgaagc tcaaggagtc t 31

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gaatctcgag tgtcgacacg gtgaccgtgg 30

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cgtcaccggt gacgtcgtga tgacccagtc t 31

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aattccatgg gcgcttgatt tccagcttgg 30