專利名稱：：測定有機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白活性的方法測定有機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及測定有機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白(OCT)活性的方法，涉及在無細(xì)胞電生理傳感器芯片的幫助下測定調(diào)節(jié)OCT活性的化合物的活性或鑒定所述化合物的方法，所述無細(xì)胞電生理傳感器芯片含有固體支持傳感器電極和脂質(zhì)層，該脂質(zhì)層含有定位于傳感器電極最接近空間附近的OCT,然而傳感器電極相對于所用的溶液和脂質(zhì)層是電絕緣的，還涉及傳感器芯片本身和含有該傳感器芯片的試劑盒。人有機陽離子轉(zhuǎn)運是有機陽離子跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運的重要機制。因此，有機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白(OCT)不僅是直接影響疾病相關(guān)異常的潛在藥物靶標(biāo)，而且是允許潛在藥物生物利用率參數(shù)變化的潛在ADMET(吸附、分配、新陳代謝、排泄和毒性)靶標(biāo)。OCT屬于包括單向轉(zhuǎn)運蛋白、同向轉(zhuǎn)運蛋白和反向轉(zhuǎn)運蛋白的超家族，如廣譜抗藥蛋白、易化擴散系統(tǒng)和質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運蛋白。它們不依賴鈉和質(zhì)子梯度來介導(dǎo)具有不同分子結(jié)構(gòu)的小陽離子的轉(zhuǎn)運。通過人()CT(hOCT)的底物特異的、不依賴鈉的轉(zhuǎn)運機制已經(jīng)在肝、腎、小腸和神經(jīng)系統(tǒng)中有所描述(PritchardJB&MillerDS(1993)，Physiol.Rev.73(4)765-796)。在1997年已克隆到了人有機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白hOCTl(Zhang，L.等人(1997)Mol.Pharmacology51(6)，913-921)。當(dāng)經(jīng)過它的轉(zhuǎn)運循環(huán)時，OCT變換電荷。該變換可能起源于帶電底物的運動或攜帶(部分)電荷蛋白質(zhì)部分的運動?？梢酝ㄟ^radiofluxes和標(biāo)準(zhǔn)的雙電極電壓鉗電生理學(xué)來監(jiān)測OCT的活性，任一方法的常見缺點如時間分辨率差、靈敏度低、阻斷劑和竟?fàn)幍孜镩g難分辨、假陽性和假陰性等等(Arndt等人(2001)AmJPhysiolRenalPhysiol,281，F(xiàn)454-F468)。在某些其它情況下，轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)的電流可以在生理環(huán)境中通過膜片鉗實驗或在人工"黑脂質(zhì)膜"中直接監(jiān)測。在后一種情況下，脂雙層在兩個緩沖儲存器間的小孔中形成，每個緩沖儲存器包含Ag/AgCl電極。蛋白質(zhì)#^進(jìn)雙分子層后，可以例如通過ATP衍生物的光激活來觸發(fā)生物活性(例如酶活性)。然而，由于它缺乏穩(wěn)定性，利用該體系不能進(jìn)行快速的緩沖液交換實驗，而將所述體系限制在光活化底物上?？梢酝ㄟ^將含蛋白質(zhì)的顆粒固定在傳感器表面或傳感器芯片上來克服穩(wěn)定性的缺乏。無細(xì)胞電生理傳感器芯片通?；诤D(zhuǎn)運蛋白的膜碎片或小泡產(chǎn)生，該膜碎片或小泡通常電偶聯(lián)到鍍金生物芯片上。膜碎片通常吸附到傳感器芯片表面，所述表面在薄金膜上優(yōu)選具有修飾的脂質(zhì)層。膜碎片通常形成能夠維持跨膜離子梯度的腔。用合適的底物激活后，離子或帶電底物被跨膜轉(zhuǎn)運。因為吸附的膜碎片和覆蓋的電極表面行為像電容器，如果將參比電極置于周圍溶液中，那么運動中的離子代表可檢測的變化電流。本發(fā)明的問題涉及雖然hOCTl的膜片鉗實驗失敗了，但是用此類傳感器芯片能否特異地并靈敏地檢測到OCT活性的問題。令人驚奇的是，已發(fā)現(xiàn)可以建立無細(xì)胞測定，其顯示出需要的靈敏度以便OCT激活時檢測特異信號。尤其令人驚奇的是因為OCT在沒有細(xì)胞背景，即無細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)、細(xì)胞骨架等的情況下可以在本發(fā)明無細(xì)胞測定中起作用。尤其是，本發(fā)明的測定法可以在具有獨特優(yōu)勢的寬pH和/或高離子濃度范圍內(nèi)進(jìn)行。因此，本發(fā)明的第一個實施方案涉及測定OCT活性的方法，包括以下連續(xù)步驟(a)提供含有固體支持傳感器電極和脂質(zhì)層的無細(xì)胞電生理傳感器芯片，其中所述脂質(zhì)層含有位于傳感器電極最接近空間附近的OCT，而所述傳感器電極相對于所用的溶液和脂質(zhì)層是電絕緣的，(b)用含離子的非活化溶液處理傳感器芯片，(c)用含離子和底物的活化溶液處理傳感器芯片，并(d)測定電信號。OCT例如選自SLC22A1(OCTl)、SLC22A2(OCT2)、SLC22A3(OCT3)、SLC22A4(OCTNl)和SLC22A5(OCTN2)。通常它是哺乳動物來源，尤其是來自大鼠、小鼠、兔、豬、豚鼠、黑腹果蠅、秀麗隱桿線蟲或人。優(yōu)選地它是人OCTl。電極通常包含金屬材料或?qū)щ娊饘傺趸?，尤其是金、鉑、銀或銦錫氧化物。固體支持的傳感器電極通常是玻璃或聚合物支持的傳感器電極，尤其是浮法硼硅玻璃(borofloat)支持的傳感器電極，尤其是浮法硼硅玻璃支持的金電極。在優(yōu)選的實施方案中，脂質(zhì)層通過化學(xué)鍵，尤其通過組氨酸標(biāo)簽偶聯(lián)或鏈霉抗生物素蛋白-生物素偶聯(lián)，或通過疏水、親水或離子力附著到電極上。電極還是電絕緣的，例如，通過一個或更多絕緣單層，尤其通過一個或更多絕緣的兩親性有機化合物，更尤其是通過一個或更多絕緣的膜單層，最尤其是通過硫醇層，特別是十八烷基硫醇(octadecylthiol)作為面向電極的下層，并且膜單層作為遠(yuǎn)離電極的上層進(jìn)行電絕緣。傳感器芯片尤其包含固相支持體，該固相支持體攜帶傳感器電極和帶孔的蓋板，形成與滴定平板的那些孔相似的孔。玻璃或聚合物平板用作合適的支持體。在玻璃支持體，例如，玻璃平板的情況下，電極優(yōu)選包含薄的平版印刷結(jié)構(gòu)的金膜，在其表面已經(jīng)例如通過硫醇化學(xué)修飾過，然而對于聚合物支持體，也可以使用被修飾的厚膜金電極。由于合適底物的范圍，可以制造單傳感器芯片及傳感器帶或甚至具有96或384個傳感器的傳感器陣列板。特別是基于聚合物的傳感器具有低成本大量生產(chǎn)的潛力。通常對于所有的傳感器類型，在已進(jìn)行表面修飾并用水溶液將孔填滿后，金表面變成電容器?？梢酝ㄟ^帶電的參比電極如Pt/Pt或Ag/AgCl、氧化銦錫或其它與溶液接觸的電極來測定該電容器的性質(zhì)。此外，傳感器表面優(yōu)選為非常親水的，即對膜碎片和小泡是粘性的。因此，保持在它天然或類似天然的環(huán)境中，例如在生物膜片、小泡或蛋白脂質(zhì)體中的OCT容易吸附到親水傳感器表面上，形成區(qū)室，該區(qū)室的內(nèi)部空間和它的溶液與金表面及孔內(nèi)周圍溶液電絕緣。如果插入到小杯中，芯片的孔確定流動室的內(nèi)水體積，4吏得能夠在傳感器表面上進(jìn)行快速的溶液交換。用于本發(fā)明的無細(xì)胞電生理傳感器芯片例如在WO02/074983中有所描述，尤其是在權(quán)利要求和/或圖1和/或2(包括所述PCT申請的附圖描述)中，將其引入本文作為參考，除非在本發(fā)明中另作說明。也可從IonGateBiosciencesGmbH,Frankfurt/Main，德國獲得(以SURFE2RONE生物傳感器系統(tǒng)名稱出售)。溶液，可誘導(dǎo)電才及的可測量瞬時充電電流，其范圍通常在100pA到4nA間。因此，用活化溶液即含底物的溶液替換非活化溶液將觸發(fā)OCT的活性。隨后反向替換溶液可將傳感器芯片恢復(fù)到它的初始狀態(tài)。根據(jù)本發(fā)明，含離子溶液的獨特優(yōu)勢在于將假象減到最小，導(dǎo)致特異且靈敏的信號。可以在PC或另外在受控工作站中調(diào)整進(jìn)行溶液交換實驗所必需的所有組分。在常規(guī)體系中，非活化(即不含底物)溶液和活化溶液通常保存在玻璃瓶中。通常應(yīng)用于瓶子的氣壓推動溶液通過電機操作的閥系統(tǒng)并通過流動室?；蛘撸梢允褂米詣舆M(jìn)樣器以自動模式處理幾種溶液。在使用傳感器芯片前，優(yōu)選用含離子的洗滌溶液洗滌電極。在任何情況下，本發(fā)明的含離子溶液優(yōu)選包含選自Na+、K+、Mg"和/或Ca^的單價和二價離子。含離子溶液中離子的總濃度優(yōu)選為從約100mM到約1000mM，尤其是/人約200mM到約500mM，更尤其是從約300mM到約500mM，最尤其是約435mM。含離子溶液中單價離子的濃度優(yōu)選為從約300mM到約400mM，并且含離子溶液中二價離子的濃度優(yōu)選為從約2mM到約10mM，尤其是從約5mM到約8mM，更尤其是約5mM。在另一優(yōu)選的實施方案中，含離子溶液還包含緩沖液，尤其是HEPES/NMG，30士10mM，pH7.0±1.0緩沖液。含離子溶液的實例為:(a)洗滌溶液30土10mM的緩沖液，例如HEPES/NMG，pH7.0±1.0，300士100mM的單價離子，例如NaCl，4±2mM的二Y介離子，例如MgCh。(b)非活化溶液30士10mM的緩沖液，例如HEPES/NMG，pH7.0±1.0，300±100mM的單價離子，例如NaCl，4士2mM的二價離子，例如MgCh,和0.5-100mM的單價離子，例如NaCl，其應(yīng)該與活化溶液中底物的濃度等摩爾。(c)活化溶液30士10mM的緩沖液，例如HEPES/NMG，pH7.0±1.0，300±100mM的單價離子，例如NaCl，4土2mM的二價離子，例如MgCl2，和0.5-100mM的底物，例如氯化膽堿?；罨芤旱牡孜锿ǔＪ怯袡C陽離子，尤其是陽離子藥物、陽離子異生素和/或陽離子維生素，更尤其是伯胺、仲胺、叔胺或季胺，最尤其是膽堿、乙酰膽堿、煙堿、N、曱基煙酰胺、嗎啡、l-甲基-4-苯基吡啶錯、普魯卡因酰胺、四乙銨、三丁基曱基銨、異奮胍或生物胺如腎上腺素、去甲腎上腺素(norpeinephrine)，或肉堿，或親脂化合物如奎寧、奎尼丁，或類固醇如皮質(zhì)酮，或有機陰離子如對氨基馬尿酸、丙磺舒。通常，使用電流和/或電勢測定法測定電信號，并且將步驟(b)到(d)進(jìn)行至少2次，尤其進(jìn)行2到4次。該發(fā)明的上下文中，術(shù)語"電信號"或"電流"將指響應(yīng)活化溶液替換非活化溶液的峰電流，包括但不局限于最大峰電流。電流振幅通常在IO到100ms內(nèi)上升，接著在約2秒內(nèi)較慢的衰減。電流的極性可以是正的或負(fù)的，取決于運輸?shù)碾x子的極性和/或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移部分的極性及它們跨區(qū)室膜或在區(qū)室膜內(nèi)的轉(zhuǎn)運或轉(zhuǎn)移的矢量方向。對于OCT活性的測定，通常不考慮由非活化溶液替換活化溶液引起的電流或由洗滌溶液替換非活化溶液引起的電流。優(yōu)選選擇流速和間隔，使得響應(yīng)活化溶液替換非活化溶液的電流不受其它替換步驟引起的電流響應(yīng)的影響而保持不偏倚。本發(fā)明的方法也可以在化合物，尤其是OCT的刺激劑(活化劑)或抑制劑的存在下進(jìn)行。因此，本發(fā)明也涉及鑒定調(diào)節(jié)OCT活性的化合物的方法，包括以下連續(xù)步驟(a)進(jìn)行本發(fā)明的方法，并(b)鑒定所迷化合物。所述化合物通常為有機陽離子，尤其是陽離子藥物、陽離子異生素和/或陽離子維生素和/或生物胺，更尤其是伯胺、仲胺、叔胺或季胺，其中化合物通常是OCT的刺激劑或抑制劑。化合物例如可存在于化合物文庫中。本發(fā)明的另一主題是含有OCT的無細(xì)胞電生理傳感器芯片本身，如上詳細(xì)描述。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所知的方法和/或如實施例中特別描述的方法將OCT結(jié)合到傳感器芯片上。傳感器芯片還包含用于從電極獲取測量數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)獲取裝置，和任選地使交換和/或混合含離子溶液可行的交換和/或混合手段。傳感器芯片也可以是微量培養(yǎng)板或微量滴定板的形式。本發(fā)明的另一主題是裝置，其包含本發(fā)明傳感器芯片、參比電極、用于從電極獲取測量數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)獲取裝置、用于使交換和/或混合含離子溶液可行的交換和/或混合手段、流動分析裝置、電源、計算機和自動進(jìn)樣器。參比電極優(yōu)選為Pt/Pt、Ag/AgCl或氧化銦錫電極。本發(fā)明的另一主題是試劑盒，該試劑盒含有(a)本發(fā)明無細(xì)胞電生理傳感器芯片或本發(fā)明裝置，(b)至少一種如上定義的含離子溶液，和任選地(c)如上定義的底物。以下圖、表、序列和實施例將在不限制本發(fā)明范圍的情況下解釋本發(fā)明。圖1A顯示的是加入活化溶液(30mM氯化膽堿)，用1mMTBA抑制前(黑色描記線)和后(灰色描記線)，具有固定膜(攜帶rOCT2(slc22a2))的典型傳感器的電響應(yīng)。圖1B顯示的是加入活化溶液(30mM氯化膽堿)，用1mMTBA抑制前(黑色描記線)和后(灰色描記線)，具有固定膜(攜帶hOCT2(SLC22A1))的典型傳感器的電響應(yīng)。圖2A顯示的是rOCT2(slc22a2)(CHO細(xì)胞膜)的膽堿濃度依賴性。圖2B顯示的是hOCT2(SLC22A1)(CHO細(xì)胞膜)的膽堿濃度依賴性。圖3顯示的是來自昆蟲細(xì)胞的rOCT2(slc22a2)和hOCT2(SLC22A2)的pH依賴性。圖4A顯示的是rOCT2(slc22a2)(CHO細(xì)胞)的TBA的IC50。使用10mM膽堿作為底物來測定IC50。圖4B顯示的是hOCT2(SLC22A2)(CHO細(xì)胞)的TBA的IC50。使用30mM膽堿作為底物來測定IC50。圖5A顯示的是在膜片鉗實驗中穩(wěn)定表達(dá)的rOCT2(slc22a2)的電流(CHO細(xì)胞)。圖5B顯示的是在膜片鉗實驗中穩(wěn)定表達(dá)的hOCT2(slc22a2)的電流(CHO細(xì)胞)。圖6A顯示的是rOCT2(slc22a2)(CHO細(xì)胞)的套寧的IC50。使用10mM膽堿作為底物來測定IC50。圖6B顯示的是rOCT2(slc22a2)(CHO細(xì)胞)的乙酰膽堿濃度依賴性。圖7顯示的是含有人OCT2(hOCT2，SLC22A2)編碼區(qū)的核紗列。基因的起始(ATG)和終止(TAA)位點為粗體并標(biāo)有下劃線。Xhol/Xhol(CTCGAG)克隆位點標(biāo)有下劃線。圖8顯示的是含有大鼠OCT2(rOCT2;slc22a2)編碼區(qū)的核酸序列。基因的起始(ATG)和終止(TAA)位點為粗體并標(biāo)有下劃線。Kpnl(GGTACC)和BamHI(GGATCC)克隆位點標(biāo)有下劃線。圖9顯示的是含有人OCTl(hOCTl;SLC22A1)編碼區(qū)的核絲列。基因的起始(ATG)和終止(TAA)位點為粗體并標(biāo)有下劃線。HINDIII(AAGCTT)和EcoRV(GATATC)克隆位點標(biāo)有下劃線。圖10顯示的是含有人OCT3(hOCT3;SLC22A3)編碼區(qū)的核絲列?；虻钠鹗?ATG)和終止(TAG)位點為粗體并標(biāo)有下劃線。圖11顯示的是含有人OCTNl(SLC22A4)編碼區(qū)的核酸序列?；虻钠鹗?ATG)和終止(TGA)位點為粗體并標(biāo)有下劃線。圖12顯示的是含有人OCTN2(SLC22A5)編碼區(qū)的核^列?；虻钠鹗?ATG)和終止(TAG)位點為粗體并標(biāo)有下劃線。序列描述SEQIDNO:1顯示的是含有人OCT2(hOCT2;SLC22A2)編碼區(qū)的核酸序列。SEQIDNO:2顯示的是含有大鼠OCT2(rOCT2;slc22a2)編碼區(qū)的核酸序列。SEQIDNO:3顯示的是含有人OCTl(hOCTl;SLC22A3)編碼區(qū)的核酸序列。SEQIDNO:4顯示的是含有人OCT3(hOCT3;SLC22A3)編碼區(qū)的核酸序列。SEQIDNO:5顯示的是含有人OCTNl(SLC22A4)編碼區(qū)的核酸序列。SEQIDNO:6顯示的是含有人OCTN2(SLC22A5)編碼區(qū)的核酸序列。實施例材料洗滌溶液(C):_HEPES/匪GNaClMgCl2非活化溶液(B):HEPES/醒GNaClMgCl2活化溶液(A):HEPES/雇GNaCl氯化膽堿_MgCl2分別在溶液C、B和A中TBA或查寧測定方法(a)膜的制備通過離心從病毒轉(zhuǎn)染的Sf9或HighFive懸浮細(xì)胞系或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的貼壁CHO細(xì)胞系中收集細(xì)胞后，將約2g濕重細(xì)胞的等分試樣在液氮中快速冷凍并儲存于-80。C用于進(jìn)一步的制備。將細(xì)胞沉淀在水上融化并將其轉(zhuǎn)移到冰預(yù)冷的緩沖液中(0.25M蔗糖，5mMTrispH7.5，2mMDTT，每50ml含一種完整的蛋白酶抑制劑混合物片劑(RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim，德國))。通過細(xì)胞破裂制備膜碎片。利用ParrCellDisruptionBomb(ParrInstrumentCompany,Illinois,美國)通過氮細(xì)月包石皮碎方法或利用Dounce30mM,pH7.4300mM5mM30mM,pH7.4400mM5mM30mM，pH7.4300mM100mM5mMHomogenisator(7ml，來自NovodirectGmbH,Kehl/Rhein，德國)通過I)ounce勻漿方法對細(xì)胞進(jìn)行勻漿，并在4。C和680g下將懸浮液離心10分鐘，在4。C和6100g下將懸浮液離心10分鐘。收集上清液并在SW41甩平式轉(zhuǎn)頭中于4°C和100，000g下再次離心1小時。在約2ml的5mMTrispH7.5中將沉淀懸浮。用87。/。的蔗糖(在5mMTris中)將懸浮液調(diào)整到56%。然后在底部以2ml的56%級分，接著是3ml45。/。蔗糖、3ml35%和2ml9%蔗糖開始建立蔗糖梯度。在4。C和100000g下再次離心2.5小時(或甚至更多)，用巴氏吸管小心吸取梯度帶并將其收集在含5ml300mMNaCl、5mMMgCl2、30mMH印espH7.5或10mMTris/HClpH7.5的新管中。接著是另一離心步驟在150000g，4。C下l小時。將得到的沉淀在300mMNaCl、5mMMgCl2、2mMDTT、30mMHepespH7.5、10。/。甘油中重懸浮。(b)生物傳感器的制備根據(jù)以下方案制備生物傳感器。1.向生物傳感器加入30jLtl硫醇溶液(異丙醇中含2%的硫醇)2.溫育時間15分鐘3.用3x70jal異丙醇沖洗4.真空干燥生物傳感器5.干燥時間30分鐘6.加入2pl脂質(zhì)(溶解在800單位正癸烷中的60單位(重量)2-二植烷酰-811-甘油-3-磷酸膽堿+1單位十八胺)7.立即加入30|nlDTT緩沖液(1,542mgDTT/50ml緩沖液C)8.溫育時間20分鐘9.加入20pi膜制劑+135JillDTT緩沖液C并混合(6個生物傳感器)10.超聲處理2x10次(設(shè)置0.5秒/30%),在冰上停頓30秒11.從生物傳感器去除緩沖液12.立即向生物傳感器加入25pl膜溶液(混合3次)13.在冰箱中儲存過夜(在高濕度培養(yǎng)亞中)(c)溶液交換方案對于它的活性的測定，連續(xù)用洗滌、非活化和活化溶液處理OCT蛋白質(zhì)并當(dāng)從充電改變?yōu)榛罨幚頃r，測定電流。用活化溶液(含底物的溶液)替換洗滌和非活化溶液觸發(fā)OCT的活性。隨后反向替換溶液將傳感器芯片恢復(fù)到它的初始狀態(tài)。循環(huán)1:<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>1分鐘中斷循環(huán)2:<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>5分鐘中斷并加入待分析的化合物以下設(shè)置用于hOCT2的測定:循環(huán)3:<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>5分鐘中斷并以另一濃度加入相同的化合物或加入另一化合物，等等。用"活化"緩沖液和"非活化"緩沖液填滿生物傳感器體系的緩沖液容器A、B和C后，將模型(dummy)裝到傳感器固定器上并用所有的緩沖液沖洗體系以從整個流體系統(tǒng)中去除氣泡。然后用標(biāo)準(zhǔn)的基于玻璃的傳感器替換空傳感器或盲(blind)傳感器，其中用含有hOCT2的CHO膜碎片預(yù)加載所述基于玻璃的傳感器(3mm直徑的化學(xué)修飾的金表面，IonGateBiosciencesGmbH,Frankfurt/M.，德國)。通過將氣壓應(yīng)用到緩沖液容器中來完成經(jīng)過流體系統(tǒng)(包括傳感器流動室)的液體轉(zhuǎn)運。測定通常在250毫巴超壓下進(jìn)行，該壓力導(dǎo)致約300ials"的流速。對于它的活性的測定，通過"非活化"和"活化"溶液連續(xù)處理包含OCT蛋白質(zhì)的膜。隨后以相反順序替換溶液將傳感器芯片恢復(fù)到它的初始狀態(tài)。通過控制軟件定義順序(見圖1)，其中"非活化"緩沖液流經(jīng)傳感器表面，接著是"活化"緩沖液和"非活化"緩沖液。在整個順序中，將電流響應(yīng)數(shù)字化(2000樣品s")并保存為數(shù)據(jù)文件。對于劑量反應(yīng)實驗，分別將抑制劑溶解在"非活化，，和"活化，，緩沖液中。所有的化學(xué)試劑為分析級或更高級別。數(shù)據(jù)分析高對照抑制前用100mM氯化膽堿激活后的谷值電流；低對照抑制后用OmM氯化膽堿激活后的谷值電流；結(jié)果由校正的原始數(shù)據(jù)計算而來。轉(zhuǎn)運蛋白的抑制=ioo*(i-(m-:對))結(jié)果1.圖1A和1B顯示的是抑制前(黑色標(biāo)記線)和后(灰色標(biāo)記線)，向傳感器(分別具有包含rOCT2和hOCT2的固定膜)加入含有膽堿的活化溶液后的電響應(yīng)。峰振幅等同于轉(zhuǎn)運蛋白的初始活性；衰減歸因于生物傳感器夾層結(jié)構(gòu)的電容的充電。2.圖2A和2B顯示的是分別在包含rOCT2和hOCT2的膜上膽堿濃度對電響應(yīng)值(高對照)的影響。根據(jù)膽堿濃度滴定法的結(jié)果，在以下試驗中使用100mM的膽堿濃度，因為這允許測定具有高振幅的信號。3.測定的pH依賴性表明在pH7.4時具有最高的蛋白質(zhì)活性，其因此被用于后續(xù)試驗中(圖3)。對于抑制實驗，將膽堿濃度降低至10mM(在檢測竟?fàn)幮砸种苿┬?yīng)的KM值范圍內(nèi))。測定OCT的標(biāo)準(zhǔn)抑制劑(TBA)的ICso分別為3.5nM(對于rOCT2)(圖4A)和2.9jaM(對于hOCT2)(圖4B)。4.通過使用上面定義的參數(shù)比較來自重組細(xì)胞系的不同膜制劑。用CHO細(xì)胞系獲得最佳結(jié)果。昆蟲細(xì)胞制劑產(chǎn)生高品質(zhì)的信號，然而具有減弱趨勢，不適合于ICs。的測定。5.通過人工膜片鉗電生理學(xué)進(jìn)一步監(jiān)測CHO細(xì)胞系，所述人工膜片鉗電生理學(xué)被認(rèn)作離子轉(zhuǎn)運蛋白研究的最佳標(biāo)準(zhǔn)。對于rOCT2，hOCT2的電流幾乎檢測不到，并且不能測定1<:5()值(圖5A和5B)。6.對于信號靈敏度的進(jìn)一步評估，檢測了其他底物和抑制劑。圖6A和6B顯示了這些實例。連同此處凈艮道的對于OCT2其他家族成員，例如hOCTl或hOCT3的測定一起，克隆和產(chǎn)生了構(gòu)建體。利用Invitrogen，sFlpln-和T-REXSystem(目錄號R758-07)產(chǎn)生了細(xì)胞系。權(quán)利要求1.測定有機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白(OCT)活性的方法，所述方法包括連續(xù)步驟a)提供含有固體支持的傳感器電極和脂質(zhì)層的無細(xì)胞電生理傳感器芯片，所述脂質(zhì)層含有位于傳感器電極最接近空間附近的OCT，而所述傳感器電極相對于所用的溶液和所述脂質(zhì)層是電絕緣的，b)用含離子的非活化溶液處理所述傳感器芯片，c)用含離子和底物的活化溶液處理所述傳感器芯片，并d)測定電信號。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述OCT選自O(shè)CT1(SLC22Al)、OCT2(SLC22A2)、OCT3(SLC22A3)、OCTN1(SLC22A4)、OCTN2(SLC22A5)。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述OCT為哺乳動物來源，尤其來自大鼠、小鼠、兔、豬、豚鼠、黑腹果蠅、秀麗隱桿線蟲或人，更尤其是人OCTl(SLC22Al)。4.根據(jù)權(quán)利要求l-3任何一項的方法，其中所述電極包含金屬材料或?qū)щ娊饘傺趸铮绕涫墙?、鉑、銀或銦錫氧化物。5.根據(jù)權(quán)利要求l-4任何一項的方法，其中所述固體支持的傳感器電極是玻璃或聚合物支持的傳感器電極，尤其是浮法硼硅玻璃支持的傳感器電極，更尤其是浮法硼硅玻璃支持的金電極。6.根據(jù)權(quán)利要求l-5任何一項的方法，其中所述脂質(zhì)層通過化學(xué)鍵，尤其通過組氨酸標(biāo)簽偶聯(lián)或鏈霉抗生物素蛋白-生物素偶聯(lián)，或通過疏水、親水或離子力附著在電極上。7.根據(jù)權(quán)利要求l-6任何一項的方法，其中所述電極被一種或更多絕緣單層電絕緣，尤其被一種或更多絕緣的兩親性有機化合物，更尤其被一種或更多絕緣膜單層，最尤其被硫醇層，特別是十八烷基硫醇作為面向電極的下層并且膜單層作為遠(yuǎn)離電極的上層進(jìn)行電絕緣。8.根據(jù)權(quán)利要求l-7任何一項的方法，其中首先用舍離子的洗滌溶液洗滌所述電極。9.根據(jù)權(quán)利要求l-8任何一項的方法，其中所述含離子溶液包含選自Na+、K+、Mg2+和/或Ca2+的單價和二價離子。10.根據(jù)權(quán)利要求l-9任何一項的方法，其中含離子溶液中離子的總濃度為約100mM到約1000mM，尤其是約200mM到約500mM，更尤其是約300mM到約500mM，最尤其是約435mM。11.根據(jù)權(quán)利要求9或10的方法，其中含離子溶液中單價離子的濃度為約300mM到約400mM。12.根據(jù)權(quán)利要求9-11任何一項的方法，其中含離子溶液中二價離子的濃度為約2mM到約10mM，尤其是約5mM到約8mM，更尤其是約5mM。13.根據(jù)權(quán)利要求l-12任何一項的方法，其中所述含離子溶液還包含緩沖液，尤其是HEPES/NMG，30±10mM，pH7.0±1.0緩沖液。14.根據(jù)權(quán)利要求1-13任何一項的方法，其中所述活化溶液的底物為有機陽離子，尤其是陽離子藥物、陽離子異生素和/或陽離子維生素，更尤其是伯胺、仲胺、叔胺或季胺，最尤其是膽堿、乙酰膽堿、煙堿、N'-甲基煙酰胺、嗎啡、l-甲基-4-苯基吡咬錯、普魯卡因酰胺、四乙銨、三丁基甲基銨、異喹胍，或生物胺如腎上腺素、去甲腎上腺素(norpeinephrine),或肉堿，或親脂化合物如查寧、查尼丁，或類固醇如皮質(zhì)酮，或有機陰離子如對氨基馬尿酸、丙磺舒。15.根椐權(quán)利要求1-14任何一項的方法，其中使用電流和/或電勢測定手段測定所述電信號。16.根據(jù)權(quán)利要求l-15任何一項的方法，其中步驟(b)至(d)進(jìn)行至少2次，尤其進(jìn)行2到4次。17.根據(jù)權(quán)利要求1-16任何一項的方法，其中所述方法在化合物，尤其是OCT抑制劑的存在下進(jìn)行。18.用于測定化合物活性的方法，所述方法包括連續(xù)步驟a)實施根據(jù)權(quán)利要求l-17任何一項的方法，并b)測定所述化合物的活性。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述方法在活化溶液的底物存在和/或不存在下進(jìn)4亍。20.用于鑒定調(diào)節(jié)OCT活性的化合物的方法，所述方法包括連續(xù)步驟a)實施根據(jù)權(quán)利要求l-19任何一項的方法，并b)鑒定所述化合物。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述化合物為有機陽離子，尤其是陽離子藥物、陽離子異生素和/或陽離子維生素、生物胺，更尤其是伯胺、仲胺、叔胺或季胺、親脂化合物、有機陰離子。22.權(quán)利要求20的方法，其中所述化合物為OCT的抑制劑。23.根據(jù)權(quán)利要求17-22任何一項的方法，其中所述化合物存在于化合物文庫中。24.如在權(quán)利要求1-7和15任何一項中定義的無細(xì)胞電生理傳感器芯片。25.根據(jù)權(quán)利要求24的傳感器芯片，其還包括用于從電極獲得測定數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)獲取裝置，和任選地用于使得可以交換和/或混合含離子溶液的交換和/或混合手段。26.根據(jù)權(quán)利要求24或25的傳感器芯片，其為微量培養(yǎng)板或微量滴定板的形式。27.裝置，其包含根據(jù)權(quán)利要求24或26的傳感器芯片、參比電極、用于從電極獲得測定數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)獲取裝置、用于使得可以交換和/或混合含離子溶液的交換和/或混合手段、流動分析裝置、電源、計算機和自動進(jìn)樣器。28.權(quán)利要求27的裝置，其中參比電極是Pt/Pt、Ag/AgCl或氧化銦錫電極。29.試劑盒，其包含(a)根據(jù)權(quán)利要求24-26任何一項的無細(xì)胞電生理傳感器芯片或根據(jù)權(quán)利要求27或28的裝置，(b)如權(quán)利要求9-13任何一項中定義的至少一種含離子溶液，和任選地(c)如權(quán)利要求14中定義的底物。全文摘要本發(fā)明涉及測定有機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白(OCT)活性的方法，涉及在無細(xì)胞電生理傳感器芯片的幫助下測定調(diào)節(jié)OCT活性的化合物的活性或鑒定所述化合物的方法，所述無細(xì)胞電生理傳感器芯片含有固體支持傳感器電極和脂質(zhì)層，該脂質(zhì)層含有定位于傳感器電極最接近空間附近的OCT，然而傳感器電極相對于所用的溶液和脂質(zhì)層是電絕緣的，還涉及傳感器芯片本身和含有該傳感器芯片的試劑盒。文檔編號G01N33/68GK101371137SQ200780002305公開日2009年2月18日申請日期2007年1月22日優(yōu)先權(quán)日2006年1月31日發(fā)明者B·凱萊蒂,H·福勒特,I·雅瑙斯科,K·芬德勒,O·蓋科,P·阿內(nèi)德特,S·蓋伯爾申請人:塞諾菲-安萬特股份有限公司