一種測定蛋白激酶活性的方法和蛋白激酶抑制劑活性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用電化學(xué)方法測定蛋白激酶活性的方法和蛋白激酶抑制劑活性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白激酶催化蛋白磷酸化是一種非常重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，能夠調(diào)節(jié)細胞內(nèi)大多數(shù)蛋白的功能。蛋白的磷酸化修飾與眾多生理過程緊密相關(guān)，如信號傳導(dǎo)、代謝調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄和細胞凋亡等。蛋白激酶是一種磷酸轉(zhuǎn)移酶，能夠?qū)⑷姿嵯佘?ATP)上的γ -磷酸基團轉(zhuǎn)移到底物蛋白特定的酪氨酸(Tyr)、蘇氨酸(Thr)和絲氨酸(Ser)殘基上。蛋白激酶是酶家族的重要成員，活性正常的蛋白激酶體系是細胞信號傳導(dǎo)運作的核心，但當(dāng)其活性異?；蛘哌^度表達時就會引起某些蛋白磷酸化的異常。人類許多疾病就和蛋白磷酸化異常密切相關(guān)，如癌癥、糖尿病及老年癡呆等。由于蛋白激酶調(diào)控著每個組織、每個器官、甚至每個細胞的生死，從而已成為治療這些復(fù)雜疾病的重要藥物靶點。因此，測定蛋白激酶的活性及篩選蛋白激酶抑制劑在生物醫(yī)學(xué)診斷以及酶靶藥物開發(fā)等領(lǐng)域激起了人們的興趣。
[0003]傳統(tǒng)測定蛋白激酶的方法一般都是通過蛋白磷酸化的程度，采用放射性同位素標(biāo)記法、表面等離子共振法、質(zhì)譜法、熒光法和免疫法等來檢測的，這些檢測手段和方法在一定程度上促進了對蛋白激酶活性研究，然而各自又具有一定的局限性。放射性元素標(biāo)記ATP技術(shù)，檢測方法直接、靈敏度高，但存在放射性污染，不能進行組織標(biāo)記;免疫法對磷酸化識別抗體的要求較高，專一性不強、費用高。因此，開發(fā)一種快速、簡便、經(jīng)濟、靈敏度高且無需標(biāo)記的蛋白激酶活性檢測及高通量篩選抑制劑方法是非常必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種操作簡單、靈敏度高、檢測范圍寬、且檢測用時短的利用電化學(xué)方法測定蛋白激酶活性的方法和蛋白激酶抑制劑活性的方法。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為:
[0006]—種測定蛋白激酶(PKA)活性的方法，包括以下步驟:
[0007](I)處理金電極:準(zhǔn)備多根金電極并清理干凈金電極表面，然后在金電極表面滴加氧化石墨烯溶液，烘干備用；
[0008](2)測定蛋白激酶的活性:選取一組不同濃度的蛋白激酶和同一濃度的ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)進行水浴反應(yīng)，得到一組蛋白激酶反應(yīng)液，再分別將得到的蛋白激酶反應(yīng)液和Na2MoO4溶液滴加在步驟(I)處理后的金電極表面，靜置后烘干，然后分別對金電極進行方波伏安曲線測試，根據(jù)伏安曲線得到峰電流，將得到的峰電流與每根金電極對應(yīng)的蛋白激酶的濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0009](3)根據(jù)所述標(biāo)準(zhǔn)曲線計算不同濃度下蛋白激酶的活性。
[0010]上述的方法，優(yōu)選的，所述步驟⑵中，ATP濃度為50?500μΜ，ΑΤΡ濃度的選取需進行優(yōu)化，其優(yōu)化過程具體為:選取一組不同濃度的ATP分別和同一濃度的蛋白激酶進行水浴反應(yīng)，得到一組蛋白激酶反應(yīng)液，再分別將得到的一組蛋白激酶反應(yīng)液和Na2MoO4溶液滴加在步驟(I)處理后的金電極表面，靜置后烘干，然后分別對金電極進行方波伏安曲線測試，根據(jù)伏安曲線分別得到峰電流，選取電信號增加最大時對應(yīng)的ATP濃度即為最優(yōu)的ATP濃度。更優(yōu)選的，ΑΤΡ濃度為250μΜ。
[0011 ] 上述的方法，優(yōu)選的，所述步驟⑵中，Na2MoO4溶液的濃度為6?1mM，水浴反應(yīng)的溫度35.5?38.5°C，水浴反應(yīng)的時間為I?2小時，靜置的時間為10?30min。
[0012]上述的方法，優(yōu)選的，所述步驟(2)中，方波伏安曲線測試的條件為:電解液為0.5M的H2SO4，電壓為0.1?0.5V，頻率為15HZ。
[0013]上述的方法，優(yōu)選的，金電極的表面清理過程具體為:將金電極在含Al203的拋光布上進行拋光，拋光后的金電極用二次水沖洗，再用無水乙醇和二次水分別超聲清洗，用氮氣吹干。
[0014]本發(fā)明還提供一種測定蛋白激酶抑制劑活性的方法，包括以下步驟:
[0015](I)處理金電極:準(zhǔn)備多根金電極并清理干凈金電極表面，然后在金電極表面滴加氧化石墨烯溶液，烘干備用；
[0016](2)測定蛋白激酶抑制劑的活性:選用一組不同濃度的蛋白激酶抑制劑分別和同一濃度的蛋白激酶、同一濃度的ATP進行水浴反應(yīng)，再分別將得到的反應(yīng)液與Na2MoO4溶液滴加在步驟(I)處理后的金電極表面，靜置后烘干，然后分別對金電極進行掃方波伏安曲線測試，根據(jù)伏安曲線分別得到峰電流，將得到的峰電流與每根金電極對應(yīng)的蛋白激酶抑制劑的濃度做擬合曲線；
[0017](3)根據(jù)所述擬合曲線計算不同濃度下蛋白激酶抑制劑對蛋白激酶活性的抑制程度。
[0018]上述的方法，優(yōu)選的，所述步驟⑵中，ATP濃度為50?500μΜ，ΑΤΡ濃度的選取需進行優(yōu)化，其優(yōu)化過程具體為:選取一組不同濃度的ATP分別和同一濃度的蛋白激酶進行水浴反應(yīng)，得到一組蛋白激酶反應(yīng)液，再分別將得到的一組蛋白激酶反應(yīng)液和Na2MoO4溶液滴加在步驟(I)處理后的金電極表面，靜置后烘干，然后分別對金電極進行方波伏安曲線測試，根據(jù)伏安曲線分別得到峰電流，選取電信號增加最大時對應(yīng)的ATP濃度即為最優(yōu)的ATP濃度。更優(yōu)選的，ΑΤΡ濃度為250μΜ。
[0019]上述的方法，優(yōu)選的，所述步驟(2)中，Na2MoO4的濃度為Na2MoO4的濃度為6?1mM;水浴反應(yīng)的溫度35.5?38.5°C，水浴反應(yīng)的時間為I?2小時，靜置的時間為10?30min。
[0020]上述的方法，優(yōu)選的，所述步驟(2)中，方波伏安曲線測試的條件為:電解液為0.5M的H2SO4，電壓為0.1?0.5V，頻率為15HZ。
[0021]上述的方法，優(yōu)選的，所述步驟(I)中，金電極的表面清理過程具體為:將金電極在含Al 203的拋光布上進行拋光，拋光后的金電極用二次水沖洗，再用無水乙醇和二次水分別超聲清洗，用氮氣吹干。
[0022]本發(fā)明的原理如圖1所示，是基于蛋白激酶PKA可以催化水解三磷酸腺苷ATP生成二磷酸腺苷(ADP)和游離的磷酸根，且磷酸根在酸性條件下與鉬酸鈉反應(yīng)生成能產(chǎn)生電信號的磷鉬酸鈉沉淀，電信號的大小與蛋白激酶活性成正相關(guān)，從而可以通過電化學(xué)法測定蛋白激酶PKA的活性及抑制性。
[0023]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于:
[0024](I)本發(fā)明的方法避開了現(xiàn)有技術(shù)中繁瑣的蛋白磷酸化的步驟，直接通過電化學(xué)信號大小來測定PKA水解ATP產(chǎn)生的游離磷酸根的量，從而反映出蛋白激酶PKA的活性。該方法操作簡單、靈敏度高、檢測范圍寬、且檢測用時短，具體的表現(xiàn)為本發(fā)明可以在0.0005?500U/mL范圍內(nèi)測定蛋白激酶PKA的活性，跨越5個數(shù)量級，檢測范圍寬。本發(fā)明的靈敏度高，本發(fā)明的檢測線可以達到2U/L(以信噪比為3的方法)，遠遠低于之前文獻報道的基于半合成熒光法測定PKA活性(500U/L)、石墨烯量子點測定PKA活性(30U/L)和銀納米簇測定PKA活性(500U/L)等。本發(fā)明省去了常規(guī)繁瑣的蛋白磷酸化過程，只是通過“混合-檢測”就可以在I.5個小時完成整個步驟，用時短，操作方便;同時可推廣到其他磷酸水解酶的活性測定。
[0025](2)本發(fā)的方法操作簡單、靈敏度高，這為高效、快速、低投入地篩選多種有效的PKA抑制劑提供了新的思路。
【附圖說明】
[0026]圖1為本發(fā)明的原理不意圖。
[0027]圖2為本發(fā)明的實施例1中不同濃度的PKA電化學(xué)響應(yīng)信號圖。
[0028]圖3為本發(fā)明的實施例1中濃度范圍為5U/L?500U/mLPKA活性對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0029 ]圖4為本發(fā)明實施例2中不同濃度的PKA抑制劑H_89的電化學(xué)響應(yīng)信號圖。
[0030]圖5為本發(fā)明實施例2中不同濃度的PKA抑制劑對PKA活性抑制得曲線擬合圖。
【具體實施方式】
[0031]為了便于理解本發(fā)明，下文將結(jié)合說明書附圖和較佳的實施例對本發(fā)明作更全面、細致地描述，但本發(fā)明的保護范圍并不限于以下具體的實施例。
[0032]除非另有定義，下文中所使用的所有專業(yè)術(shù)語與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中所使用的專業(yè)術(shù)語只是為了描述具體實施例的目的，并不是旨在限制本發(fā)明的保護范圍。
[0033]除有特別說明，本發(fā)明中用到的各種試劑、原料均為可以從市場上購買的商品或者可以通過公知的方法制得的產(chǎn)品。
[0034]實施例1:
[0035]—種本發(fā)明的測定蛋白激酶活性的方法，包括以下步驟:
[0036](I)處理金電極:將多根直徑為2mm的金電極在含有0.05μηι的AI2O3拋光布上進行拋光，拋光后的金電極用二次水沖洗，再用無水乙醇和二次水分別超聲清洗5分鐘，將附著于金電極表面的拋光粉清除干凈，再用氮氣吹干。將清洗好的金電極、Ag/AgCl參比電極和鉑絲對電極共同放入裝有5mmol.L—1的鐵氰化鉀溶液的反應(yīng)池內(nèi)，在-0.1-0.6V電壓下，進行循環(huán)伏安法掃描，設(shè)定掃描速度為0.1V.s