專利名稱：在生物樣品中檢測鈣蛋白酶3活性的方法和實施該方法所用的肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在包含細(xì)胞、細(xì)胞系或組織的生物樣品中檢測鈣蛋白酶3活性的方法。還涉及該方法中所用的肽。本發(fā)明還涉及應(yīng)用所述的肽在體外診斷2A型肢帶型肌營養(yǎng)不良癥(LGMD 2A)。而且，還涉及分析在體外向動物或人細(xì)胞、及在體內(nèi)向動物中轉(zhuǎn)運(yùn)鈣蛋白酶3基因的效率的方法。此外，還涉及篩選鈣蛋白酶3-抑制物或鈣蛋白酶3-激活物的方法。最后，檢測鈣蛋白酶3活性的方法包括研究鈣蛋白酶3功能的手段。
鈣蛋白酶是一個鈣激活的、非溶酶體半胱氨酸蛋白酶家族(Sorimachi，1997)。這個家族目前包含11個成員，其中包括兩個遍在蛋白。鈣蛋白酶的生理功能大部分仍是未知的。作為調(diào)節(jié)型的蛋白酶，它們很可能調(diào)節(jié)重要的細(xì)胞功能。具體說來，遍在鈣蛋白酶與編程性細(xì)胞死亡(Squier，1994)，生肌分化(Kwak，1993)，和細(xì)胞分裂及融合相關(guān)(Yamaguchi，1994)；(Schollmeyer，1986)；(Balcerzak，1995)。
鈣蛋白酶3，也稱作p94，是一種鈣依賴的半胱氨酸酶，屬于鈣蛋白酶家族，并在骨骼肌中特異表達(dá)(Sorimachi，1989)。它與一種被稱為2A型肢帶型肌營養(yǎng)不良癥的常染色體隱性遺傳疾病相關(guān)(Richard，1995)。這種肌病以萎縮和骨盆的和肩帶的肌肉漸進(jìn)性衰弱為特征，肌肉活組織檢查表象為壞死-再生(Fardeau，1996)。該基因定位于人的第15號染色體，編碼3.5kb的轉(zhuǎn)錄物，該轉(zhuǎn)錄物本身編碼94kDa的蛋白。已表明鈣蛋白酶3可與肌聯(lián)蛋白，即一種肌節(jié)彈性蛋白通過IS2區(qū)域相結(jié)合，當(dāng)其在Cos7細(xì)胞中表達(dá)時，翻譯后立即自溶降解(Sorimachi，1993)(Sorimachi，1995)。這一區(qū)域中包含核定位信號，這意味著鈣蛋白酶可定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中。另外還已表明鈣蛋白酶3在過表達(dá)IL-6的轉(zhuǎn)基因小鼠中低表達(dá)，這些小鼠表現(xiàn)出肌肉萎縮。鈣蛋白酶3還在多種包含肌肉萎縮成分(惡病質(zhì)，等)的條件下表現(xiàn)為低表達(dá)。
依照當(dāng)前的知識水平，由此認(rèn)為LGMD 2A是由鈣蛋白酶3基因的突變導(dǎo)致的，突變導(dǎo)致骨骼肌中存在的鈣蛋白3的蛋白水解活性受到抑制。由于患者的臨床癥狀與至少約10種其他的病理狀況相類似，因此LGMD 2A的臨床診斷非常困難。在分子診斷方面可依照多種方法進(jìn)行。
第一種可能是對鈣蛋白酶基因進(jìn)行突變研究。但是，由于該基因相對較大，所以存在許多不同的突變，且并不存在優(yōu)先的突變，因此這種技術(shù)是相當(dāng)繁復(fù)的。
另一種技術(shù)包括利用特異的抗體檢測該蛋白的存在。但即使樣中存在鈣蛋白酶3也不能說明該個體沒有患病，這是因為鈣蛋白酶基因的突變可能意味著雖然該蛋白存在但自溶現(xiàn)象并不存在。另一方面，如果鈣蛋白酶不存在或減少，也可能涉及由于鈣蛋白酶之外的基因突變造成的繼發(fā)鈣蛋白酶病。
換言之，本發(fā)明所要解決的問題并非僅僅是檢測生物樣品中鈣蛋白酶3的存在，更重要的是檢測其活性。
Guttmann等在“Methods in molecular biology”vol 144，ch 18中描述了檢測遍在鈣蛋白酶活性的方法，該方法包括使純化的鈣蛋白酶與非特異的熒光肽(Succ-LLVY-AMC)相接觸，然后檢測該分子被裂解后熒光的變化。在另一種方法中，將鈣蛋白酶與完整的TAU蛋白接觸，然后進(jìn)行蛋白印跡。這篇文章沒有以任何方式特異地涉及鈣蛋白酶3。另外，所述的底物或是非特異的(m-鈣蛋白酶和μ-鈣蛋白酶的底物)或是完整蛋白。
本發(fā)明所要解決的問題是開發(fā)一種新的特異于鈣蛋白酶3的底物，其可用于檢測生物樣品中鈣蛋白酶3的活性。
因此，本發(fā)明首先涉及至少與一種熒光或生色的報道分子相偶聯(lián)的肽，所述肽的特征在于它包含至少一種能被鈣蛋白酶3或鈣蛋白酶3的同工型裂解的氨基酸序列。
所述的“鈣蛋白酶3的同工型”代表任何由鈣蛋白酶3基因由于可變啟動子的可變事件或可變剪接所產(chǎn)生的蛋白。
在第一個實施方案中，鑒于鈣蛋白酶3的自溶特性，本發(fā)明的肽優(yōu)選地包含至少一個鈣蛋白酶3或鈣蛋白酶3的同工型的自溶位點(diǎn)，其氨基酸的數(shù)量小于10。
在說明書的其他部分和權(quán)利要求中，“自溶位點(diǎn)”表示在鈣蛋白酶3或其同工型之一中所包含的氨基酸序列和任何由此衍生的序列，其可被鈣蛋白酶3或其同工型之一裂解成至少兩個肽。
實踐中，鈣蛋白酶3自溶位點(diǎn)的氨基酸序列選自下述稱作NMTYGTS(SEQ ID 1)，NMDNSLL(SEQ ID 2)和PVQYETR(SEQ ID 3)的序列，在說明書的其他部分分別稱作位點(diǎn)1，位點(diǎn)2和位點(diǎn)3。這些位點(diǎn)在目前所有鈣蛋白酶3序列已知的物種(人，小鼠，大鼠)中都是同一的。
鈣蛋白酶3自溶位點(diǎn)的氨基酸序列也可以選自下述人序列VAPRTAAEPRSP(SEQ ID 4)，QSKATE AGGGNP(SEQ ID 5)，和下述的鼠序列VAPRTG AEPRSP(SEQ ID 6)，QGKTTE AGGGHP(SEQ ID 7)。
在所述的實施方案中，本發(fā)明的肽包含至少一個鈣蛋白酶3同工型的自溶位點(diǎn)，所述自溶位點(diǎn)的氨基酸序列來源于存在于嚙齒動物，大鼠和小鼠中的稱作Lp82的鈣蛋白酶3同工型，并選自下述的氨基酸序列NPYLLPGFFC(SEQ ID 8)和TISVDRPVP(SEQ ID 9)。
在第二個實施方案中，可被鈣蛋白酶3或其同工型裂解的氨基酸序列來自底物蛋白，如鈣蛋白酶抑制蛋白，細(xì)絲蛋白，踝蛋白，遍在鈣蛋白酶，晶體蛋白(crystalline)，熱激蛋白等。
優(yōu)選地，所述底物蛋白具有下述序列REVTIPPKYRELL(SEQ ID 10)(人鈣蛋白酶抑制蛋白)KEGTIPPEYRKLL(SEQ ID 11)(小鼠和大鼠鈣蛋白酶抑制蛋白)PVSREEKPTSAPSS(SEQ ID 12)(人α-A-晶體蛋白)PVSREEKPSSAPSS(SEQ ID 13)(小鼠和大鼠α-A-晶體蛋白)KSTVLQQQYNR(SEQ ID 14)(人踝蛋白)以登記號為XP045856公開的序列(人細(xì)絲蛋白2)以登記號為P10809公開的序列(人熱激蛋白60)以登記號為NP004355公開的序列(人c/EBPβ)以登記號為P17655公開的序列(人m-鈣蛋白酶)。
在第三個實施方案中，所述的包含可被鈣蛋白酶3或其同工型裂解的肽是用鈣蛋白酶3或其同工型篩選肽文庫所獲得的。
為使得接下來能通過顯色法或熒光測定法檢測鈣蛋白酶的活性，上述的本發(fā)明的肽與生色的或熒光報道分子相偶聯(lián)。
當(dāng)所述的報道分子是生色分子時，鈣蛋白酶3對所述氨基酸序列的裂解在分光光度計上通過有色化合物的出現(xiàn)來檢測。實踐中所應(yīng)用的有色化合物是對硝基苯胺。也可以是硫酯。
當(dāng)所述的肽與熒光化合物偶聯(lián)時，通過熒光發(fā)射的改變檢測所述的裂解。在此種情況下，實踐中所用的熒光化合物是4-甲基-7-香豆酰胺(MCA)或萘胺。萘酰胺和4-甲基-7-香豆基酰胺可用作生色的或熒光底物。
在另一實施方案中，所述的可被鈣蛋白酶3裂解的肽的兩端與兩種熒光化合物相偶聯(lián)，通過，由于裂解后繼發(fā)的間隔而引起的第一化合物(供體分子)、及當(dāng)兩分子相接近時定位于所述肽另一端并可吸收第一化合物熒光的第二化合物(受體分子)的熒光發(fā)射改變檢測所述的裂解。已知這一技術(shù)被稱為FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)(Frster，1948)。更具體地說，F(xiàn)RET是一種兩熒光分子在一定條件下出現(xiàn)的物理現(xiàn)象兩分子必須足夠地接近(小于100)，其中一個分子(供體分子)的發(fā)射光譜需覆蓋第二分子(受體分子)的激發(fā)光譜。因此當(dāng)供體分子在其激發(fā)波長下被激發(fā)時，其達(dá)到一高能量級。在幾微微秒內(nèi)，部分能量以不同的形式(熱等)在介質(zhì)中分散。若供體分子處于最佳的方向并接近受體分子，在沒有光子參與、無需兩分子發(fā)生碰撞的情況下，其能量可轉(zhuǎn)移到受體分子。使受體分子受到激發(fā)并在自己的發(fā)射波長下發(fā)光。當(dāng)肽被裂解后，所述的能量不再被吸收，供體分子發(fā)射熒光。因此熒光的增加相應(yīng)于可測定的肽裂解活性。所述的熒光報道分子可以是通過化學(xué)合成獲得的合成分子，或是可使熒光信號發(fā)射的蛋白。
在第一個實施方案中，所述的肽的兩端都具有合成的熒光報道分子，分別是MCA(供體分子)和Dnp(受體分子)。
在第二個實施方案中，所述的供體是5-[(2’-氨基-乙基)氨基]萘磺酸(EDANS)，受體分子是4-[[4’二甲胺基]苯基]偶氮苯甲酸(DABCYL)。
在上述所有的情況下，與生色或熒光分子偶聯(lián)的本發(fā)明的肽是通過化學(xué)合成的。
如已提及的，所述的報道分子也可以是可發(fā)射熒光信號的蛋白。在此種情況下，優(yōu)選的實施方案中，所述肽的每一端都具有突變的GFP。
GFP(綠色熒光蛋白)是27kD的蛋白，它是由一種太平洋水母(Aequora Victoria)合成的，當(dāng)此種動物應(yīng)激時發(fā)射綠色熒光(Prasher，1992)。目前已可以純化這種蛋白并鑒定其基因。編碼GFP的序列可同相地與非常不同蛋白的編碼序列一起克隆。與其他蛋白連接時GFP保持了其熒光特性，這樣由于與GFP相連的蛋白可使對許多現(xiàn)象的研究易于進(jìn)行，例如，對細(xì)胞遷移，蛋白在不同細(xì)胞區(qū)室內(nèi)的遷移的研究。GFP在形成熒光團(tuán)或與該熒光團(tuán)相互作用的氨基酸序列中的某種突變使得鑒定具有特異熒光特性的突變體成為可能(Ellenberg，1999；Pollock，1999)。具體說來，已分離了CFP，即藍(lán)綠熒光蛋白(激發(fā)440nm；發(fā)射480nm)，YFP，即黃色熒光蛋白(激發(fā)514nm；發(fā)射530nm)。理論上這兩種蛋白可通過FRET現(xiàn)象連接起來。實際上，CFP(供體分子)的發(fā)射光譜和YFP(受體分子)的激發(fā)光譜之間存在重疊。
當(dāng)這兩個蛋白彼此足夠接近時，當(dāng)CFP在其激發(fā)波長下激發(fā)后，CFP可將其激活的能量轉(zhuǎn)移到Y(jié)FP，其由此可在535nm波長下發(fā)光。因此可將上述相應(yīng)于鈣蛋白酶3自溶位點(diǎn)的序列克隆到CFP和YFP序列之間。在活細(xì)胞中產(chǎn)生嵌合蛋白，并將這一系統(tǒng)應(yīng)用于檢測鈣蛋白酶3，在所述的嵌合蛋白中CFP通過可被鈣蛋白酶3裂解的肽與YEP相連。
本發(fā)明的主題還涉及編碼與至少一種熒光蛋白相偶聯(lián)的肽的DNA序列，所述的肽包含至少一種能被鈣蛋白酶3或鈣蛋白酶3的同工型裂解的氨基酸序列。在優(yōu)選的實施方案中，所述的DNA序列編碼下述的肽CFP-位點(diǎn)1-YEPCFP-位點(diǎn)2-YEPCFP-位點(diǎn)3-YEP。
本發(fā)明還涉及包含上述DNA序列和誘導(dǎo)該DNA序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的載體。這種載體是，例如由本申請人開發(fā)的質(zhì)粒pTOM，其直接由在(Vanderklish 2000)中描述的質(zhì)粒衍生而來。本發(fā)明還涉及經(jīng)所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及在體外檢測生物樣品中鈣蛋白酶3或鈣蛋白酶3的同工型活性的方法，依照該方法第一步，將生物樣品與上述的肽相接觸，第二步，通過測定顯色或熒光反應(yīng)強(qiáng)度檢測是否存在由鈣蛋白酶3或鈣蛋白酶3同工型對所述肽進(jìn)行的裂解。
在第一步驟中可依所述的檢測是在由活細(xì)胞或細(xì)胞抽提物、還是組織組成的生物樣品上進(jìn)行而假定多種形式，所述的細(xì)胞來源于人或動物。
當(dāng)所述樣品由活細(xì)胞組成，其與所述肽的接觸可通過兩種途徑進(jìn)行。在第一實施方案中，使所述的肽直接與細(xì)胞相接觸，以此種方式所述的肽必須具有足夠的穿透性以穿透細(xì)胞。所述肽的穿透性可作為報道分子的固有功能來確定。在第二個實施方案中，所述的生物樣品相當(dāng)于經(jīng)編碼相應(yīng)于本發(fā)明的肽的DNA序列轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，所述的報道分子然后相當(dāng)于可以發(fā)射熒光信號的蛋白。
當(dāng)所述的樣品是細(xì)胞抽提物形式時，可簡單地將所述的肽與細(xì)胞抽提物相接觸。
如上所述，也可以直接在組織切片上進(jìn)行活性的檢測。實踐中，取出所述的生物樣品(器官，部分器官，例如肌肉活組織檢查)，然后迅速地冷凍在異戊烷中，并用液氮冷卻。將其貯存在-80℃下備用。用低溫恒溫器制備5到15μm的切片并置于玻片上。所述的玻片若不立即使用也置于-80℃細(xì)胞保存?？蓪⑺龅碾闹苯又糜谒霾Ｆ蠙z測鈣蛋白酶的活性。
在優(yōu)選的實施方案中，所述肽的兩端分別具有熒光供體分子和熒光受體分子，通過FRET測定熒光反應(yīng)的強(qiáng)度。因此當(dāng)FRET現(xiàn)象出現(xiàn)時，鈣蛋白酶在細(xì)胞中沒有活性。另一方面，如果鈣蛋白酶有活性，其對所述的肽進(jìn)行裂解，則FRET現(xiàn)象減弱。
檢測鈣蛋白酶3或鈣蛋白酶3同工型活性的方法開發(fā)了有用的體外診斷LGMD 2A的方法。因此，本發(fā)明還涉及應(yīng)用上述的檢測方法在體外診斷LGMD 2A。
本發(fā)明還涉及篩選抑制或激活鈣蛋白酶3或鈣蛋白酶3同工型活性的物質(zhì)的方法。所述的方法可確定兩種不同的實施方案。
依照第一實施方案，該方法包括-制備用所述物質(zhì)處理的生物樣品，-然后將經(jīng)上述處理的生物樣品與本發(fā)明的肽相接觸，-檢測顯色或熒光反應(yīng)存在與否，分別表明可激活或抑制鈣蛋白酶3或鈣蛋白酶3同工型的物質(zhì)的存在與否。
所述的生物樣品可以是細(xì)胞、細(xì)胞抽提物或其他組織的形式。然后使經(jīng)處理的樣品(細(xì)胞，細(xì)胞抽提物或組織抽提物)與所述的肽相混合制備含有所述肽的生物樣品。實踐中，所述肽的兩端分別具有熒光供體分子和熒光受體分子，通過FRET測定熒光反應(yīng)的強(qiáng)度。
依照第二實施方案，所述的方法包括-制備包含本發(fā)明的肽的生物樣品，-將所述樣品與待鑒定的物質(zhì)相接觸，-檢測顯色或熒光反應(yīng)存在與否，分別表明可激活或抑制鈣蛋白酶3或鈣蛋白酶3同工型的物質(zhì)的存在與否。
在這種情況下，所述的生物樣品由用包含編碼本發(fā)明的肽的DNA序列的載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或細(xì)胞系組成，所述的報道分子是蛋白。
在優(yōu)選的實施方案中，所述肽的兩端分別具有熒光供體分子和熒光受體分子，該方法包括a/制備含有所述肽的生物樣品，b/測定不存在能激活或抑制鈣蛋白酶3或鈣蛋白酶3同工型的物質(zhì)時FRET的量，c/使含有所述肽的生物樣品與能激活或抑制鈣蛋白酶3或鈣蛋白酶3同工型的物質(zhì)相接觸，d/測定在存在能激活或抑制鈣蛋白酶3或鈣蛋白酶3同工型的物質(zhì)時FRET的量，e/作出存在下述物質(zhì)的結(jié)論如果在b/步驟中測定的FRET的量高于在d/步驟中測定的FRET的量則存在激活物質(zhì)；如果在b/步驟中測定的FRET的量等于在d/步驟中測定的FRET的量則存在抑制物質(zhì)。
本發(fā)明的主題還涉及分析鈣蛋白酶3的轉(zhuǎn)移效率的方法，其包括-首先用編碼鈣蛋白酶3的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染動物或人細(xì)胞，-然后使經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與本發(fā)明的肽在體內(nèi)或體外相接觸，-再測定顯色或熒光反應(yīng)的強(qiáng)度。
在優(yōu)選的實施方案中，所述肽的兩端分別具有熒光供體分子和熒光受體分子，通過FRET測定熒光反應(yīng)的強(qiáng)度。
已完全鑒定出了鈣蛋白酶3基因，并且在EP717110中已精確地描述了轉(zhuǎn)染技術(shù)，因此此處不再給出具體的細(xì)節(jié)描述。
本發(fā)明及由此帶來的有益之處將通過由下述附圖支持的實施例更加清楚地表現(xiàn)出來。


圖1鈣蛋白酶3的部分序列；箭頭標(biāo)示出自溶位點(diǎn)的位置；用于所述肽的序列用下劃線標(biāo)出，其在目前所有鈣蛋白酶3序列已知的所有物種(人，小鼠，猴，大鼠，牛)中都是同一的。
圖2通過重組鈣蛋白酶1(左欄)和鈣蛋白酶2(右欄)測定相應(yīng)于鈣蛋白酶3自溶位點(diǎn)1，2和3的肽隨時間的裂解活性(分別為曲線A，B和C)。
圖3通過經(jīng)或未經(jīng)編碼鈣蛋白酶3的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的C2C12細(xì)胞抽提物測定相應(yīng)于鈣蛋白酶3自溶位點(diǎn)的肽隨時間的裂解活性。
圖4通過正常(+/+)或鈣蛋白酶3缺陷(-/-)的小鼠成肌細(xì)胞的抽提物測定相應(yīng)于鈣蛋白酶3自溶位點(diǎn)的肽隨時間的裂解活性。
圖5通過正常(+/+)或鈣蛋白酶3缺陷(-/-)的小鼠肌管細(xì)胞的抽提物測定相應(yīng)于鈣蛋白酶3自溶位點(diǎn)3的肽隨時間的裂解活性全程。
圖6通過正常(+/+)或鈣蛋白酶3缺陷(-/-)的小鼠成肌細(xì)胞的抽提物測定6小時內(nèi)相應(yīng)于鈣蛋白酶3自溶位點(diǎn)的肽的裂解活性。
圖7通過正常(+/+)或鈣蛋白酶3缺陷(-/-)的小鼠四頭肌的抽提物測定6小時內(nèi)相應(yīng)于鈣蛋白酶3自溶位點(diǎn)的肽的裂解活性。
圖8質(zhì)粒pTOM的部分序列。用斜體表示的氨基酸是ECFP序列的部分。用粗體表示的氨基酸序列是ECFP的一部分。在載體pTOM中EYFP的終止密碼子已被去除。用斜體和粗體表示的堿基分別表示EYFP和ECFP序列相。用下劃線標(biāo)示出的序列相應(yīng)于取出用于構(gòu)建載體pTOMp的片段。蛋白序列A和B分別相應(yīng)于在定位于Ec1136II和SmaI酶切位點(diǎn)之間的雙鏈片段被取出之前、之后載體pTOM從EYFP編碼序列的ATG所翻譯出的序列。在序列A中，編碼EYFP和ECFP的序列不在相位中。它們在序列B的相中。
圖9A用pTOMp轉(zhuǎn)化后的傳代培養(yǎng)集落進(jìn)行PCR所得產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的遷移。該P(yáng)CRs是用寡核苷酸midEYFP.a和midECFP.m進(jìn)行的。B這些PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI消化后的遷移；孔11kb序列梯；孔2pTOM；孔3用EcoRI消化后的pTOM；孔4-9凝膠A中的PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI消化后的遷移；它們的大小總是800bp。
圖10載體pTOM的克隆位點(diǎn)(10a)和編碼鈣蛋白酶3自溶位點(diǎn)的寡核苷酸序列(10b，10c，10d)。每一對互補(bǔ)的寡核苷酸由一種名稱中以“.a”結(jié)尾的寡核苷酸和一種名稱中以“.m”結(jié)尾的寡核苷酸組成。
圖11用pTOMp和編碼自溶位點(diǎn)2的插入物轉(zhuǎn)化后的傳代培養(yǎng)集落中進(jìn)行PCR所得產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的遷移；該P(yáng)CR是用寡核苷酸SGp94S2.a和midECFP.m進(jìn)行的。
圖12質(zhì)粒pTOM的限制性酶切圖譜。
圖13質(zhì)粒pTOMs1，pTOMs2和TOMs3的限制性酶切圖譜。
I/用蛋白抽提物測定鈣蛋白酶3的活性相應(yīng)于鈣蛋白酶3自溶位點(diǎn)(圖1)的合成肽的裂解使應(yīng)用涉及FRET的技術(shù)檢測其活性成為可能。
A/材料和方法1/熒光計SpectraMax Gemini XS Microplate熒光計(分子設(shè)備)。
2/熒光肽的序列Mca-NMTYGTS-Dnp(位點(diǎn)1)Mca-NMDNSLL-Dnp(位點(diǎn)2)Mca-PVQYETR-Dnp(位點(diǎn)3)3/所用的可商購酶和抑制劑的索引鈣蛋白酶1人紅細(xì)胞(Calbiochem)鈣蛋白酶2大鼠，重組體，大腸桿菌(Calbiochem)Caspase3人，重組體，大腸桿菌(Ca1biochem)4/反應(yīng)條件終體積200μl；鈣(CaCl2)終濃度10mM；熒光肽終濃度1.9μM。5/熒光檢測反應(yīng)在37℃下進(jìn)行1小時(這種情況下每50秒測定一次熒光)或6小時(每2分鐘測定一次)。在每次測定之間搖動培養(yǎng)基。用于檢測肽熒光的波長為-Mca的激發(fā)波長為325nm。
-Dnp的發(fā)射波長為392nm。
6/調(diào)制緩沖液首先設(shè)定反應(yīng)條件，具體說來是反應(yīng)緩沖液的組分。實際上已證明熒光檢測非常靈敏。第一步實驗包含多種不同的緩沖液組分和濃度。試驗了多種NaCl濃度。表明具有低濃度的用于重懸所述肽的DMSO非常重要。還表明在反應(yīng)介質(zhì)中存在CHAPS和BSA可進(jìn)行最佳的熒光檢測。為確定激活鈣蛋白酶3，反應(yīng)于37℃下，存在10mM鈣的條件下進(jìn)行。實際上，在存在約納摩爾濃度的鈣時鈣蛋白酶3具有活性。
緩沖液的組分可商購的鈣蛋白酶的重懸緩沖液100mM NaCl，5mM EDTA，50mMTris HCl，5mM β-巰基乙醇，40％甘油，pH7.8。在環(huán)境溫度下貯存。熒光肽的重懸緩沖液所述的肽以1mg/ml重懸于100％的DMSO中。于4℃下在黑暗中貯存。
反應(yīng)緩沖液100mM NaCl，50mM HEPES，10mM DTT，1mM EDTA，10％甘油，0.1％CHAPS，100ng/μl BSA，pH＝7.4，過濾，于環(huán)境溫度下貯存。
7/真核細(xì)胞培養(yǎng)所用的細(xì)胞系C2C12鼠成肌細(xì)胞；所用的培養(yǎng)基DMEMDulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(Gibco BRL)MEM非必需氨基酸溶液(Gibco BRL)FSC胎牛血清(Gibco BRL)用于C2C12的培養(yǎng)基DMEM+10％FCS鈣蛋白酶的激活向培養(yǎng)基中添加終濃度6mM的CaCl2和終濃度為0.5μM的離子霉素(Calbiochem)。
8/將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中的方案材料依照QIAGEN EndoFree方法(ref.12362)制備多種質(zhì)粒DNA。
所用的質(zhì)粒pECFP-N1(Clontech)；pBYFP-C1(Clontech)。
方法第一天將所需的細(xì)胞胰蛋白酶化，在孔中接種細(xì)胞使其在接下來幾天中達(dá)到鋪滿50-80％。
第二天將無胎牛血清的94μl培養(yǎng)基置于第一無菌的聚苯乙烯管(T1)中。
向每個T1管中加入6μl FUGENE 6緩沖液。
在環(huán)境溫度下溫育5min。
將1-2μg EndoFree質(zhì)粒添加到第二無菌聚苯乙烯管(T2)中，加在管底。
在溫育5min結(jié)束時，所述的FUGENE 6(T1)緩沖液+培養(yǎng)基滴加到含有載體的T2管中。
在不攪拌的情況下，于環(huán)境溫度下溫育30min。
更換孔中的培養(yǎng)基。
30min后，將轉(zhuǎn)染混合物滴加到每一孔中，將滴加的混合物散布到整個孔表面。
使細(xì)胞在37℃/7％CO2中生長。
注示對于每次轉(zhuǎn)染，均留有一個未與FUGENE 6接觸的孔(細(xì)胞對照)，以及一個其中的細(xì)胞僅與FUGENE 6接觸的孔(FUGENE 6毒性對照)。
9/細(xì)胞裂解方案原理裂解經(jīng)轉(zhuǎn)染的或未轉(zhuǎn)染的動物細(xì)胞以制備蛋白抽提物研究其性質(zhì)。
方法去除孔中的培養(yǎng)基，用PBS(硫酸鹽緩沖的Dulbecco溶液(無鈣，鎂或碳酸氫鈉)-Gibco BRL)。
收集細(xì)胞，于4℃下500g離心10min。
去上清，向細(xì)胞中加入裂解緩沖液(50mM HEPES，1mMDTT，0.1mMEDTA，0.1％CHAPS，pH＝7.4)，以每孔700μl裂解緩沖液的比例。
使緩沖液在4℃下作用5min。
10000g/10min/4℃下離心。
收集上清液于-20℃下貯存。
10/組織裂解方案原理將肌肉磨碎以制備蛋白抽提物，并研究其性質(zhì)。
材料正常小鼠和鈣蛋白酶3缺陷小鼠的四頭肌。
方法在液氮中將肌肉磨碎。
按每微克磨碎組織19μl裂解緩沖液的比例將磨碎的物質(zhì)重懸于裂解緩沖液中(參見上述細(xì)胞裂解方案中的組分)。
使緩沖液在冰上作用10分鐘。
于4℃下10000g離心10min。
收集上清液于-20℃下貯存。
B/“自溶位點(diǎn)”特異性試驗由鈣蛋白酶3裂解肽在證明鈣蛋白酶3是否能裂解相應(yīng)于其自溶位點(diǎn)的肽之前，第一個試驗包括證明這些肽(位點(diǎn)1，位點(diǎn)2，位點(diǎn)3)不能被其它蛋白酶，特別是遍在鈣蛋白酶(參見圖2)所裂解。由于對照，即“無酶肽”曲線和“肽+酶”曲線可以相疊加，可見鈣蛋白酶1和2對每個自溶位點(diǎn)均無裂解活性。另一蛋白酶，caspase 3也給出了類似的結(jié)果。
已知由于肌聯(lián)蛋白的存在，鈣蛋白酶3在肌肉細(xì)胞中具有更高的穩(wěn)定性。為證明鈣蛋白酶3能夠裂解其自身的自溶位點(diǎn)，用編碼鈣蛋白酶3的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞使鈣蛋白酶3在其中過表達(dá)。與用編碼鈣蛋白酶3的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染的同時用pECFP進(jìn)行對照轉(zhuǎn)染。對C2C12細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率低于10％。抽提蛋白并試驗其對自溶位點(diǎn)的活性(圖3) 。
代表經(jīng)轉(zhuǎn)染和未經(jīng)轉(zhuǎn)染的C2C12細(xì)胞抽提物對位點(diǎn)1和2的活性的曲線表明熒光略有提高，這可能意味著鈣蛋白酶3可以裂解這些位點(diǎn)。鈣蛋白酶3是一種在肌肉中表達(dá)的蛋白，因此從未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞抽提物所觀察到的基礎(chǔ)活性是正常的。但沒有檢測到經(jīng)轉(zhuǎn)染的和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對位點(diǎn)1和2有任何差異。另一方面，對于位點(diǎn)3，在經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的裂解活性更高。差異是微小的，這與經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的低百分比相關(guān)。
然后用該系統(tǒng)對缺失或不缺失鈣蛋白酶3的細(xì)胞的抽提物進(jìn)行試驗。為此使用了缺失鈣蛋白酶3基因的小鼠，生肌細(xì)胞培養(yǎng)物來源于此(Richard，2000)。鈣蛋白酶3缺失的肌細(xì)胞(-/-細(xì)胞)培養(yǎng)物的抽提物與正常肌細(xì)胞(+/+細(xì)胞)培養(yǎng)物的抽提物相比較。首先對未分化的細(xì)胞(成肌細(xì)胞)進(jìn)行該試驗(圖4)。通過這些試驗可以表明，對位點(diǎn)1可檢測到低裂解活性。但-/-和+/+細(xì)胞之間的差異非常小。對位點(diǎn)2未能檢測到裂解活性。對位點(diǎn)3檢測到了裂解活性，但在-/-和+/+細(xì)胞之間沒有觀察到活性的差異。
為證明+/+抽提物和-/-抽提物之間活性的更大差異，對分化成肌管的肌細(xì)胞抽提物進(jìn)行了同樣的試驗(圖5)。特定地，理論上鈣蛋白酶3在肌管細(xì)胞中比在成肌細(xì)胞中的表達(dá)量高。
這一實驗可表明-/-細(xì)胞抽提物比+/+細(xì)胞抽提物對位點(diǎn)3的裂解活性更高，這是令人驚訝的，因為鈣蛋白酶3缺失是+/+細(xì)胞和-/-細(xì)胞間的唯一差異。因此，在鈣蛋白酶3缺失細(xì)胞中的活性降低就更有可能。
為試圖證明+/+和-/-細(xì)胞抽提物之間活性的更大差異，將同樣的反應(yīng)進(jìn)行了6小時而非1小時(圖6)。
+/+細(xì)胞抽提物和-/-細(xì)胞抽提物中對位點(diǎn)1和2的裂解活性更高。當(dāng)將反應(yīng)進(jìn)行6小時后也證明了對位點(diǎn)3活性的提高。在-/-細(xì)胞抽提物中的活性高于在+/+細(xì)胞抽提物中的活性。這些試驗可表明，當(dāng)所述試驗進(jìn)行6小時時，對位點(diǎn)3裂解活性的差異可使+/+和-/-細(xì)胞類型得以區(qū)分。
還對來自缺失或不缺失鈣蛋白酶3的小鼠肌肉溶胞產(chǎn)物進(jìn)行了上述活性試驗。對四頭肌溶胞產(chǎn)物也進(jìn)行了上述試驗(圖7)。
+/+組織抽提物比-/-組織抽提物對位點(diǎn)1和2的裂解活性更強(qiáng)。-/-組織抽提物比+/+組織抽提物對位點(diǎn)3的裂解活性更強(qiáng)。這些試驗表明用組織抽提物與用細(xì)胞抽提物試驗所得的結(jié)果相類似。具體說來，確定了不存在鈣蛋白酶3的抽提物對位點(diǎn)3有更強(qiáng)的活性。這一活性很可能是由于另一種蛋白酶的作用，其活性在該蛋白酶3不存在時被激活。
II細(xì)胞中鈣蛋白酶3的活性試驗A/材料和方法將寡核苷酸克隆到表達(dá)載體pTOM中原理將兩個互補(bǔ)的寡核苷酸放在一起以便形成相應(yīng)于鈣蛋白酶3自溶位點(diǎn)的雙鏈序列。通過下述方式篩選寡核苷酸，即，其配對在每一末端形成限制性位點(diǎn)。將這些片段克隆到已預(yù)先用限制性酶消化的表達(dá)載體pTOM中。
材料寡核苷酸位點(diǎn)1，位點(diǎn)2，位點(diǎn)3限制性內(nèi)切酶BamH1，BspE1，SmaI(BioLabs)；Ec1136II(Fermentas)所用的細(xì)菌菌株SCS110dam-StrR細(xì)菌(Stratagene)；XL1-Blue(Stratagene)。
質(zhì)粒載體pTOM(Généthon)(圖12)方法兩互補(bǔ)寡核苷酸間的雜交使在SYBR Green PCR緩沖液(Applied Biosystems)中終濃度為20ng/μl的兩種單鏈互補(bǔ)寡核苷酸彼此接觸。雜交在ABI Prism 7700設(shè)備(Applied Biosystems)中依照下述條件進(jìn)行95℃/1min→90℃/30sec→85℃/30sec→80℃/30sec→75℃/30sec→70℃/30sec→65℃/30sec→60℃/30sec→55℃/30sec。用SequenceDetector 1.6.3軟件隨時間追蹤配對的發(fā)展。
載體pTOM的消化將載體pTOM用兩種酶BamH1和BspE1分別在37℃下消化2小時。
將寡核苷酸連接到pTOM中在連接混合物中，插入物和載體的量的比率是3(摩爾比)。連接反應(yīng)在T4 DNA連接酶(BioLabs)存在下于16℃下反應(yīng)過夜。
制備電感受態(tài)細(xì)菌的方案接種310μl細(xì)菌的15ml LB+選擇試劑在20％甘油中貯存于-80℃。在37℃下振蕩培養(yǎng)8小時(約300rpm)。200ml LB+可能的選擇試劑接種2ml預(yù)培養(yǎng)物。使所述細(xì)菌生長到OD(600nm)＝0.5。
所有所用的材料都必須預(yù)冷到4℃。
將培養(yǎng)物在冰上放置15min，然后以25ml每管的比例分配(8管)。
4℃下4000rpm離心20min。
棄上清，輕輕地將所余的顆粒狀物取出到200ml冰水中(25ml每管-8管)，按上述條件離心。
棄上清，輕輕地將所余的顆粒狀物取出到100ml冰水中(兩兩合并試管、4管)，按上述條件離心。
小心地棄上清，將每一顆粒狀物取出到5ml 10％的甘油(經(jīng)高壓滅菌并貯存于-20℃)中，將4體積合并成一管；按上述條件離心。
棄上清，輕輕地將顆粒狀物取出到400μl 10％的甘油中。
40μl小份分配到eppendorf管中，于-80℃下冷凍。
感受態(tài)細(xì)菌的對照依照下述方案用對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所述細(xì)菌。轉(zhuǎn)化的載體的滴度應(yīng)高于每微克108菌落。
轉(zhuǎn)化方案將1μl連接的DNA(≈0.1ng)添加到40μl電感受態(tài)細(xì)菌，使其在冰上接觸4min。
將混合物置于電穿孔槽(Bviorad基因脈沖發(fā)射器杯；0.2cm)中。
電穿孔條件2500V，200ohm，25μF。
立即添加1ml SOC，在37℃下放置30min到1小時使所述基因表達(dá)以抵抗抗生素。
20μl和200μl錮于LB+終濃度為10μg/ml的卡那霉素平板中。使所述細(xì)菌在37℃下生長過夜。
對菌落的分析將所述菌落計數(shù)并在96-孔培養(yǎng)板中的100μl LB+終濃度為10μg/ml的卡那霉素中傳代培養(yǎng)。為證明菌落中有質(zhì)粒存在，用midEYFP.a和midECFP.m的配對或用下述的正向寡核苷酸之一與反向寡核苷酸midECFP.m形成的配對對這些克隆進(jìn)行PCRSFp94S1.a CCGGAAGTGGCACGAACATG用于位點(diǎn)1 每一寡核苷酸特異SFp94S2.a CCGGAAGTGGCGTGAGAAAT于一種克隆的雙鏈用于位點(diǎn)2 片段。它們集中于SFp94S3.a CCGGAAGTGGCATTGTTCCCBspEI限制性位點(diǎn)。
用于位點(diǎn)3將PCR產(chǎn)物上樣于含0.8％瓊脂糖+終濃度為0.5μg/ml溴化乙錠的凝膠上。為證明質(zhì)粒中存在插入片段，用寡核苷酸midECFP.m對一定數(shù)量的陽性克隆PCR產(chǎn)物測序。
2-真核細(xì)胞培養(yǎng)
所用的細(xì)胞系C2C12鼠成肌細(xì)胞；所用的培養(yǎng)基DMEMDulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(Gibco BRL)MEM非必需氨基酸溶液(Gibco BRL)FSC胎牛血清(Gibco BRL)用于911系的培養(yǎng)基DMEM+10％FCS+1％MEM用于Cos 7和C2C12系的培養(yǎng)基DMEM+10％FCS鈣蛋白酶的激活向培養(yǎng)基中添加終濃度6mM的CaCl2和終濃度為0.5μM的離子霉素(Calbiochem)。
3-將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中的方案材料依照QIAGEN EndoFree方法(ref.12362)制備多種質(zhì)粒DNA。
所用的質(zhì)粒pECFP-N1(Clontech)；pEYFP-C1(Clontech)。
方法第一天將所需的細(xì)胞胰蛋白酶化，在孔中接種細(xì)胞使其在接下來幾天中達(dá)到鋪滿50-80％。
第二天將無胎牛血清的94μl培養(yǎng)基置于第一無菌的聚苯乙烯管(T1)中。
向每個T1管中加入6μl FUGENE 6緩沖液。
在環(huán)境溫度下溫育5min。
將1-2μg EndoFree質(zhì)粒添加到第二無菌聚苯乙烯管(T2)中，加在管底。
在溫育5min結(jié)束時，所述的FUGENE 6(T1)緩沖液+培養(yǎng)基滴加到含有載體的T2管中。
在不攪拌的情況下，于環(huán)境溫度下溫育30min。
更換孔中的培養(yǎng)基。
30min后，將轉(zhuǎn)染混合物滴加到每一孔中，將滴加的混合物散布到整個孔表面。
使細(xì)胞在37℃/7％CO2中生長。
注示
對于每次轉(zhuǎn)染，均留有一個未與FUGENE 6接觸的孔(細(xì)胞對照)，以及一個其中的細(xì)胞僅與FUGENE 6接觸的孔(FUGENE 6毒性對照)。
B/結(jié)果為檢測活細(xì)胞中鈣蛋白酶3的蛋白水解活性，利用FRET現(xiàn)象研究三自溶位點(diǎn)的裂解。
為具有“FRET陽性”對照，即不能被鈣蛋白酶裂解且可在其中出現(xiàn)FRET現(xiàn)象的編碼ECFP-EYFP嵌合蛋白的質(zhì)粒，載體pTOM首先通過下述方式進(jìn)行修飾，即該載體中的兩熒光蛋白，增強(qiáng)的-CFP(ECFP)和增強(qiáng)的-YEP(EYEP)是同相的。將編碼鈣蛋白酶3三自溶位點(diǎn)的DNA片段插入到這些序列之間。然后我們證明了所產(chǎn)生的嵌合蛋白的確能在體外被遍在蛋白酶裂解。最后，在細(xì)胞中通過熒光影象分析在細(xì)胞中研究所述的裂解。用三種不同的方法進(jìn)行所述的分析，特別是FRET。
1-對照載體和帶有編碼所述裂解位點(diǎn)的DNA片段的載體的克隆編碼同相的兩熒光蛋白的載體的構(gòu)建構(gòu)建帶有編碼同相的ECFP和EYFP序列的載體(稱作pTOMp)的策略包括用兩種在pTOM中有獨(dú)特位點(diǎn)的限制性酶Ec1136II和SmaI消化質(zhì)粒pTOM產(chǎn)生平末端(圖8)。純化線性載體并使載體自連。在轉(zhuǎn)化和陽性菌落傳代培養(yǎng)后，通過PCR反應(yīng)確證所述質(zhì)粒存在于這些菌落中(圖9)。有約1/3經(jīng)傳代培養(yǎng)的菌落可得以擴(kuò)增，即其中應(yīng)當(dāng)包含載體pTOMp。用EcoRI對這些PCR產(chǎn)物進(jìn)行的消化，通過Ec1136II-SamI片段的排除消失的限制性位點(diǎn)，可以確證經(jīng)傳代培養(yǎng)的菌落確實含有質(zhì)粒pTOMp而非起始的質(zhì)粒。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序可以確證兩序列彼此間的確是同相的。
2-在表達(dá)載體pTOM中編碼可被鈣蛋白酶3裂解的位點(diǎn)的寡核苷酸的克隆為促進(jìn)兩蛋白EYFP和ECFP之間的FRET現(xiàn)象，在裂解位點(diǎn)兩端添加甘氨酸和絲氨酸以促進(jìn)兩蛋白聚在一起，甘氨酸可促進(jìn)嵌合蛋白的靈活性，絲氨酸可提高其在含水介質(zhì)中的溶解度(圖10)。寡核苷酸的序列是當(dāng)它們配對時在每一末端形成限制性位點(diǎn)BspE1和BamHI。
在寡核苷酸的序列中用粗體和下劃線標(biāo)示的堿基是不改變蛋白序列但不同于基因組序列的堿基。這些堿基是經(jīng)修飾以限制同源引物形成雙螺旋的，它們也可能妨礙雙鏈寡核苷酸的形成。也可使這種堿基修飾適應(yīng)在小鼠中密碼使用頻率。
用于克隆的限制性位點(diǎn)是獨(dú)特的位點(diǎn)。若克隆位點(diǎn)被甲基化可使BspE1酶失活。對準(zhǔn)備接受雙鏈寡核苷酸的載體pTOM的克隆可在編碼Dam甲基化酶的基因突變的細(xì)菌中進(jìn)行。在用BspE1和BamHI酶消化所述載體后，連接所述的寡核苷酸并進(jìn)行電穿孔，將一些抗性菌落取樣。用midECFP.m和特異于限制性位點(diǎn)的寡核苷酸進(jìn)行PCR可證明所述質(zhì)粒的存在(圖11)。
對由PCR所獲得的一些陽性克隆進(jìn)行測序可證明pTOM中的插入物的存在，這些插入物確實與編碼ECFP和EYFP的蛋白同相，且它們不含有任何突變。三個含有被克隆質(zhì)粒的菌落是保守的。這三個質(zhì)粒相應(yīng)于三個插入的DNA片段三個鈣蛋白酶3裂解位點(diǎn)(質(zhì)粒pTOMs1，pTOMs2和pTOMs3)(圖13)。
序列表<110>法國國家科學(xué)研究中心<120>在生物樣品中檢測鈣蛋白酶3活性的方法和實施該方法所用的肽<130>G143-B-18244 PCT<150>FR0108614<151>2001-06-29<160>14<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>7<212>PRT<213>設(shè)計的肽<400>1Asn Met Thr Tyr Gly Thr Ser1 5<210>2<211>7<212>PRT<213>設(shè)計的肽<400>2Asn Met Asp Asn Ser Leu Leu1 5<210>3<211>7<212>PRT<213>設(shè)計的肽<400>3Pro Val Gln Tyr Glu Thr Arg1 5
<210>4<211>12<212>PRT<213>設(shè)計的肽<400>4Val Ala Pro Arg Thr Ala Ala Glu Pro Arg Ser Pro1 5 10<210>5<211>12<212>PRT<213>設(shè)計的肽<400>5Gln Ser Lys Ala Thr Glu Ala Gly Gly Gly Asn Pro1 5 10<210>6<211>12<212>PRT<213>設(shè)計的肽<400>6Val Ala Pro Arg Thr Gly Ala Glu Pro Arg Ser Pro1 5 10<210>7<211>12<212>PRT<213>設(shè)計的肽<400>7Gln Gly Lys Thr Thr Glu Ala Gly Gly Gly His Pro1 5 10<210>8<211>10<212>PRT<213>設(shè)計的肽
<400>8Asn Pro Tyr Leu Leu Pro Gly Phe Phe Cys1 5 10<210>9<211>9<212>PRT<213>設(shè)計的肽<400>9Thr Ile Ser Val Asp Arg Pro Val Pro1 5<210>10<211>13<212>PRT<213>設(shè)計的肽<400>10Arg Glu Val Thr Ile Pro Pro Lys Tyr Arg Glu Leu Leu1 5 10<210>11<211>13<212>PRT<213>設(shè)計的肽<400>11Lys Glu Gly Thr Ile Pro Pro Glu Tyr Arg Lys Leu Leu1 5 10<210>12<211>14<212>PRT<213>設(shè)計的肽<400>12Pro Val Ser Arg Glu Glu Lys Pro Thr Ser Ala Pro Ser Ser
1 510<210>13<211>14<212>PRT<213>設(shè)計的肽<400>13Pro Val Ser Arg Glu Glu Lys Pro Ser Ser Ala Pro Ser Ser1 5 10<210>14<211>11<212>PRT<213>設(shè)計的肽<400>14Lys Ser Thr Val Leu Gln Gln Gln Tyr Asn Arg1 5 10
權(quán)利要求
1.與至少一種熒光或發(fā)光報道分子相偶聯(lián)的肽，其特征在于，它包含至少一種能被鈣蛋白酶3或鈣蛋白酶3的同工型裂解的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的肽，其特征在于其包含至少一個鈣蛋白酶3或鈣蛋白酶3的同工型的自溶位點(diǎn)，所述氨基酸的數(shù)量小于10。
3.如權(quán)利要求2所述的肽，其特征在于所述鈣蛋白酶3的自溶位點(diǎn)的氨基酸序列選自下述的序列NMTYGTS(SEQ ID 1)，NMDNSLL(SEQID 2)和PVQYETR(SEQ ID 3)。
4.如權(quán)利要求2所述的肽，其特征在于所述鈣蛋白酶3的自溶位點(diǎn)的氨基酸序列選自下述的序列VAPRTA AEPRSP(SEQ ID 4)，QSKATEAGGGNP(SEQ ID 5)，和下述的鼠序列VAPRTG AEPRSP(SEQ ID 6)，QGKTTE AGGGHP(SEQ ID 7)。
5.如權(quán)利要求2所述的肽，其特征在于所述自溶位點(diǎn)的氨基酸序列來自稱作Lp82的鈣蛋白酶3的同工型，并選自下述的氨基酸序列NPYLLPGFFC(SEQ ID 18)和TISVDRPVP(SEQ ID 19)。
6.如權(quán)利要求1所述的肽，其特征在于所述的可被鈣蛋白酶3或鈣蛋白酶3的同工型裂解的序列來自底物蛋白，并且選自下述序列REVTIPPKYRELL(SEQ ID 10)，KEGTIPPEYRKLL(SEQ ID 11)，PVSREEKPTSAPSS(SEQ ID 12)，PVSREEKPSSAPSS(SEQ ID 13)，KSTVLQQQYNR(SEQ ID 14)。
7.如權(quán)利要求1所述的肽，其特征在于所述的肽是用鈣蛋白酶3或鈣蛋白酶3的同工型篩選肽文庫所獲得的。
8.如權(quán)利要求1所述的肽，其特征在于所述的肽的兩端都具有合成的熒光報道分子，分別是MCA(供體分子)和Dnp(受體分子)。
9.如權(quán)利要求1所述的肽，其特征在于所述的報道分子是蛋白。
10.如權(quán)利要求9所述的肽，其特征在于其兩端都帶有突變的GFP。
11.如權(quán)利要求10所述的肽，其特征在于所述的突變的GFP分別是CFP和YFP。
12.編碼如權(quán)利要求1所述的肽的DNA序列。
13.包含如權(quán)利要求12所述DNA序列和誘導(dǎo)該DNA序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的載體。
14.用如權(quán)利要求13所述的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
15.在體外檢測生物樣品中鈣蛋白酶3或鈣蛋白酶3的同工型活性的方法，該方法包括-第一步，將生物樣品與權(quán)利要求1所述的肽相接觸，-第二步，通過測定顯色或熒光反應(yīng)強(qiáng)度檢測是否存在由鈣蛋白酶或鈣蛋白酶的同工型對所述肽進(jìn)行的裂解。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于在第一步中包括用如權(quán)利要求13所述的載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于在第一步中包括使如權(quán)利要求1中所述的肽與細(xì)胞抽提物或組織切片相接觸。
18.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于所述肽的兩端分別具有熒光供體分子和熒光受體分子，通過FRET測定熒光反應(yīng)的強(qiáng)度。
19.權(quán)利要求15所述的方法在體外診斷LGMD 2A中的應(yīng)用。
20.篩選激活或抑制鈣蛋白酶3或鈣蛋白酶3的同工型的物質(zhì)的方法，所述的方法包括-制備用所述物質(zhì)處理的生物樣品，-然后將經(jīng)上述處理的樣品與權(quán)利要求1所述的肽相接觸，-檢測顯色或熒光反應(yīng)存在與否，分別表明可激活或抑制鈣蛋白酶3或鈣蛋白酶3同工型的物質(zhì)的存在與否。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于所述肽的兩端分別具有熒光供體分子和熒光受體分子，通過FRET測定熒光反應(yīng)的強(qiáng)度。
22.篩選激活或抑制鈣蛋白酶3或鈣蛋白酶3的同工型的物質(zhì)的方法，所述的方法包括-制備包含如權(quán)利要求1所述肽的生物樣品，-將所述樣品與待鑒定的物質(zhì)相接觸，-檢測顯色或熒光反應(yīng)存在與否，分別表明可激活或抑制鈣蛋白酶3或鈣蛋白酶3同工型的物質(zhì)的存在與否。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于所述肽的兩端分別具有熒光供體分于和熒光受體分于，通過FRET測定熒光反應(yīng)的強(qiáng)度，包括a/制備含有所述肽的生物樣品，b/測定不存在能激活或抑制鈣蛋白酶3或鈣蛋白酶3同工型的物質(zhì)時FRET的量，c/使含有所述肽的生物樣品與能激活或抑制鈣蛋白酶3或鈣蛋白酶3同工型的物質(zhì)相接觸，d/測定在存在能激活或抑制鈣蛋白酶3或鈣蛋白酶3同工型的物質(zhì)時FRET的量，e/作出存在下述物質(zhì)的結(jié)論如果在b/步驟中測定的FRET的量高于在d/步驟中測定的FRET的量則存在激活物質(zhì)；如果在b/步驟中測定的FRET的量等于在d/步驟中測定的FRET的量則存在抑制物質(zhì)。
24.分析轉(zhuǎn)移鈣蛋白酶3基因效率的方法，該方法包括-首先用鈣蛋白酶3基因轉(zhuǎn)染動物或人細(xì)胞，-然后使經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與如權(quán)利要求1所述的肽在體外相接觸，-再測定顯色或熒光反應(yīng)的強(qiáng)度。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于所述肽的兩端分別具有熒光供體分子和熒光受體分子，通過FRET測定熒光反應(yīng)的強(qiáng)度。
全文摘要
本發(fā)明涉及與至少一種熒光或生色的(colorgenic)報道分子相偶聯(lián)的肽，其特征在于它包含至少一種能被鈣蛋白酶3裂解的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及體外檢測生物樣品中鈣蛋白酶3活性的方法。
文檔編號C07K19/00GK1514878SQ02805730
公開日2004年7月21日 申請日期2002年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月29日
發(fā)明者I·里查德, G·西倫, I 里查德 申請人:吉尼索恩, 法國國家科學(xué)研究中心