博落回中參與血根堿與白屈菜紅堿合成的甲基轉(zhuǎn)移酶基因及其應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了博落回中參與血根堿與白屈菜紅堿合成的甲基轉(zhuǎn)移酶基因及其應(yīng)用。首次在博落回基因組中發(fā)現(xiàn)6個(gè)參與血根堿與白屈菜紅堿合成的甲基轉(zhuǎn)移酶基因，包括Mc2833、Mc769、Mc8567、Mc833、Mc830、Mc9487基因。利用釀酒酵母體系驗(yàn)證通過(guò)上游前體飼喂分別驗(yàn)證了這幾步反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)血根堿與白屈菜紅堿中間體的合成。本發(fā)明進(jìn)一步揭示了血根堿在博落回中合成的分子機(jī)制，為高血根堿與白屈菜紅堿含量博落回育種提供了理論依據(jù)和分子輔助育種目標(biāo)；同時(shí)為血根堿與白屈菜紅堿的體外人工合成提供了寶貴經(jīng)驗(yàn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
博落回中參與血根堿與白屈菜紅堿合成的甲基轉(zhuǎn)移酶基因及 其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及博落回中參與血根堿與 白屈菜紅堿合成的甲基轉(zhuǎn)移酶基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 血根堿和白屈菜紅堿主要分布在血根(Sanguinaria canadensis L.)、鴉片罌粟 (Papaver somnif erum L ·)、花菱草（Eschscho lz ia californica Cham·)、白屈菜 (Chelidonium majus)、紫堇（Corydalis edulis Maxim)和博落回（Macleaya cordata (Willd.)R.Br.)當(dāng)中。最近二十年以來(lái)，血根堿已經(jīng)在歐洲作為替代抗生素的添加劑來(lái)促 進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。目前博落回是全世界最主要的血根堿的來(lái)源植物，并且被歐洲食品安全局列 為動(dòng)物飼用添加劑。血根堿和白屈菜紅堿的合成路徑在前期研究中已經(jīng)得到闡明。相關(guān)合 成基因已經(jīng)從鴉片罌粟（Papaver somniferum L·)、花菱草（Eschscholzia californica Cham.)、等植物中克隆，但是尚未有任何基因從博落回中克隆。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供參與博落回血根堿和白屈菜紅堿合成的甲基轉(zhuǎn)移酶基因及 其應(yīng)用。
[0004] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供博落回中參與血根堿與白屈菜紅堿合成的甲基 轉(zhuǎn)移酶基因，包括基因12833、]^769、]^8567、]\^833、]\^830、]\^9487，它們的基因序列分別 如SEQ ID No .1-6所示。
[0005] 所述的博落回中參與血根堿與白屈菜紅堿合成的甲基轉(zhuǎn)移酶基因編碼的蛋白，它 們的氨基酸序列分別如SEQ IDNo.7-12所示。
[0006] 本發(fā)明還提供含有上述基因的載體，含有上述基因的工程菌。
[0007] 還有上述基因在血根堿與白屈菜紅堿合成中的應(yīng)用，以及上述基因在血根堿與白 屈菜紅堿體外合成中的應(yīng)用。具體應(yīng)用如下：
[0008] 基因 MC2833編碼博落回中催化去甲烏藥堿生成烏藥堿的6-0-甲基轉(zhuǎn)移酶，以及博 落回中催化羥基-N-甲基烏藥堿生成網(wǎng)狀番荔枝堿的4-0-甲基轉(zhuǎn)移酶；
[0009] 基因 Mc833和Mc830編碼博落回中催化刺罌粟堿生成Cis-N-甲基刺罌粟堿以及催 化四氫小檗堿生成cis-N-甲基四氫小檗堿的四氫化小檗堿cis-N-甲基轉(zhuǎn)移酶；
[0010]基因 Mc9487編碼博落回中催化金黃紫堇堿生成四氫非洲防己堿的金黃紫堇堿-9-〇-甲基轉(zhuǎn)移酶；
[0011] 基因 Mc8567和Mc769編碼博落回中催化烏藥堿生成N-甲基烏藥堿的烏藥堿-N-甲 基轉(zhuǎn)移酶。
[0012] 在之前的研究中，血根堿與白屈菜紅堿的合成途徑在罌粟等其它物種中已經(jīng)清 晰，血根堿與白屈菜紅堿從去甲烏藥堿開(kāi)始均經(jīng)過(guò)12步反應(yīng)合成(包括1步不需要酶參與的 自發(fā)反應(yīng)）。其中第1步到第5步反應(yīng)2者的合成酶相同以及第8到第12步反應(yīng)2者的合成酶相 同。為了找到博落回中合成血根堿與白屈菜紅堿甲基轉(zhuǎn)移酶合成基因，我們對(duì)博落回植株 進(jìn)行De Novo全基因組測(cè)序分析，同時(shí)對(duì)博落回根莖葉花果實(shí)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。首先以其 他物種（罌粟，花菱草）中合成血根堿和白屈菜紅堿的通路中甲基轉(zhuǎn)移酶為參照基因，在博 落回基因組中進(jìn)行BLAST同源比對(duì)，找到了 11個(gè)合成血根堿與白屈菜紅堿的候選基因。由于 博落回中的血根堿和白屈菜紅堿具有組織特異性，2種生物堿均在果莢中含量最高，而兩種 生物堿的重要前體化合物原阿片堿和別隱品堿在根部中含量最高，而在莖部組織中生物堿 含量極低。因此我們推測(cè)參與合成血根堿與白屈菜紅堿的功能基因在博落回中的表達(dá)規(guī)律 也葉應(yīng)該是根和果莢中高表達(dá)，莖中不表達(dá)或者表達(dá)量極低。根據(jù)這種組織表達(dá)特異性，我 們從11個(gè)候選基因中共篩選出6個(gè)符合這種表達(dá)規(guī)律的基因。然后，我們利用酵母表達(dá)體 系，在酵母中表達(dá)這些候選基因，通過(guò)分別飼喂每步的上游化合物，再用UPLC-Q-T0F儀來(lái)檢 測(cè)酵母提取物。
[0013] 首先，我們先對(duì)血根堿與白屈菜紅堿通路中的甲基轉(zhuǎn)移酶候選基因進(jìn)行驗(yàn)證，在 通路中共有6步反應(yīng)屬于甲基轉(zhuǎn)移酶參與的步驟，篩選出的6個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶基因，分別是 Mc8567、Mc833、Mc830、Mc769、Mc2833、Mc9487。我們分別構(gòu)建好表達(dá)這6個(gè)基因的酵母后分 別前體飼喂這6步反應(yīng)的前體化合物去甲烏藥堿、烏藥堿、羥基-N-甲基烏藥堿、刺罌粟堿、 金黃紫堇堿、四氫小檗堿。之后我們通過(guò)UPLC-Q-T0F檢測(cè)酵母提取物發(fā)現(xiàn)在飼喂去甲烏藥 堿的表達(dá)Mc2833的酵母提取物中檢測(cè)到了下游產(chǎn)物烏藥堿，而在空白對(duì)照酵母組中沒(méi)有檢 測(cè)到下游產(chǎn)物。因此我們認(rèn)為Mc2833為博落回中催化去甲烏藥堿生成烏藥堿的6-0-甲基轉(zhuǎn) 移酶(Mc60MT)。而Mc2833不但能催化去甲烏藥堿還能催化羥基-N-甲基烏藥堿生成網(wǎng)狀番 荔枝堿，因此我們認(rèn)為Mc2833同時(shí)也是博落回中催化羥基-N-甲基烏藥堿生成網(wǎng)狀番荔枝 堿的4-0-甲基轉(zhuǎn)移酶(Mc40MT)。證明該基因是一個(gè)多功能甲基轉(zhuǎn)移酶，具有催化血根堿合 成途徑中兩個(gè)底物并生成不同產(chǎn)物的功能。通過(guò)此方法，我們還證明了 Mc833和Mc830都是 博落回中催化刺罌粟堿生成cis-N-甲基刺罌粟堿以及催化四氫小檗堿生成cis-N-甲基四 氫小檗堿的四氫化小檗堿ci s-N-甲基轉(zhuǎn)移酶(TOMT)。除此以外，還證實(shí)Mc9487是博落回中 催化金黃紫堇堿生成四氫非洲防己堿的金黃紫堇堿-9-0-甲基轉(zhuǎn)移酶（SMT)，Mc8567和 Mc769是博落回中催化烏藥堿生成N-甲基烏藥堿的烏藥堿-N-甲基轉(zhuǎn)移酶(CNMT)。
[0014] 本發(fā)明首次在博落回基因組中發(fā)現(xiàn)參與血根堿與白屈菜紅堿合成的6個(gè)甲基轉(zhuǎn)移 酶基因，包括Mc2833、Mc769、Mc8567、Mc833、Mc830、Mc9487。利用酵母體系驗(yàn)證了血根堿和 白屈菜紅堿合成中甲基轉(zhuǎn)移酶參與的6步反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)血根堿和白屈菜紅堿的合成。本發(fā)明 進(jìn)一步揭示了博落回中血根堿合成的分子機(jī)制，為高含量血根堿和白屈菜紅堿博落回育種 提供了理論依據(jù)和分子輔助育種目標(biāo)，可用于大規(guī)模篩選育種材料；同時(shí)還為血根堿和白 屈菜紅堿的體外人工合成提供了寶貴經(jīng)驗(yàn)，本發(fā)明可替代傳統(tǒng)的從植物材料中提取血根堿 的方法，實(shí)現(xiàn)體外合成血根堿。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1為血根堿與白屈菜紅堿合成通路圖，兩個(gè)化合物有部分合成通路相同，而本發(fā) 明研究是從中間產(chǎn)物烏藥堿開(kāi)始研究，箭頭上分別標(biāo)出甲基轉(zhuǎn)移酶參與的步驟共6步反應(yīng)；
[0016] 圖2為本發(fā)明通過(guò)分析博落回甲基轉(zhuǎn)移酶候選基因的RNA-Seq數(shù)據(jù)的表達(dá)規(guī)律，篩 選博落回中血根堿與白屈菜紅堿甲基轉(zhuǎn)移酶候選基因；
[0017] 圖3為本發(fā)明利用UPLC-Q-T0F檢測(cè)表達(dá)MC2833酵母與空白酵母提取物中參與血根 堿與白屈菜紅堿合成第1步反應(yīng)，即去甲烏藥堿至烏藥堿的結(jié)果；
[0018] 圖4為本發(fā)明利用UPLC-Q-T0F檢測(cè)表達(dá)Mc769和MC8567酵母與空白酵母提取物中 參與血根堿與白屈菜紅堿合成第2步反應(yīng)，即烏藥堿至N-甲基烏藥堿的結(jié)果；
[0019] 圖5為本發(fā)明利用UPLC-Q-T0F檢測(cè)表達(dá)MC2833酵母與空白酵母提取物中參與血根 堿與白屈菜紅堿合成第4步反應(yīng)，即3-羥基-N-甲基烏藥堿至網(wǎng)狀番荔枝堿的結(jié)果；
[0020] 圖6為本發(fā)明利用UPLC-Q-T0F檢測(cè)表達(dá)Mc833、Mc830酵母與空白酵母提取物中參 與血根堿合成第8步反應(yīng)即刺罌粟堿至N-甲基刺罌粟堿的結(jié)果，以及白屈菜紅堿合成第15 步反應(yīng)即四氫小檗堿至cis-N-甲基四氫小檗堿的結(jié)果。
[0021] 圖7為本發(fā)明利用UPLC-Q-T0F檢測(cè)表達(dá)MC9487酵母與空白酵母提取物中參與白屈 菜紅堿合成第6步反應(yīng)即金黃紫堇堿至四氫非洲防己堿的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0022]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例 中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0023] 實(shí)施例1參與血根堿與白屈菜紅堿合成基因的挖掘與獲得
[0024] 1基因的挖掘
[0025] 由于血根堿與白屈菜紅堿在罌粟和花菱草等植物中的合成路徑已知（圖1 )，相關(guān) 的功能基因也已經(jīng)得到克隆。我們以其他物種（罌粟、花菱草）已公開(kāi)在NCBI的血根堿與白 屈菜紅堿的甲基轉(zhuǎn)移酶基因序列為參照基因，在博落回DeNovo全基因組序列中進(jìn)行BLAST 比對(duì)，共得到候選基因11條。又由于血根堿與白屈菜紅堿在果莢中含量極高，莖中含量極 低。前體化合物原阿片堿與別隱品堿在根部含量極高，莖中含量極低。以此為線索，分析博 落回根莖葉花果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(RNA-Seq)從11條候選基因中篩選符合根部和果莢高表達(dá)，莖 部不表達(dá)這一表達(dá)模式的基因，共得到6條（圖2)。分別是Mc8567、Mc833、Mc830、Mc769、 Mc2833、Mc9487。
[0026] 2 博落回 Mc8567、Mc833、Mc830、Mc769、Mc2833、Mc9487基因的獲得。
[0027] 首先制備博落回根部和果莢cDNA文庫(kù)，然后利用正向引物和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增（引物序列見(jiàn)表1)。
[0028] 表1引物序列（5:30
[0029]
[0031] PCR反應(yīng)體系以20μ1計(jì)為：10-20ngAU模板ΙμL，lOpmol/μΙ正向、反向引物各ΙμL， 10mmol/L dNTP mix 0·4μ1，0·5υ/μL高保真Taq DNA聚合酶lyl，10XPCR反應(yīng)緩沖液2μ1，余 量為水。
[0032] PCR 反應(yīng)條件為：94 °C 5 分鐘；94 °C 20 秒，55 °C 20 秒，72 °C 2 分 30 秒，35 個(gè)循環(huán)；72 °C 10 分鐘。
[0033]將擴(kuò)增得到的片段與pYES2載體(Invitrogen)連接，測(cè)序確認(rèn)沒(méi)有突變。
[0034]實(shí)施例2利用酵母表達(dá)系統(tǒng)驗(yàn)證血根堿與白屈菜紅堿合成候選基因的功能
[0035] 將 Mc8567、Mc833、Mc830、Mc769、Mc2833、Mc9487基因分別構(gòu)建到表達(dá)載體pYES2 (Invitrogen)上，并轉(zhuǎn)化酵母菌。誘導(dǎo)酵母表達(dá)蛋白，然后進(jìn)行前體飼喂收集酵母。裂解后 用甲醇抽提化合物。樣品制備好后用UPLC-Q-T0F進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果分別如圖3-圖7所示。
[0036] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0037] 序列說(shuō)明：
[0038] SEQ ID 吣.1-6分別為12833、]\^769、]\^8567、]\^833、]\^830、]\^9487、基因序列。
[0039] SEQ ID 如.7-12分別為基因齔2833、]\^769、]\^8567、]\^833、]\^830、]\^9487編碼的 氨基酸序列。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 博落回中參與血根堿與白屈菜紅堿合成的甲基轉(zhuǎn)移酶基因，包括基因MC2833、 Mc769、Mc8567、Mc833、Mc830、Mc9487，它們的氨基酸基因序列分別如SEQ ID No. 1-6所示。2. 權(quán)利要求1所述的博落回中參與血根堿與白屈菜紅堿合成的甲基轉(zhuǎn)移酶基因編碼的 蛋白，它們的氨基酸序列分別如SEQ ID No.7-12所示。3. 含有權(quán)利要求12所述基因的載體。4. 含有權(quán)利要求12所述基因的工程菌。5. 權(quán)利要求12所述基因在血根堿與白屈菜紅堿合成中的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求12所述基因在血根堿與白屈菜紅堿體外合成中的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于， 基因Mc2833編碼博落回中催化去甲烏藥堿生成烏藥堿的6-0-甲基轉(zhuǎn)移酶，以及博落回 中催化羥基-N-甲基烏藥堿生成網(wǎng)狀番荔枝堿的4-0-甲基轉(zhuǎn)移酶； 基因Mc833和Mc830編碼博落回中催化刺罌粟堿生成cis-N-甲基刺罌粟堿以及催化四 氫小檗堿生成cis-N-甲基四氫小檗堿的四氫化小檗堿cis-N-甲基轉(zhuǎn)移酶； 基因Mc9487編碼博落回中催化金黃紫堇堿生成四氫非洲防己堿的金黃紫堇堿-9-0-甲 基轉(zhuǎn)移酶； 基因Mc8567和Mc769編碼博落回中催化烏藥堿生成N-甲基烏藥堿的烏藥堿-N-甲基轉(zhuǎn) 移酶。
【文檔編號(hào)】C12N1/19GK106085981SQ201610507690
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月30日
【發(fā)明人】曾建國(guó), 黃鵬, 卿志星
【申請(qǐng)人】湖南美可達(dá)生物資源有限公司