一種黃緣盒龜糞便提取dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種黃緣盒龜糞便提取DNA的方法，屬于DNA分離純化技術(shù)領(lǐng)域。將黃緣盒龜糞便作為樣品采集后，立即裝入滅過菌的離心管中，用DETs浸泡；離心管中，加入二硫蘇糖醇裂解液，裂解液與糞便混勻后水浴處理；加入蛋白酶K（PK）定量后，冰上靜置；離心，取上清至另一無菌離心管中，棄沉淀；向上清中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混合液抽提；加入NaAc在旋渦混合器上混勻后，再加入預(yù)冷的無水乙醇，充分混勻后靜置；再次離心，吸棄上清，沉淀在室溫中涼干；加入乙醇，重新洗滌沉淀；室溫晾干，當(dāng)沉淀趨于透明時加入TE溶解。將發(fā)明應(yīng)用于黃緣盒龜DNA提取，具有操作便捷、黃緣盒龜損傷小等優(yōu)點。
【專利說明】
一種黃緣盒龜糞便提取DNA的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種黃緣盒龜糞便提取DNA的方法，屬于DNA分離純化技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃緣盒龜（Cistoclemmys flavomarginata,Yellow-margined Box Turtle)隸屬 于龜鱉目（Testudinata)、淡水龜科(Geoemydidae)、盒龜屬（Cistoclemmys)。因其背甲緣盾 腹部黃色，眼眶上有一條金黃色條紋，故得名。黃緣盒龜在我國主要分布于浙江、安徽、福 建、江蘇、河南、廣西、廣東、臺灣等地，鄰國日本也有分布。我省主要分布在臨安、建德、安 吉、龍游、天臺、新昌等地。由于黃緣盒龜為龜中珍品，是高級的滋補品，其藥用價值較高，還 具有較大的觀賞價值。近年來，由于人為過渡捕捉，野生黃緣盒龜資源及其棲息地受到嚴(yán)重 破壞，野生數(shù)量急劇減少。1998年該種群已被列入國家珍稀瀕危動物，2006年被聯(lián)合國列為 瀕危級動物種群（IUCN，2006)。除人為因素以外，由于野生黃緣盒龜生長緩慢，加之，全球氣 候變暖以及惡劣反常天氣的頻繁出現(xiàn)，使其交配環(huán)境、孵化條件等與最適條件有了不小的 差距，所以性成熟后產(chǎn)卵量極少，受精率、孵化率及成活率均極低，并且對其性別分化等也 產(chǎn)生了較大影響，導(dǎo)致野生種群瀕臨滅絕。
[0003] 目前，對我省野生黃緣盒龜?shù)姆N質(zhì)資源調(diào)查，以及與臨近省份野生種群親緣關(guān)系 分析鑒定尚未有效開展，對黃緣盒龜擬生態(tài)馴養(yǎng)繁殖開展尚處于探索階段。我省已有幾家 養(yǎng)殖企業(yè)開始試探性養(yǎng)殖黃緣盒龜，但由于黃緣盒龜生長周期長，純系和雜交龜在稚龜期 差異較小，養(yǎng)殖6-8年后珍品黃緣盒龜性狀才能顯現(xiàn)，從而產(chǎn)生了較大的養(yǎng)殖風(fēng)險。傳統(tǒng)用 于DNA提取的樣本主要來源于血液或組織塊，但是對于野生瀕危動物，取血和獲取組織塊都 對動物本身具有傷害并有可能帶來疾病感染，對其生存具有一定的隱患。
[0004] 基于此，做出本申請。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有黃緣盒龜鑒定所存在的上述缺陷，本申請?zhí)峁┮环N簡便易行、操作 方便、無需離體解剖的黃緣盒龜糞便提取DNA的方法。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本申請采取的技術(shù)方案如下：
[0007] -種黃緣盒龜糞便提取DNA的方法，包括如下步驟：（1)將黃緣盒龜糞便作為樣品 采集后，立即裝入滅過菌的離心管中，用DETs(DMS0/EDTA/Tris鹽溶液)浸泡；（2)取上述浸 泡中的糞便于離心管中，加入二硫蘇糖醇(DTT)裂解液，裂解液與糞便混勻后水浴處理；（3) 加入蛋白酶K(PK)定量后，立即放入冰上靜置；（4)離心，取上清至另一無菌離心管中，棄沉 淀；向上清中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混合液抽提；（5)加入NaAc在旋渦混合器上混勻 后，再加入預(yù)冷的無水乙醇，充分混勻后靜置；（6)再次離心，吸棄上清，沉淀在室溫中涼干；
[7] 加入體積濃度70 %乙醇，重新洗滌沉淀；（8)室溫晾干，當(dāng)沉淀趨于透明時加入TE溶解。
[0008] 進一步的，作為優(yōu)選：
[0009] 步驟（1)中，樣品自采集到用于步驟(2)及其后續(xù)步驟的DNA提取常溫保存90天~ 120 天。
[0010] 步驟（2)中，裂解液構(gòu)成為：1 OOmmo 1 /LTr i s-HCl，pH8，1 · 4mo 1 /LNaCl，20mmo 1 / LEDTA,0.4mol/L DTT〇
[0011] 步驟(2)中，水浴溫度為40~60°C，水浴時間1-4小時。
[0012] 步驟(3)中，加入蛋白酶K定量后于50-55°C下處理5~15分鐘后，于冰上靜置5~15 分鐘。
[0013]步驟⑷中，酸/氯仿/異戊醇混合液中，酚:氯仿:異戊醇=25:24:1 (體積比）。
[0014] 步驟(5)中，NaAc濃度為1.5~5mol/L，添加量為步驟⑷處理后溶液體積的0.1~ 〇. 3倍;無水乙醇的添加量為添加 NaAc后溶液體積的1~3倍;混勻后于-10~-30°C下靜置 0.5~1小時。
[0015] 通過本申請技術(shù)方案的實施，通過收集評價野生黃緣盒龜種質(zhì)資源，采用"排泄 物"取樣方式，這種方式可在不傷害甚至不必見到動物的情況下，利用這些樣品提取動物 DNA并進行PCR擴增，再利用mtDNA，PCR等遺傳學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)，建立黃緣盒龜種質(zhì)分子 鑒定分析方法，實現(xiàn)在不影響野生種群分布的前提下探明黃緣盒龜野生資源現(xiàn)狀，所建立 的黃緣盒龜種質(zhì)分子鑒定方法，有利于探明野生黃緣盒龜種質(zhì)資源，并通過對野生黃緣盒 龜?shù)纳?、交配、繁育等條件調(diào)查，構(gòu)建黃緣盒龜擬生態(tài)馴養(yǎng)繁殖體系，從而進行生物個體 遺傳信息的分析;最終有效的保護這一瀕危物種，為保護物種多樣性，也為中醫(yī)藥自然資源 的可持續(xù)利用提供途徑。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本申請的瓊脂糖核酸電泳檢測譜圖。
【具體實施方式】 [0017] 實施例！
[0018] 糞便樣品在采集后立即裝入滅過菌的離心管中，用DETs(DMSO/EDTA/Tris鹽溶液） 浸泡，常溫保持90天，待用。
[0019] 1)取100mg上述糞便于lmL離心管中，加入lmL二硫蘇糖醇(DTT)裂解液，混勻后40 °C水浴4h，其中裂解液構(gòu)成為：100mmol/LTris-HCl，pH=8,1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA， 0.4mol/L DTT；
[0020] 2)加入蛋白酶 K(PK)至 0.0211^，55°(：，1〇11^11，立即放入冰上1511^11。
[0021 ] 3)12000g離心5min，取上清至另一無菌1.5mL離心管中，棄沉淀。向上清中加入等 體積酚:氯仿:異戊醇為25:24:1的混合物抽提；
[0022] 4)加入0.15倍體積的1.5mol/LNaAc，在旋渦混合器上混勻后加入2倍體積(加入鹽 之后計算的體積)預(yù)冷的無水乙醇，充分混勻后-1 〇 °C放置0.5h~lh;
[0023] 5)12000r/min離心10min，吸棄上清，沉淀在室溫中涼干；
[0024] 6)加入500yL70 %乙醇重新洗滌沉淀2次；
[0025] 7)室溫晾干，當(dāng)沉淀趨于透明時加入lOOyLTE溶解。
[0026] 實施例2
[0027] 糞便樣品在采集后立即裝入滅過菌的離心管中，用DETs(DMS0/EDTA/Tris鹽溶液） 浸泡，常溫保持100天，待用。
[0028] 1)取100mg上述糞便于lmL離心管中，加入lmL二硫蘇糖醇(DTT)裂解液，混勻后45 °C水浴3h，其中裂解液構(gòu)成為：100mmol/LTris-HCl，pH=8,1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA， 0.4mol/L DTT；
[0029] 2)加入蛋白酶K(PK)至0.02mg，50°C，15min，立即放入冰上5min。
[0030] 3)12000g離心5min，取上清至另一無菌1.5mL離心管中，棄沉淀。向上清中加入等 體積酚:氯仿:異戊醇為25:24:1的混合物抽提；
[0031] 4)加入0.2倍體積的4mol/LNaAc，在旋渦混合器上混勻后加入2倍體積（加入鹽之 后計算的體積)預(yù)冷的無水乙醇，充分混勻后-20 °C放置0.5h~lh;
[0032] 5)12000r/min離心10min，吸棄上清，沉淀在室溫中涼干；
[0033] 6)加入500yL70%乙醇重新洗滌沉淀2次；
[0034] 7)室溫晾干，當(dāng)沉淀趨于透明時加入lOOyLTE溶解。
[0035] 實施例3
[0036] 糞便樣品在采集后立即裝入滅過菌的離心管中，用DETs(DMS0/EDTA/Tris鹽溶液） 浸泡。
[0037] 1)取100mg上述浸泡的糞便于lmL離心管中，加入lmL二硫蘇糖醇(DTT)裂解液，裂 解液（l〇〇mmol/LTris-HCl，pH=8，1 ·4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA，0 · 4mol/L DTT)，混勻后55 °C水浴2h;
[0038] 2)加入蛋白酶K(PK)至0.02mg，50°C，8min，立即放入冰上lOmin。
[0039] 3)12000g離心5min，取上清至另一無菌1.5mL離心管中，棄沉淀。向上清中加入等 體積酚:氯仿:異戊醇為25:24:1的混合物抽提；
[0040] 4)加入0.1倍體積的3mol/LNaAc，在旋渦混合器上混勻后加入1.5倍體積(加入鹽 之后計算的體積)預(yù)冷的無水乙醇，充分混勻后-20 °C放置0.5h~lh;
[0041 ] 5)12000r/min離心10min，吸棄上清，沉淀在室溫中涼干；
[0042] 6)加入500yL70%乙醇重新洗滌沉淀2次；
[0043] 7)室溫晾干，當(dāng)沉淀趨于透明時加入1 OOyLTE溶解。
[0044] 實施例4
[0045] 糞便樣品在采集后立即裝入滅過菌的離心管中，用DETs(DMS0/EDTA/Tris鹽溶液） 浸泡，常溫保持120天，待用。
[0046] 1)取100mg上述奠便于lmL離心管中，加入lmL二硫蘇糖醇(DTT)裂解液，混勾后60 °C水浴lh，其中裂解液構(gòu)成為：100mmol/LTris-HCl，pH=8,1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA， 0.4mol/L DTT；
[0047] 2)加入蛋白酶K(PK)至0.02mg，55°C，5min，立即放入冰上lOmin。
[0048] 3)12000g離心5min，取上清至另一無菌1.5mL離心管中，棄沉淀。向上清中加入等 體積酚:氯仿:異戊醇為25:24:1的混合物抽提；
[0049] 4)加入0.3倍體積的5mol/LNaAc，在旋渦混合器上混勻后加入3倍體積（加入鹽之 后計算的體積)預(yù)冷的無水乙醇，充分混勻后-30 °C放置0.5h~lh;
[0050] 5)12000r/min離心10min，吸棄上清，沉淀在室溫中涼干；
[0051 ] 6)加入500yL70%乙醇重新洗滌沉淀2次；
[0052] 7)室溫晾干，當(dāng)沉淀趨于透明時加入1 OOyLTE溶解。
[0053]將上述實施例的溶解液進行如下處理：
[0054] (a)PCR引物設(shè)計
[0055] 表1黃緣盒龜線粒體基因組全序列擴增引物
[0056]
[0057] (b)PCR 擴增
[0058] PCR擴增使用東洋紡(上海)生物技術(shù)有限公司的高保真酶KOD FX。
[0059] 表2PCR反應(yīng)組分
[0061 ] 表3PCR反應(yīng)程序
[0063] 對線粒體基因 PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳檢測，并用凝膠回收試劑盒（DNA GelExtractionKit，Takara)進行目的片斷的回收;對微衛(wèi)星PCR產(chǎn)物進行聚丙稀酰胺電泳 檢測；用純化試劑盒(￡.2.1'1.4〇7〇16?11代1(;[1:，0111683)進行純化回收。回收后的產(chǎn)物進行測 序，該序列可用于在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對分析，即完成整個DNA的提取和檢測應(yīng)用。
[0064] 電泳檢測：1 %瓊脂糖電泳，結(jié)合圖1，可以看到DNA條帶明顯，DNA采集純度較高。
[0065] 通過本申請技術(shù)方案的實施，通過收集評價野生黃緣盒龜種質(zhì)資源，采用"排泄 物"取樣方式，這種方式可在不傷害甚至不必見到動物的情況下，利用這些樣品提取動物 DNA并進行PCR擴增，再利用mtDNA，PCR等遺傳學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)，建立黃緣盒龜種質(zhì)分子 鑒定分析方法，實現(xiàn)在不影響野生種群分布的前提下探明黃緣盒龜野生資源現(xiàn)狀，所建立 的黃緣盒龜種質(zhì)分子鑒定方法，有利于探明野生黃緣盒龜種質(zhì)資源，并通過對野生黃緣盒 龜?shù)纳?、交配、繁育等條件調(diào)查，構(gòu)建黃緣盒龜擬生態(tài)馴養(yǎng)繁殖體系，從而進行生物個體 遺傳信息的分析;最終有效的保護這一瀕危物種，為保護物種多樣性，也為中醫(yī)藥自然資源 的可持續(xù)利用提供途徑。
[0066]以上內(nèi)容是結(jié)合本發(fā)明創(chuàng)造的優(yōu)選實施方式對所提供技術(shù)方案所作的進一步詳 細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明創(chuàng)造具體實施只局限于上述這些說明，對于本發(fā)明創(chuàng)造所屬技術(shù) 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演 或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種黃緣盒龜糞便提取DNA的方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 將黃緣盒龜糞便作為樣品采集后，立即裝入滅過菌的離心管中，用DETs浸泡； (2) 取上述浸泡中的糞便于離心管中，加入裂解液，裂解液與糞便混勻后水浴處理； (3 )加入蛋白酶K定量后，立即放入冰上靜置； (4) 離心，取上清至另一無菌離心管中，棄沉淀；向上清中加入等體積的酚/氯仿/異戊 醇混合液抽提； (5) 加入NaAc在旋渦混合器上混勻后，再加入預(yù)冷的無水乙醇，充分混勻后靜置； (6) 再次離心，吸棄上清，沉淀在室溫中涼干； (7) 加入體積濃度70%乙醇，重新洗滌沉淀； (8) 室溫晾干，當(dāng)沉淀趨于透明時加入TE溶解。2. 如權(quán)利要求1所述的一種黃緣盒龜糞便提取DNA的方法，其特征在于：步驟（1)中，樣 品自采集到用于步驟(2)及其后續(xù)步驟的DNA提取常溫保存90天~120天。3. 如權(quán)利要求1所述的一種黃緣盒龜糞便提取DNA的方法，其特征在于：步驟(2)中，裂 解液構(gòu)成為：100 mm〇l/LTris-HCl，pH8，1.4 mol/LNaCl，20mmol/LEDTA，0.4 mol/L DTT04. 如權(quán)利要求1所述的一種黃緣盒龜糞便提取DNA的方法，其特征在于：步驟(2)中，水 浴溫度為40~60°C，水浴時間1-4小時。5. 如權(quán)利要求1所述的一種黃緣盒龜糞便提取DNA的方法，其特征在于：步驟(3)中，加 入蛋白酶K定量后于50-55 °C下處理5~15分鐘后，于冰上靜置5~15分鐘。6. 如權(quán)利要求1所述的一種黃緣盒龜糞便提取DNA的方法，其特征在于:步驟(4)中，酚/ 氯仿/異戊醇混合液中，酚:氯仿:異戊醇=25:24:1。7. 如權(quán)利要求1所述的一種黃緣盒龜糞便提取DNA的方法，其特征在于：步驟（5)中， NaAc濃度為1.5~5moI/L，添加量為步驟(4)處理后溶液體積的0.1~0.3倍;無水乙醇的添 加量為添加 NaAc后溶液體積的1~3倍;混勻后于-10~-20°C下靜置0.5~1小時。
【文檔編號】C12N15/10GK105886495SQ201610439317
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年6月17日
【發(fā)明人】壽建昕
【申請人】紹興文理學(xué)院元培學(xué)院