專利名稱：：哺乳動物糞便dna提取方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及動物DNA的提取方法，特別涉及自非損傷性取樣材料中提取DNA的方法，具體地說是自哺乳動物糞便中提取DNA的方法。
背景技術：
：近年來，分子遺傳學在保護生物學及行為生態(tài)學中的應用受到普遍重視，進行分子遺傳學分析的首要工作是分析樣品的采集。過去的取樣方法主要有兩種一是傷害性取樣，即獵殺動物而獲取新鮮的肌肉、肝臟和血液等組織樣品。這種方法會對動物資源造成極大破壞；二是非傷害性取樣，即通過捕獲動物來抽取血液、采集毛發(fā)或羽毛耳、尾或趾等分析樣品。雖然該方法不至于導致動物死亡，但對野生動物特別是珍稀瀕危動物的習性和生存能力均會造成影響。非損傷性取樣是在不觸及或不傷害野生動物本身的情況下，通過收集脫落的毛發(fā)或羽毛、糞便、尿液、食物殘渣(含有口腔脫落細胞)、鹿角、魚鱗和卵殼等不同形式的分析樣品而進行遺傳物質(zhì)的提取和分析。在非損傷性取樣材料中，動物糞便是一種理想的分析樣品，原因包括一、動物排便具有節(jié)律性，相對于其他非損傷性取樣材料來說，樣品充足，易于采集；二、糞便樣本可以在不接觸甚至不看到動物的情況下獲得，對動物的干擾和傷害小，同時在研究大型食肉動物時也保護了野外工作者的人身安全；三、在對種群較大物種進行大規(guī)模采樣時，較捕獲動物進行采樣而言，采集糞便可以顯著降低采樣的花費。因此，該方法排除了傳統(tǒng)取樣方法的種種不利因素，基本上解決了保護遺傳學和分子生態(tài)學研究中所遇到的取樣難題。近年來已被成功運用于物種鑒別(通過對線粒體DNA的擴增)、個體的識別(對微衛(wèi)星進行擴增)、動物性別鑒定(對Y染色體上的SRY基因進行擴增)、種緣關系的鑒定(對線粒體控制區(qū)進行擴增)、母系鑒定(通過對線粒體DNA的擴增)、親子鑒定(對微衛(wèi)星進行擴增)、種群數(shù)量估計(對微衛(wèi)星進行擴增)等等(KohnandWayne，1997)。在這些研究中推動了糞便樣品的采集及其保存方法和提取前的取樣方法的進步。樣品采集方法有兩種，選擇性樣品采集(PartSampleCollection，PSC)和整樣品采集(WholeSampleCollection，WSC)。PSC即用無菌的一次性刀刮下糞便樣品表層黏膜，分裝到2ml離心管中，每管約200mg樣品。適用于大型哺乳動物新鮮糞便的采集。WSC則是將整個糞便放入50ml-100ml離心管中，確定其重量。由于核酸內(nèi)切酶被認為是降解DNA的主要因素，所以樣品在采集后須盡快進行保存。大多數(shù)保存方法都是對糞便樣品進行低溫、脫水或?qū)⑵浔４嬖诒４嬉褐幸越档秃怂醿?nèi)切酶活性。低溫處理即冷凍法，一般-20℃；脫水處理即干燥法，有硅膠干燥、二氧化硅干燥、微波干燥等；保存液常用的有無水乙醇、70％乙醇、二甲亞砜(DMSO)、二甲亞砜飽和鹽溶液(DETs)等。不同的采樣方法和保存方法適應于不同物種和生境條件下使用。用PSC法采集的樣品可直接對樣品進行DNA提取。用WSC法采集的樣品提取前應進行二次取樣，即從糞便中取富含細胞而雜質(zhì)較少部分進行DNA提取。目前常用的主要有4種二次取樣方法①緩沖液洗脫糞便表面細胞；②刮糞便表面；③表層取樣；④均質(zhì)取樣。不同的二次取樣方法適應于不同保存方法樣品的取樣。以糞便為材料提取動物DNA進行研究的關鍵是能否提取到高純度的糞便DNA。自糞便DNA分析技術興起后，國內(nèi)外在這方面做出了巨大的成就，發(fā)展了多種糞便DNA提取方法(Constableetal.，1995；Savilletal.，2001；鐘華等，2003；張保衛(wèi)等，2004)，充分證實了糞便DNA分析的可行性(Fernandoetal.，2003)。但實際應用中仍然存在以下問題1、各種提取方法通用性不好；在不同實驗個案中存在擴增成功率在物種和個體之間的差異。這一直是阻礙糞便DNA提取技術推廣的主要障礙，。2、未考慮到與DNA提取相關環(huán)節(jié)對結果的影響；由于糞便材料的特殊性，它的提取結果受到多重因素的影響，如樣品的采集、保存(Frantzenetal.，1998；PiggottandTaylor，2003)等等，忽視其中任何一個環(huán)節(jié)，都會給試驗結果帶來不利影響甚至導致試驗失敗。目前國內(nèi)外文獻資料均未對這些影響因素予以介紹，因此根據(jù)國外已發(fā)表論文中提供的方法進行糞便DNA提取時，往往得不到預期的效果。與此同時，對于許多剛開始分子糞便學研究的學者來說，既無法從現(xiàn)有文獻資料中獲得足夠的信息來指導糞便DNA提取試驗，也無法從失敗中分析原因。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對上述現(xiàn)有技術所存在的不足之處開展的實驗研究，旨在提供一種通用性好、可靠性高、成本低廉的哺乳動物糞便DNA提取方法，推進糞便DNA技術的推廣。本發(fā)明所稱的哺乳動物糞便DNA提取方法，其實質(zhì)是自糞便中提取排便哺乳動物細胞中的DNA。所要解決的技術問題是使DNA自細胞中釋放出來，并在一系列的分離、提取和純化過程中不被破壞，從而得到純度較高的哺乳動物DNA樣本。本提取方法包括糞便采集、保存、取樣、預處理和DNA提取，其特征在于所述的DNA提取是自樣品中經(jīng)裂解分離、析出和純化處理后得到DNA，所述的裂解分離即是在樣品中加入由Tris-HCl、EDTA和十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)配制成的裂解緩沖液，于50～60℃條件下靜置1.5～2.5h，離心分離，取上清液，用混合有機溶劑抽提出DNA；所述的析出是向含DNA的抽提液中加入2～4M濃度的NaAc和1～2倍體積的無水乙醇充分混勻后于-10～-30℃條件下靜置0.5～1h，離心分離，將析出的DNA沉淀室溫下干燥；所述的純化是向沉淀中加pH6～7的Tris-HCl緩沖液和硫氰酸胍(GuSCN)至沉淀完全溶解，然后加入二氧化硅微珠懸浮液，搖勻，離心分離，用70％乙醇洗滌硅珠沉淀，分離，脫去硅珠中殘存的乙醇后加入TE(Tris-EDTA緩沖液)液洗脫，離心分離得到含DNA的TE液；所述的混合有機溶劑為酚、氯仿和異戊醇按25∶24∶1的體積比混合得到的混合溶劑。對樣品進行預處理旨在除去樣品中殘存的保存液。因此對取自非保存液保存的樣品則無需進行預處理。預處理的方法就是用磷酸鹽緩沖液(PBS)或0.9％的生理鹽水浸泡、洗滌樣品，以除去殘存的保存液。CTAB是一種陽離子型表面活性劑，在本發(fā)明中用CTAB裂解動物細胞、釋放DNA，同時與糞便中的其他多種雜質(zhì)形成沉淀與DNA分離。GuSCN有使核酸水解酶失活的作用，但在本發(fā)明中GuSCN的存在使二氧化硅(SiO2)有特異性吸附DNA的作用，以分離、純化DNA。本方法提取的產(chǎn)物DNA純度大于1.7(OD260/OD280)，DNA產(chǎn)物片斷大于10Kb，可進行基因擴增和測序。本方法對保存3年以內(nèi)的樣品均有效。本方法有較好的通用性，廣泛適用于各種食性動物的糞便DNA提取，一般不需重復實驗。在驗證的10種動物(獼猴(Macacamulatta)、黑麂(Muntiacuscrinifrons)、梅花鹿(Cervusnippon)、長頸鹿(Giraffacamelopardalis)、馬鹿(Cervuselaphus)、牦牛(Bosgrunniens)、松鼠猴(Saimirisciureus)、豪豬(Hystrixbrachyurus)、北極狐(Alopexlagopus)和貉(Nyctereutesprocy)和糞便DNA提取中，僅一次提取即得到高質(zhì)量的模板DNA，在對12SrRNA基因的擴增中，所有提取的糞便DNA模板均能成功進行擴增。得到與預計大小相同的450bp產(chǎn)物，且濃度大、特異性強，測序結果證實了提取的真實性。四圖1、從短尾猴糞便抽提到的DNA模板電泳檢測圖。用本方法可以從糞便中提取出高質(zhì)量的糞便DNA，不僅濃度大，且降解少。圖2短尾猴12SrRNA基因的濃度梯度PCR結果，模板為改進型CTAB法提取的糞便DNA。模板濃度依次為10-4、10-3、10-2、10-1、1、5、10、15、20單位(1單位＝1μl模板DNA)。M為100bp的DNAladder。圖3短尾猴12SrRNA基因的濃度梯度PCR結果，模板為專用試劑盒提取的糞便DNA。模板濃度依次為10-4、10-3、10-2、10-1、1、5、10、15、20單位(1單位＝1μl模板DNA)。M為100bp的DNAladder。由于PCR擴增需一定濃度的模板才可順利進行，因此通過模板稀釋PCR梯度試驗可以比較兩種方法提取出產(chǎn)物的濃度大小。在模板濃度遞增試驗中，由于PCR體系中所含的抑制物濃度隨著模板量的增加而增加，最終會達到抑制Taq酶活性的濃度，因此比較可順利進行PCR擴增的各模板的臨界濃度，則可比較兩種方法所提取產(chǎn)物的純度。如圖2和圖3所示，在模板濃度遞增試驗中，本專利方法提取出的模板可以加至15單位而不影響擴增的正常進行，而試劑盒提取出的模板只能加至10單位，添加至15單位模板時，則會因PCR反應體系中抑制物量過多而阻礙PCR擴增正常進行。因此可以得出結論本方法提取出的糞便DNA與專業(yè)試劑盒相比，雖然產(chǎn)物濃度相當，但純度高于專業(yè)試劑盒。本方法是種高純度糞便DNA提取方法。五具體實施例方式現(xiàn)以短尾猴為例，非限定實施例敘述如下1、糞便采集采集短尾猴在野外排便、暴露不超過24小時的糞便樣品；采用選擇性樣品采集，用無菌的一次性刀片刮下糞便樣品表層黏膜，分裝到2ml離心管中，每管180-220mg樣品；除此之外采用整樣采集，整個糞便樣放入50ml-100ml離心管中，確定其重量；2、樣品保存對樣品進行保存的方法包括低溫保存、或脫水處理后保存，或在高鹽濃度緩沖液中保存；所述低溫保存采用冷凍法，冷凍溫度-20℃～-70℃；所述脫水處理是采用無水乙醇脫水或二氧化硅干燥保存；所述高鹽處理是采用二甲亞砜的飽和鹽溶液(DETs)保存樣品。3、取樣及與預處理對于所保存的樣品直接進行DNA提取，或通過二次取樣再進行DNA提??；所述二次取樣為下述四種方式之一以緩沖液洗脫糞便表面細胞；刮取糞便表面；表層取樣；均質(zhì)取樣；所述預處理是去除樣品中的保存液；4、DNA提取實驗準備準備好量程分別為1ml、200μl、50μl的微量移液器；水浴鍋溫度調(diào)至55℃；高速離心機離心力要能達到10000g；確保1.5ml和2ml離心管均已滅菌；確保所有溶液無沉淀、無結晶，若有沉淀或結晶，可用70℃水浴讓其溶解；將無水乙醇置于-20℃冷凍；將TE加熱到65℃以利于DNA的溶解或洗脫。試驗步驟①取200mg糞便于2ml離心管中，加入1mlCTAB裂解液中，混勻后55℃水浴2小時，每隔半小時取出搖勻一次；所述的裂解液為pH7.5～8.5、80～200mmol/LTris-HCl中加入1～3wt％CATB、15～40mmol/LEDTA和1～2mol/LNaCl；②12000rpm離心5min，離心結束后移出700μl上清至一無菌1.5ml離心管中，棄沉淀。向上清中加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，震蕩10min后10000rpm離心10min；吸出上清至另一無菌1.5ml離心管中，加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)重新抽提，直至離心后水相和有機相之間不再有白色沉淀；③向上清中加入0.1倍體積的3MNaAc，在旋渦混合器上混勻后加入1.5倍體積(加入鹽之后計算的體積)預冷的無水乙醇，充分混勻后-20℃放置0.5～1h。④12000rpm離心10min，吸棄上清，沉淀在室溫中涼干；⑤在沉淀中加入1mlGuSCN洗液，搖勻至沉淀完全溶解；所述的洗液為pH6～7、80～200mmol/LTris-HCl中加入5～8mol/LGuSCN；⑥加入100μl硅珠懸液，緩慢搖勻吸附DNA10min，10000rpm離心5min，吸棄上清保留硅珠沉淀；⑦用500μlGuSCN洗液和500μl70％乙醇分別洗滌沉淀2次；⑧離心棄上清，將1.5ml離心管置于55℃烘箱內(nèi)5min烘干殘余乙醇，再向硅珠沉淀中加入100μlTE，震蕩混勻5min洗脫DNA，最后12000rpm離心5min，移出約80μl上清至一無菌200μl或1.5ml離心管中保存。權利要求1.一種哺乳動物糞便DNA提取方法，包括糞便采集、保存、取樣、預處理和DNA提取，其特征在于所述的DNA提取是自樣品中經(jīng)裂解分離、析出和純化處理后得到DNA，所述的裂解分離即是在樣品中加入由Tris-HCl、EDTA和十六烷基三甲基溴化銨配制成的裂解緩沖液，于50～60℃條件下靜置1.5～2.5h，離心分離，取上清液，用混合有機溶劑抽提出DNA；所述的析出是向含DNA的抽提液中加入2～4M濃度的NaAc和1～2倍體積的無水乙醇充分混勻后于-10～-30℃條件下靜置0.5～1h，離心分離，將析出的DNA沉淀室溫下干燥；所述的純化是向沉淀中加pH6～7的Tris-HCl緩沖液和硫氰酸胍至沉淀完全溶解，然后加入二氧化硅微珠懸浮液，搖勻，離心分離，用70％乙醇洗滌硅珠沉淀，分離，脫去硅珠中殘存的乙醇后加入TE液洗脫，離心分離得到含DNA的TE液；所述的混合有機溶劑為酚、氯仿和異戊醇按25∶24∶1的體積比混合得到的混合溶劑。2.根據(jù)權利要求1所述的提取方法，其特征在于所述的預處理就是用磷酸鹽緩沖液或0.9％的生理鹽水浸泡、洗滌樣品。全文摘要一種哺乳動物糞便DNA提取方法，包括糞便的采集、保存、取樣和DNA提取，本提取首先用含有十六烷基三甲基溴化銨的裂解液使DNA自細胞中釋放出來，然后經(jīng)分離、析出得到DNA沉淀，最后用硫氰酸胍和二氧化硅吸附純化得到純度較高的DNA。本方法得到的產(chǎn)物DNA純度大于1.7(OD文檔編號G01N1/00GK1904066SQ20061004102公開日2007年1月31日申請日期2006年7月15日優(yōu)先權日2006年7月15日發(fā)明者李進華,趙健元申請人:安徽大學