一株在低磷環(huán)境下促進(jìn)臺(tái)灣相思營(yíng)養(yǎng)元素吸收的內(nèi)生真菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株在低磷環(huán)境下促進(jìn)臺(tái)灣相思營(yíng)養(yǎng)元素吸收的內(nèi)生真菌。所述內(nèi)生真菌為絲黑粉菌屬（Filobasidium）F，已于2016年1月27日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，保藏號(hào)為CGMCC No.12102。將臺(tái)灣相思內(nèi)生真菌F接種于臺(tái)灣相思土培苗，通過對(duì)植株碳含量和氮含量的測(cè)定，得出接種該菌株在低磷環(huán)境下的處理植株的碳含量和氮含量均基本較大程度高于對(duì)照，表明其在低磷環(huán)境下對(duì)促進(jìn)植株?duì)I養(yǎng)元素吸收具有很大功用，從而進(jìn)一步證實(shí)得到該株內(nèi)生真菌能在低磷環(huán)境下促進(jìn)臺(tái)灣相思植株?duì)I養(yǎng)元素的吸收。CGMCC No. 1210220160127
【專利說明】
一株在低磷環(huán)境下促進(jìn)臺(tái)灣相思營(yíng)養(yǎng)元素吸收的內(nèi)生真菌
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一株在低磷環(huán)境下促進(jìn)臺(tái)灣相思營(yíng)養(yǎng)元素吸收的內(nèi)生真菌。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物內(nèi)生菌的研究始于19世紀(jì)末，Vogl從黑麥草Lolium temulentum L.種子中分 離出第一株內(nèi)生菌。但真正開始大量研究植株中的內(nèi)生菌起始于上世紀(jì)八十年代，主要是 在溫帶地區(qū)、亞熱帶地區(qū)和熱帶地區(qū)的植被中開展研究。 植物內(nèi)生真菌的分布廣、種類多，前人研究表明從絕大多數(shù)植物體內(nèi)都能分離得到內(nèi) 生真菌，由此可見內(nèi)生真菌普遍存在于植物體內(nèi)。在全世界范圍內(nèi)至少在80多個(gè)屬290多種 的禾本科農(nóng)作物中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生菌。目前從植物中分離的內(nèi)生菌根據(jù)其具有的獨(dú)特功能可以 分為：固氮菌、固鉀菌、固磷菌等植物促生菌、具有抗病蟲害的生防菌和具有促進(jìn)植物對(duì)不 良環(huán)境的修復(fù)能力的抗性菌。 有關(guān)內(nèi)生真菌對(duì)臺(tái)灣相思生長(zhǎng)的影響研究還存在空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一株在低磷環(huán)境下促進(jìn)臺(tái)灣相思營(yíng)養(yǎng)元素吸收的內(nèi)生真 菌，該真菌為絲黑粉菌屬(FiIobasidiunOF，已于2016年1月27日在中國(guó)微生物菌種保藏管 理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏號(hào)為 CGMCC No. 12102。 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 該菌的分離、純化包括： A、 材料:將采集得到不同年份的根、枝莖、葉分成三個(gè)部分，用自來水清洗干凈，分裝到 自封袋內(nèi)，于4°C冰箱保存； B、 消毒:75%酒精漂洗30s-無菌水沖洗3-4次-15%的次氯酸鈉漂洗(根IOmin，莖5min， 葉2min)-無菌水沖洗4-5次。當(dāng)樣品最后一次浸洗后的水盛于滅菌的小燒杯中，在平板上 劃線作為對(duì)照，以檢驗(yàn)樣品的消毒是否徹底，若干天后如有菌落生成，則表明樣品表面消毒 不徹底，需繼續(xù)調(diào)整消毒方法； C、 接種部位的選擇:葉片：葉尖部、葉中部和葉基部3個(gè)處理;枝莖:上中下分為3部位， 其中第3部位為枝莖交接處;根部:分為根尖和根基2個(gè)部分； D、 接種:將消毒后的外植體用接種刀切開，鋪放在培養(yǎng)基表面，于28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi) 培養(yǎng)5-7天后觀察菌落生長(zhǎng)狀況。有的菌株繁殖迅速，可先將其產(chǎn)生的菌株進(jìn)行分離純化； 生長(zhǎng)緩慢且數(shù)量較少的菌株可延長(zhǎng)觀察時(shí)間，直到其生長(zhǎng)穩(wěn)定后純化； 固體培養(yǎng):使用改良馬丁固體培養(yǎng)基，配方為蛋白胨5.Og/L、酵母浸出粉2.Og/L、葡萄 糖20 · Og/L、磷酸氫二鉀1 · Og/L、硫酸鎂0 · 5g/L、瓊脂14 · Og/L、其它為無菌水，pH值6 · 4土 0.2，培養(yǎng)溫度為28 °C，培養(yǎng)方式為平板培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為48h; E、 將分離繁殖出的不同種類的內(nèi)生真菌接入平板培養(yǎng)基進(jìn)行純化，經(jīng)過2-3次點(diǎn)接純 化、轉(zhuǎn)接后分別得到單一菌種的上述的Fi Iobasidium功能菌株； 上述的一種在低磷環(huán)境下促進(jìn)臺(tái)灣相思營(yíng)養(yǎng)元素吸收的內(nèi)生真菌應(yīng)用菌液的制備方 法，是將上述的菌株接入液體培養(yǎng)基，搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間48~72h， 利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9. OX 106cfu/ml即為成品備 用；液體培養(yǎng)基：為改良馬丁培養(yǎng)基，其中蛋白胨5. Og/L、酵母浸出粉2. Og/L、葡萄糖 20 · Og/L、磷酸氫二鉀1 · Og/L、硫酸鎂0 · 5g/L、其它為無菌水、pH值6 · 4 ± 0 · 2。 上述的一種在低磷環(huán)境下促進(jìn)臺(tái)灣相思營(yíng)養(yǎng)元素吸收的內(nèi)生真菌應(yīng)用菌液的應(yīng)用方 法，是應(yīng)用該菌株的菌液澆施于臺(tái)灣相思苗木根際土壤或苗木直接接種。 上述的一種在低磷環(huán)境下促進(jìn)臺(tái)灣相思營(yíng)養(yǎng)元素吸收的內(nèi)生真菌應(yīng)用菌液的應(yīng)用方 法，是用5.5 X IO6Cfu/ml菌液，按每株100mL在林地澆于每株臺(tái)灣相思的根際。 本發(fā)明涉及的菌株是從臺(tái)灣相思植株中分離純化得到的，經(jīng)接種于臺(tái)灣相思土培苗， 根據(jù)各項(xiàng)指標(biāo)綜合評(píng)判，進(jìn)一步證實(shí)其在低磷環(huán)境下對(duì)植株生長(zhǎng)具有促進(jìn)臺(tái)灣相思營(yíng)養(yǎng)元 素吸收的作用，尋找到對(duì)促進(jìn)植株在低磷環(huán)境下營(yíng)養(yǎng)元素吸收的有益的功能內(nèi)生真菌可應(yīng) 用于生產(chǎn)。
[0004]通過菌液澆施的方法接種于臺(tái)灣相思幼苗，并在接種15天后進(jìn)行低磷脅迫試驗(yàn)， 在脅迫90d時(shí)測(cè)定各營(yíng)養(yǎng)元素。根據(jù)測(cè)得的各項(xiàng)指標(biāo)綜合評(píng)判，進(jìn)一步證實(shí)其對(duì)植株生長(zhǎng)具 有緩解低磷脅迫的作用，尋找到對(duì)促進(jìn)植株?duì)I養(yǎng)元素吸收有益的功能內(nèi)生真菌可應(yīng)用于生 產(chǎn)。通過對(duì)植株碳和氮的測(cè)定，得出接種該菌株的處理的碳和氮均基本較大程度高于對(duì)照， 表明其在低磷環(huán)境下對(duì)促進(jìn)植株碳和氮吸收具有很大功用，從而進(jìn)一步證實(shí)得到該株內(nèi)生 真菌能在低磷環(huán)境下促進(jìn)臺(tái)灣相思植株碳和氮的吸收。
【附圖說明】
[0005] 圖1為不同處理對(duì)臺(tái)灣相思幼苗碳含量的影響； 圖2為不同處理對(duì)臺(tái)灣相思幼苗氮含量的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0006] 一、根際土壤澆施與苗木直接接種應(yīng)用 本試驗(yàn)采用土培盆栽試驗(yàn)，試驗(yàn)所用材料為福建省漳州市市林業(yè)局提供的臺(tái)灣相思一 年生苗。選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的臺(tái)灣相思苗木定植于直徑15cm，高IOcm的塑料盆中。所用土壤是嚴(yán) 格經(jīng)過熏蒸消毒的黃心土。經(jīng)過混勻稱量，每盆放入等量的3kg 土壤。經(jīng)過一個(gè)月的恢復(fù)性 生長(zhǎng)后，連續(xù)三天于臺(tái)灣相思根際施入濃度為5.5 X 106cfu/ml的IOOmL菌液，用蒸餾水溶液 作為空白對(duì)照。
[0007] 菌液制備:將供試菌株接入40mL的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為改良馬丁培養(yǎng)基，其中蛋 白胨5. Og/L、酵母浸出粉2.Og/L、葡萄糖20.0 g/L、磷酸氫二鉀1.0 g/L、硫酸鎂0.5g/L、其它 為無菌水、pH值6.4±0.2,在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中經(jīng)過72h的培養(yǎng)。用無菌生理鹽水按十倍稀 釋法將菌液稀釋，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算菌液濃度配制成5.5 X 106cfu/mL。
[0008] 二、低磷脅迫試驗(yàn)設(shè)計(jì) 盆栽試驗(yàn)土壤的基質(zhì)為黃心土。經(jīng)測(cè)定該土壤中各養(yǎng)分物質(zhì)見表1。接種15天后進(jìn)行低 磷脅迫試驗(yàn)處理，這段時(shí)間主要是讓接種菌株侵入植株。
[0009]表1基質(zhì)土壤養(yǎng)分情況 單位:mg/g
本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了 4個(gè)磷處理水平，每個(gè)水平3個(gè)重復(fù)(表2 )。磷肥采用KH2PO4，定期施氮肥、 鉀肥及其他微量元素，直至收獲。低磷脅迫于2015年5月4日進(jìn)行。根據(jù)天氣狀況及時(shí)為臺(tái)灣 相思苗補(bǔ)充水分。
[0010]表2低磷脅迫試驗(yàn)設(shè)計(jì) 單位:mg/kg
在脅迫90d時(shí)測(cè)定植株的碳含量和氮含量。檢測(cè)方法如下： (1)植株碳含量采用重鉻酸鉀氧化一外加熱法測(cè)定植株全碳（即有機(jī)質(zhì)）含量進(jìn)行測(cè) 定，每個(gè)樣品做三個(gè)重復(fù)。
[0011] 計(jì)算公式：
式中：1。:為有機(jī)碳含量，g/kg; 0.8000為重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L; 5.0為重鉻 酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，空白標(biāo)定用去硫酸亞鐵溶液體積，mL;V為測(cè)定土樣用去硫酸 亞鐵溶液體積，mL;0.003為1/4碳原子的摩爾質(zhì)量，g/mmol; 1.1為氧化校正系數(shù);Hi1為風(fēng)干 土樣質(zhì)量，g;K2為風(fēng)干土換算到烘干的水分換算系數(shù)。
[0012] (2)植株氮含量采用凱氏定氮法測(cè)定進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品做三個(gè)重復(fù)。
[0013] 計(jì)算公式：
式中：Wn為氮含量，g/kg; V為測(cè)定樣品用去鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL; Vo為滴定試劑空白 試驗(yàn)用去鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL; c為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L; 0.014為氮原子的摩爾質(zhì) 量，g/mmol;m為烘干樣品質(zhì)量，g。
[0014] (3)數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)整理與作圖采用Excel2003，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS20.0。
[0015]三、結(jié)果與分析 (1)不同低磷脅迫下不同處理對(duì)臺(tái)灣相思碳含量的影響 四個(gè)不同低磷脅迫條件分別為:重度脅迫、中度脅迫、輕度脅迫、正常條件。如圖1所示， 在四個(gè)不同低磷脅迫程度下，接種菌株I的幼苗的地上部分碳含量均較明顯大于對(duì)照，分別 為對(duì)照的1.27倍、1.14倍、1.38倍、1.10倍，地下部分碳含量均大于對(duì)照，分別為對(duì)照的1.44 倍、1.14倍、1.22倍、1.15倍。由此可知，菌株F有利于促進(jìn)植株對(duì)碳元素的吸收。
[0016] (2)不同低磷脅迫下不同處理對(duì)臺(tái)灣相思氮含量的影響 如圖2所示，在四個(gè)不同低磷脅迫程度下，接種菌株I的幼苗的地上部分氮含量均明顯 大于對(duì)照，分別為對(duì)照的1.35倍、1.95倍、1.93倍、1.23倍，地下部分碳含量在中度脅迫和輕 度脅迫下均大于對(duì)照，分別為對(duì)照的1.50倍、1.31倍。由此可知，菌株F有利于促進(jìn)植株對(duì)氮 元素的吸收。
[0017] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)一株在低磷環(huán)境下能促進(jìn)臺(tái)灣相思苗對(duì)碳氮等營(yíng)養(yǎng)元素吸收的內(nèi)生 真菌，將該株臺(tái)灣相思內(nèi)生真菌菌株采用澆根的方法接種于臺(tái)灣相思幼苗。通過對(duì)植株碳 含量和氮含量的測(cè)定，得出接種該菌株的處理的碳含量和氮含量均較大程度高于對(duì)照，表 明其對(duì)于促進(jìn)植株?duì)I養(yǎng)元素的吸收具有很大功用，從而進(jìn)一步證實(shí)得到該株內(nèi)生真菌在低 磷環(huán)境下能促進(jìn)臺(tái)灣相思對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收。
[0018] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與 修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株在低磷環(huán)境下促進(jìn)臺(tái)灣相思營(yíng)養(yǎng)元素吸收的內(nèi)生真菌，其特征在于:該真菌為 絲黑粉菌屬(Filobasidium)F，已于2016年1月27日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通 微生物中心登記保藏，保藏號(hào)為CGMCC No. 12102。2. -種如權(quán)利要求1所述的一株在低磷環(huán)境下促進(jìn)臺(tái)灣相思營(yíng)養(yǎng)元素吸收的內(nèi)生真菌 的應(yīng)用菌液，其特征在于:所述應(yīng)用菌液的制備方法，將所述的絲黑粉菌屬(Filobasidium) F菌株接入液體培養(yǎng)基，搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間48~72h，利用血球計(jì)數(shù) 板計(jì)算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9.0 X 106cfu/ml，備用;液體培養(yǎng)基:為改良 馬丁培養(yǎng)基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、 硫酸鎂〇. 5g/L、其它為無菌水、pH值6.4 ± 0.2。3. -種如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用菌液的用途，其特征在于:所述應(yīng)用菌液用于臺(tái)灣相思 苗木根際土壤澆施或苗木直接接種。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK105861335SQ201610452981
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年6月22日
【發(fā)明人】洪滔, 林勇明, 林晗, 周艷芬, 謝安強(qiáng), 陳燦
【申請(qǐng)人】福建農(nóng)林大學(xué)