一株產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶米曲霉菌株及其應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶米曲霉菌株及其在醬油釀造中的應用，屬于微生物技術領域。該菌株為米曲霉Aspergillus oryzaeHGD13，2016年05月03日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號：CCTCC NO：M 2016244，該米曲霉菌株HGD13除產(chǎn)蛋白酶外，還高產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶，可用于醬油釀造，提高原料利用率，提高醬油中水溶性膳食纖維的含量，使醬油中可溶性膳食纖維含量超過4.3 g/100ml。CCTCC NO：M 201624420160503
【專利說明】
一株產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶米曲霉菌株及其應用
技術領域
[0001 ]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領域，具體涉及一株產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶米曲霉菌株及其在醬油釀造中的應用。
【背景技術】
[0002]醬油是以大豆、小麥、面粉、麩皮等為原料，在多種微生物分泌的不同酶系的共同作用下，經(jīng)過一系列復雜的生物化學變化，最終形成的具有明顯香味特征的釀造調(diào)味品。米曲霉是釀造醬油制曲中的主體微生物，它是一種好氧微生物，能夠自身分泌多種酶，其中最主要的是蛋白酶和淀粉酶，并且它們在制曲中的酶活力都很高，以至在分解原料時就會獲得較多的氨基酸類和糖類物質(zhì)，它們對醬油形成的特殊色澤、香氣、滋味和體態(tài)起著重要的作用。
[0003]膳食纖維指一些既不能被小腸消化酶分解也不能被小腸吸收的多糖、木質(zhì)素等植物性成分。膳食纖維對人體的生理作用已被廣泛認同，被稱為“第七營養(yǎng)素”，具有預防便秘和直腸癌、降低血清膽固醇、調(diào)節(jié)血糖血脂代謝、預防膽結石、減肥和抗癌等功效。近年來隨著生活水平的提高，人們的膳食結構發(fā)生了改變，以動物蛋白為主的高蛋白高脂肪食品攝入量過多，谷物食品攝取的精細度提高，膳食纖維攝入比例減少，導致肥胖、糖尿病、心血管疾病等“文明病”發(fā)病率提高，膳食纖維的合理攝入能降低文明病的發(fā)生，增進機體健康。
[0004]釀造醬油主要原料，如大豆、小麥、面粉、麩皮等，經(jīng)發(fā)酵、提油后產(chǎn)生大量廢渣，由于其數(shù)量多、水分含量高、營養(yǎng)成分豐富，極易腐敗變質(zhì)，難以保存;生產(chǎn)廠家通常作為粗飼料添加物或丟棄處理，從而造成大量資源浪費，處理不當還會造成環(huán)境污染。大豆醬油渣除蛋白質(zhì)已被大量利用外，其它組分(尤其是膳食纖維)利用率較低，因此，選育一株高效米曲霉菌株，既具有較高的蛋白酶活，使醬油釀造原料中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為氨基酸，又具有內(nèi)切葡聚糖酶活，使醬油釀造原料中不溶性膳食纖維盡可能多的轉(zhuǎn)化為醬油中可被人直接吸收的可溶性膳食纖維，提高原料利用率，減少環(huán)保壓力，將具有重要的社會和經(jīng)濟意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的之一是提供一株產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶米曲霉AspergillusoryzaeHGD13的菌株，保藏編號:CCTCC Ν0:Μ 2016244，保藏時期:2016年05月03日，保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國武漢武昌珞珈山武漢大學。
[0006]米曲霉菌株HGD13從農(nóng)家自釀豆醬中，經(jīng)過大量的復壯、分離、純化獲得。
[0007]所述的米曲霉HGD13菌株形態(tài)學特征:米曲霉HGD13在酵母膏胨葡萄糖(YPD)瓊脂培養(yǎng)基上，菌絲長得旺盛，但是不產(chǎn)孢子;在馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)和豆汁培養(yǎng)基上培養(yǎng)3-4 d后長滿孢子，在豆汁培養(yǎng)基上的孢子是綠色而在TOA上的是淺黃色，且在豆汁培養(yǎng)基上產(chǎn)孢時間短、孢子產(chǎn)量多、菌絲層厚。
[0008]本發(fā)明的目的之二是提供米曲霉菌株HGD13產(chǎn)生內(nèi)切葡聚糖酶的方法，該內(nèi)切葡聚糖酶制備方法如下: (1)將活化好的斜面米曲霉HGD13菌株接種2-3環(huán)到麩皮培養(yǎng)基(麩皮100份，水100份)中，30°C培養(yǎng)2 d，得到一級種曲孢子；
(2)按照一級種曲孢子與二級種曲培養(yǎng)基重量比為0.25-1.0%(w/w)比例接種一級種曲孢子到二級種曲培養(yǎng)基(麩皮85份，豆柏粉15份，水100份)中，培養(yǎng)溫度300C，培養(yǎng)時間2_3d，得到二級種曲孢子；
(3)將培養(yǎng)好的二級種曲孢子按照接種量(0.25-1.0) X 17個孢子/g(干基)接種到成曲培養(yǎng)基(豆柏60份，麩皮30份，面粉1份，水100份)中，培養(yǎng)溫度30 °C，培養(yǎng)2_3 d后，得到成曲；
(4)將0.1-0.3mo I/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.5)加入到成曲中，30-40 °C浸提1-2 h，攪拌，過濾，得上清液，上清液用濃度40-50%(w/v)的(NH4)2SO4溶液鹽析，棄上清，用0.1-0.3mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.5)溶解沉淀，制得粗酶液。
[0009]本發(fā)明的目的之三是將米曲霉HGD13菌株應用于醬油釀造，步驟如下:
(1)將斜面上的米曲霉HGD13接種2-3環(huán)到麩皮培養(yǎng)基(麩皮100份，水100份)，30°C培養(yǎng)2 d，得到一級種曲孢子；
(2)按照一級種曲孢子與二級種曲培養(yǎng)基重量比為0.25-1.0%(w/w)比例接種一級種曲孢子到二級種曲培養(yǎng)基(麩皮85份，豆柏粉15份，水100份)中，培養(yǎng)溫度300C，培養(yǎng)時間2_3d，得到二級種曲孢子；
(3)將培養(yǎng)好的二級種曲孢子按照接種量(0.25-1.0) X 17個孢子/g(干基)接種到成曲培養(yǎng)基(豆柏60份，麩皮30份，面粉10份，氯化鈣0.1份，硫酸鋅0.05份，酵母粉3份，葡萄糖2份，水100份)中，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間2-3 d，得到成曲；
(4)在步驟(3)的成曲中添加成曲重量2.5倍18%食鹽水，30°C保溫培養(yǎng)20-30d后，發(fā)酵體系pH降為5.3左右時，按照總原料量的0.05-0.l%(w/w)添加活性干酵母(魯氏酵母)，30°C保溫培養(yǎng)20-30 d后，按照總原料量的0.05-0.1%(?/?)添加活性干酵母(球擬酵母)，30°(:保溫再培養(yǎng)20-30 d，最后按照醬油釀造常規(guī)方法，過濾，滅菌。
[0010]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果:提供了一株高效米曲霉菌株，既具有較高的蛋白酶活，使醬油釀造原料中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為氨基酸，又具有內(nèi)切葡聚糖酶活，使醬油釀造原料中不溶性膳食纖維盡可能多地轉(zhuǎn)化為醬油中可被人直接吸收的可溶性膳食纖維，提高原料利用率，減少環(huán)保壓力，具有重要的社會和經(jīng)濟意義。
【附圖說明】
[0011 ]圖1為不同斜面培養(yǎng)基上米曲霉HGD13菌落形態(tài)圖，圖中從上至下分別為PDA、YPD、
豆汁培養(yǎng)基。
【具體實施方式】
[0012]以下是本發(fā)明的具體實施例，對本發(fā)明的技術方案做進一步描述，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于實施例所述的范圍，凡是不背離本發(fā)明構思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0013]實施例1:不同斜面培養(yǎng)基上米曲霉HGD13菌落形態(tài) (I)培養(yǎng)基配制馬鈴薯(PDA)培養(yǎng)基:馬鈴薯(取新鮮馬鈴薯去皮，挖掉芽眼，洗凈，切片，稱取20 g，切成小塊，加入100 ml水煮沸30 min后，雙層紗布過濾，濾液補足水分)20 g，葡萄糖I g，蒸饋水 100 ml，瓊脂2 g，pH自然，115 °C滅菌20 min。
[00Μ]酵母膏胨葡萄糖(YF1D)瓊脂培養(yǎng)基:葡萄糖2 g，胰蛋白胨2 g，酵母膏I g，蒸饋水100 ml，瓊脂2 g，pH 5.0_5.5，115°C滅菌20 min。
[0015]豆汁培養(yǎng)基:豆汁1000 mKlOO g大豆浸泡24 h，加水800 ml煮沸30 min，定容到1000 ml)，可溶性淀粉20 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀1.0 g，瓊脂20 g，pH 6.5-7.00121 °C滅菌20 min。
[0016](2)不同斜面活化培養(yǎng)基上米曲霉HGD13菌落形態(tài)觀察
米曲霉HGD13在PDA、YPD、豆汁培養(yǎng)基的菌落形態(tài)如圖1所示。米曲霉HGD13菌株在YI3D培養(yǎng)基上面，菌絲長得旺盛但是不產(chǎn)孢子;在]3DA培養(yǎng)基和_&汁培養(yǎng)基上培養(yǎng)3-4 d后長滿孢子，在豆汁培養(yǎng)基上的孢子是綠色而在PDA上的是淺黃色，且在豆汁培養(yǎng)基上產(chǎn)孢時間短、孢子產(chǎn)量多、菌絲層厚。
[0017]實施例2:米曲霉菌株HGD13產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶制備
(I)將活化好的斜面米曲霉HGD13菌株接種3環(huán)到麩皮培養(yǎng)基(麩皮100份，水100份)中，30°C培養(yǎng)2 d，得到一級種曲孢子。
[0018](2)按照一級種曲孢子與二級種曲培養(yǎng)基重量比為0.25%(w/w)比例接種一級種曲孢子到二級種曲培養(yǎng)基(麩皮85份，豆柏粉15份，水100份)中，培養(yǎng)溫度30 °C，培養(yǎng)時間60h，孢子數(shù)超過60億個/g(發(fā)酵基質(zhì))，得到二級種曲孢子。
[0019](3)將培養(yǎng)好的二級種曲孢子按照接種量0.25 X 17個孢子/g(干基)接種到成曲培養(yǎng)基(豆柏60份，麩皮30份，面粉10份，水100份)中，培養(yǎng)溫度30 V，培養(yǎng)24 h時，曲料表面長滿白色菌絲，散發(fā)淡淡曲香，結塊小，及時將曲料分散;培養(yǎng)36 h時，曲料白色菌絲較多，稍微有淡黃色孢子，有曲香味;培養(yǎng)48 h時，曲料菌絲濃密，表面布滿黃色孢子，曲料蓬松且曲香濃郁;培養(yǎng)60 h時，曲料呈黃綠色，孢子豐滿，曲料柔軟，濃郁曲香味，得到成曲。
[0020](4)按照成曲重量與醋酸-醋酸鈉緩沖液體積比為1: 20(w/v)，加入0.02 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.5)到成曲中，40°C浸提I h，攪拌，過濾，得上清液;上清液用濃度40%(w/v)的(NH4)2SO4鹽析，棄上清，用0.02 mo I/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.5)溶解沉淀，制得粗酶液。
[0021](5)以酪蛋白為底物，采用福林-酚法測定蛋白酶活力；以羧甲基纖維素鈉為底物，采用二硝基水楊酸(DNS)法測定內(nèi)切葡聚糖酶活力。該米曲霉HGD13菌株產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶活超過800 U/g(發(fā)酵基質(zhì))，中性蛋白酶活大于3000 U/g(發(fā)酵基質(zhì))。
[0022]實施例3:高膳食纖維醬油的制備
(I)將活化好的斜面米曲霉HGD13菌株接種3環(huán)到麩皮培養(yǎng)基(麩皮100份，水100份)中，30°C培養(yǎng)2 d，得到一級種曲孢子。
[0023](2)按照一級種曲孢子與二級種曲培養(yǎng)基重量比為0.25%(w/w)比例接種一級種曲孢子到二級種曲培養(yǎng)基(麩皮85份，豆柏粉15份，水100份)中，培養(yǎng)溫度30 °C，培養(yǎng)時間60h，得到二級種曲孢子，孢子數(shù)超過60億個/g (發(fā)酵基質(zhì))。
[0024](3)將培養(yǎng)好的二級種曲孢子按照接種量0.5X 17個孢子/g(干基)接種到成曲培養(yǎng)基(豆柏60份，麩皮30份，面粉10份，氯化鈣0.1份，硫酸鋅0.05份，酵母粉3份，葡萄糖2份，水10份)中，培養(yǎng)溫度300C，培養(yǎng)時間48 h，得到成曲，成曲中中性蛋白酶活大于3300 U/g(發(fā)酵基質(zhì))，內(nèi)切葡聚糖酶活超過1100 U/g(發(fā)酵基質(zhì))。
[0025](4)在步驟(3)的成曲中添加成曲重量2.5倍18%食鹽水，30°C保溫培養(yǎng)30 d后，發(fā)酵體系pH降為5.3左右時，按照總原料量的0.08%(w/w)添加安琪活性干酵母(魯氏酵母)，30°(:保溫培養(yǎng)30 d后，按照總原料量的0.08%(w/w)添加安琪活性干酵母(球擬酵母)，30°C保溫再培養(yǎng)30 d。然后按照醬油釀造常規(guī)方法，過濾并滅菌。
[0026](5)品質(zhì)評價:醬油中可溶性膳食纖維含量超過4.3 g/100ml，與一般醬油相比，可溶性膳食纖維含量提高了 40%以上。
【主權項】
1.一株產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶米曲霉菌株，其特征在于:該菌株為米曲霉Aspergi I Iusoryzae HGD13，已于2016年05月03日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為:CCTCCN0:M 2016244。2.—種如權利要求1所述的一株產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶米曲霉菌株AspergiIIus oryzaeHGD13在醬油釀造中的應用，包括如下步驟: (1)將活化好的米曲霉HGDl3菌株接種到麩皮培養(yǎng)基中，30 °C培養(yǎng)2d，得到一級種曲孢子； (2)按照一級種曲孢子與二級種曲培養(yǎng)基重量比為0.25-1.0%的比例接種步驟(I)的一級種曲孢子到二級種曲培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間2-3d，得到二級種曲孢子； (3)將培養(yǎng)好的二級種曲孢子按照接種量(0.25-1.0)X 17個孢子/g(干基)接種到成曲培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度30 0C，培養(yǎng)時間2-3d，得成曲； (4)在步驟(3)的成曲中添加成曲重量2.5倍18%食鹽水，30°C保溫培養(yǎng)20-30d后，發(fā)酵體系pH降為5.3左右時，按照總原料重量的0.05-0.1 %添加活性干魯氏酵母，30°(:保溫培養(yǎng)20-30d后，按照總原料重量的0.05-0.1 %添加活性干球擬酵母，30°C保溫再培養(yǎng)20_30d，最后按照醬油釀造常規(guī)方法進行醬油的制備。
【文檔編號】C12R1/69GK105861329SQ201610371277
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月30日
【發(fā)明人】陳雄, 王志, 代俊, 李欣
【申請人】湖北工業(yè)大學