Hotair小分子抑制劑及在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種Hotair小分子抑制劑及在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，屬于含有機(jī)有效成分的醫(yī)藥配置品領(lǐng)域。本發(fā)明Hotair小分子抑制劑的化學(xué)名稱為7?氮?2?[4?(7?氮?3?氧?4,9?二氫呋喃[3,2?b]喹喔啉?2?基)苯基]?4,9?二氫呋喃[3,2?b]喹喔啉?3?酮，分子量為540。其能特異性的抑制Hotair的5’端與PRC2中的EZH2蛋白結(jié)合；在U87細(xì)胞中有效的抑制EZH2入核；小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中其有效抑制乳腺癌腫瘤模型的生長和肺轉(zhuǎn)移。本發(fā)明小分子抑制劑能應(yīng)用于制備治療腫瘤藥物中，對腫瘤發(fā)生、發(fā)展和治療的研究具有重大的臨床意義，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】
Hota i r小分子抑制劑及在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于含有機(jī)有效成分的醫(yī)藥配置品領(lǐng)域，具體是一種Hotair小分子抑制劑 及在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 人Hotair在染色體12ql3區(qū)域，位于H0XC12和HOXCll編碼區(qū)之間。最初的研究工作 始于2007年，Chang課題組在研究H0XA-H0XD家族表觀遺傳學(xué)調(diào)控的過程中發(fā)現(xiàn)，Hotair的 作用機(jī)制是通過一系列蛋白復(fù)合物來實(shí)現(xiàn)的。首先發(fā)現(xiàn)的蛋白復(fù)合物是由組蛋白H3K27甲 基轉(zhuǎn)移酶（H3K27 histone methyl transferase，HMTase)、EZH2、EED和SUZ12 共同組成多 梳蛋白抑制復(fù)合物（Polycomb Repressive Complex 2，PRC2)，它以反式作用方式（in trans)影響HOXD位點(diǎn)上H3組蛋白27位賴氨酸的三甲基化，進(jìn)而抑制HOXD位點(diǎn)的基因轉(zhuǎn)錄。 近年來研究發(fā)現(xiàn)，包括Hotair在內(nèi)的至少20%的IncRNAs的功能活動都與PRC2相關(guān)。在2010 年，Chang課題組同時在Nature和Science雜志發(fā)表論文，提出賴氨酸特異性組蛋白去甲基 化酶l(Lysine specific demethylase 1，LSDl)/CoREST/REST復(fù)合物被Hotair的3'端所 募集，與被5 '端募集的PRC2復(fù)合物分別發(fā)揮對H3組蛋白27位賴氨酸的三甲基化以及對H3組 蛋白4位賴氨酸的去基化作用。同年，Reinberg課題組進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)PRC2重要成員EZH2的354 位蘇氨酸的磷酸化對其與Hotair的結(jié)合至關(guān)重要。
[0003] Hotair在腫瘤中的研究始于2010年，Chang課題組在原發(fā)乳腺癌和侵襲性乳腺癌 的臨床標(biāo)本中都發(fā)現(xiàn)了Hotair的高表達(dá)，細(xì)胞系的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Hotair可以增加腫 瘤細(xì)胞侵襲性，而敲低Hotair后可以抑制乳腺癌細(xì)胞在裸鼠皮下腫瘤的生長。上述研究第 一次把Hotair與腫瘤的惡性表型聯(lián)系起來，并推測其機(jī)制可能是PRC2抑制了侵襲抑制因子 的表達(dá)所致。隨后，Chang以Hotair為例提出了IncRNAs的可能作用機(jī)制，包括IncRNA與其他 RNA(lncRNA、mRNA和短非編碼RNA)的互補(bǔ)結(jié)合作用，RNA-DNA互補(bǔ)結(jié)合作用，IncRNA結(jié)構(gòu)介 導(dǎo)蛋白與mRNA的直接作用以及蛋白質(zhì)聯(lián)接子（linker)的作用，進(jìn)而該課題組又把連接子的 概念衍生成為腳手架RNA(Scaffold RNA)。
[0004] 在肝癌患者手術(shù)切除標(biāo)本中，Hotair的表達(dá)水平與患者的疾病進(jìn)展關(guān)系緊密并能 夠預(yù)測肝癌患者肝移植后腫瘤的復(fù)發(fā);體外敲除Hotair后可以抑制腫瘤增殖和侵襲性生 長，并和順鉑和阿霉素的敏感性有關(guān)。在胰腺癌、胃腸間質(zhì)腫瘤和鼻咽癌中，Hotair的表達(dá) 水平與腫瘤的預(yù)后和疾病級別相關(guān)，而侵襲性乳腺癌中Hotair和EZH2的原位雜交的強(qiáng)信號 則昭示了患者的惡性預(yù)后。同時也發(fā)現(xiàn)，Hotair的表達(dá)水平和基因組的甲基化水平相關(guān)，尤 其和抑癌基因 PTEN的啟動子甲基化有關(guān)。隨后發(fā)現(xiàn)，Hotair在胰腺癌中的作用存在PRC2依 賴性和非依賴性兩種模式，并在細(xì)胞系基因敲除實(shí)驗(yàn)中證實(shí)Hotair與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)。
[0005] 自2012年初，本課題組對220例不同級別的膠質(zhì)瘤進(jìn)行了表達(dá)譜和臨床資料分析， 發(fā)現(xiàn)112個IncRNAs在不同級別膠質(zhì)瘤之間存在差異表達(dá)，其中在高級別膠質(zhì)瘤中74個 IncRNAs上調(diào)而38個下調(diào)；多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)Hotair是獨(dú)立于常規(guī)病理診斷指標(biāo)的一個 獨(dú)立的膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后指標(biāo)。同時，更加有意義的發(fā)現(xiàn)在于:應(yīng)用基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis，GSEA)與Hotair表達(dá)一致上調(diào)的mRNA，發(fā)現(xiàn)其顯著富集的細(xì)胞 信號通路是對細(xì)胞周期的推動。此外，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，Hotair的表達(dá)水平在美國癌癥基 因組圖譜計劃(TCGA)的四個亞型具有明顯的差異，其中在經(jīng)典型和間質(zhì)型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中 表達(dá)豐度明顯高于神經(jīng)元型和前神經(jīng)元型，這一發(fā)現(xiàn)與前期發(fā)現(xiàn)的i3-catenin/STAT3調(diào)控 基因優(yōu)勢表達(dá)經(jīng)典型和間質(zhì)型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤具有高度的一致性，說明Hotair與β-catenin/ STAT3信號通路之間存在一定內(nèi)在的聯(lián)系;本課題組同時發(fā)現(xiàn)Hotair在膠質(zhì)瘤中的作用存 在PRC2依賴性和非依賴性兩種模式，這樣的結(jié)論和以前的研究結(jié)果相吻合。雖然Hotair與 腫瘤發(fā)生與發(fā)展之間關(guān)系的研究日趨成熟，但對Hotair的特異性抑制劑的研究還屬空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明就是為了解決目前尚無 Hotair的特異性抑制劑的問題，所提出的一種 Hotair小分子抑制劑及在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0008] -種Hotair小分子抑制劑，所述Hotair小分子抑制劑的化學(xué)名稱為7-氮-2-[4-(7-氮-3-氧-4，9_二氫呋喃[3,2-b]喹喔啉-2-基)苯基]-4，9_二氫呋喃[3,2-b]喹喔啉-3-酮，分子量為540，其特異性的抑制Hotair的5 '端與PRC2中的EZH2蛋白結(jié)合，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為
[0009] 所述Hotair小分子抑制劑與hotair和EZH2的接位結(jié)合能力deltaG=-10 · 5kcal/ mol 〇
[0010] -種上述Hotair小分子抑制劑在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明獲得了如下的有益效果。
[0012]本發(fā)明有效的解決了目前尚無 Hotair的特異性抑制劑的問題。本發(fā)明所述的 Ho ta i r小分子抑制劑能特異性的抑制Ho ta i r的活性，有效的降低EZH2的表達(dá)，并抑制β-catenin和ΡΚΜ2的表達(dá);能夠在U87細(xì)胞中有效的抑制ΕΖΗ2入核;小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，其能有 效抑制乳腺癌腫瘤模型的生長和肺轉(zhuǎn)移，對腫瘤實(shí)現(xiàn)有效的抑制。本發(fā)明對腫瘤發(fā)生、發(fā)展 和治療的研究具有重大的臨床意義，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0013]圖1是本發(fā)明小分子抑制劑NSC372295的化學(xué)結(jié)構(gòu)式； 圖2是本發(fā)明小分子抑制劑NSC372315的化學(xué)結(jié)構(gòu)式； 圖3是本發(fā)明小分子抑制劑NSC372303的化學(xué)結(jié)構(gòu)式； 圖4是本發(fā)明3種小分子抑制劑對Hotair下游活性的影響圖； 圖5是本發(fā)明不同濃度的小分子抑制劑NSC372295對Hotair下游活性的影響圖； 圖6是本發(fā)明3種小分子抑制劑在U87細(xì)胞中對EZH2入核的影響圖； 圖7是本發(fā)明小分子抑制劑NSC372295對裸鼠乳腺癌模型生長的影響圖； 圖8是本發(fā)明裸鼠乳腺癌模型中注射小分子抑制劑NSC372295天數(shù)與腫瘤熒光強(qiáng)度之 間的曲線變化圖； 圖9是本發(fā)明裸鼠乳腺癌模型中注射小分子抑制劑NSC372295天數(shù)與腫瘤體積之間的 曲線變化圖； 圖10是本發(fā)明小分子抑制劑NSC372295對裸鼠乳腺癌模型原位腫瘤的影響圖； 圖11是本發(fā)明小分子抑制劑NSC372295對裸鼠乳腺癌模型肺部轉(zhuǎn)移的影響圖； 圖12是本發(fā)明小分子抑制劑NSC372295對裸鼠乳腺癌模型肺部轉(zhuǎn)移的影響圖； 圖13是本發(fā)明對照組第35天小鼠肺部切片圖； 圖14是本發(fā)明NSC372295給藥組第35天小鼠肺部切片圖； 圖15是本發(fā)明對照組第42天小鼠肺部切片圖； 圖16是本發(fā)明NSC372295給藥組第42天小鼠肺部切片圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
[0015] 一、Hotair 的核苷酸序列（NR_003716.3) I cctccaggcc ctgccttctg cctgcacatt ctgccctgat ttccggaacc tggaagccta 61 ggcaggcagt ggggaactct gactcgcctg tgctctggag cttgatccga aagcttccac 121 agtgaggact gctccgtggg ggtaagagag caccaggcac tgaggcctgg gagttccaca 181 gaccaacacc cctgctcctg gcggctccca cccgggactt agaccctcag gtccctaata 241 tcccggaggt gctctcaatc agaaaggtcc tgctccgctt cgcagtggaa tggaacggat 301 ttagaagcct gcagtagggg agtggggagt ggagagaggg agcccagagt tacagacggc 361 ggcgagagga aggaggggcg tctttatttt tttaaggccc caaagagtct gatgtttaca 421 agaccagaaa tgccacggcc gcgtcctggc agagaaaagg ctgaaatgga ggaccggcgc 481 cttccttata agtatgcaca ttggcgagag aagtgctgca acctaaacca gcaattacac 541 ccaagctcgt tggggcctaa gccagtaccg acctggtaga aaaagcaacc acgaagctag 601 agagagagcc agaggaggga agagagcgcc agacgaaggt gaaagcgaac cacgcagaga 661 aatgcaggca agggagcaag gcggcagttc ccggaacaaa cgtggcagag ggcaagacgg 721 gcactcacag acagaggttt atgtattttt attttttaaa atctgatttg gtgttccatg 781 aggaaaaggg aaaatctagg gaacgggagt acagagagaa taatccgggt cctagctcgc 841 cacatgaacg cccagagaac gctggaaaaa cctgagcggg tgccggggca gcacccggct 901 cgggtcagcc actgccccac accgggccca ccaagccccg cccctcgcgg ccaccggggc 961 ttccttgctc ttcttatcat ctccatcttt atgatgaggc ttgttaacaa gaccagagag 1021 ctggccaagc acctctatct cagccgcgcc cgctcagccg agcagcggtc ggtgggggga 1081 ctgggaggcg ctaattaatt gattcctttg gactgtaaaa tatggcggcg tctacacgga 1141 acccatggac tcataaacaa tatatctgtt gggcgtgagt gcactgtctc tcaaataatt 1201 tttccatagg caaatgtcag agggttctgg atttttagtt gctaaggaaa gatccaaatg 1261 ggaccaattt taggaggccc aaacagagtc cgttcagtgt cagaaaatgc ttccccaaag 1321 gggttgggag tgtgttttgt tggaaaaaag cttgggttat aggaaagcct ttccctgcta 1381 cttgtgtaga cccagcccaa tttaagaatt acaaggaagc gaaggggttg tgtaggccgg 1441 aagcctctct gtcccggctg gatgcagggg acttgagctg ctccggaatt tgagaggaac 1501 atagaagcaa aggtccagcc tttgcttcgt gctgattcct agacttaaga ttcaaaaaca 1561 aatttttaaa agtgaaacca gccctagcct ttggaagctc ttgaaggttc agcacccacc 1621 caggaatcca cctgcctgtt acacgcctct ccaagacaca gtggcaccgc ttttctaact 1681 ggcagcacag agcaactcta taatatgctt atattaggtc tagaagaatg catcttgaga 1741 cacatgggta acctaattat ataatgcttg ttccatacag gagtgattat gcagtgggac 1801 cctgctgcaa acgggacttt gcactctaaa tatagacccc agcttgggac aaaagttgca 1861 gtagaaaaat agacatagga gaacacttaa ataagtgatg catgtagaca cagaaggggt 1921 atttaaaaga cagaaataat agaagtacag aagaacagaa aaaaaatcag cagatggaga 1981 ttaccattcc caatgcctga acttcctcct gctattaaga ttgctagaga attgtgtctt 2041 aaacagttca tgaacccaga agaatgcaat ttcaatgtat ttagtacaca cacagtatgt 2101 atataaacac aactcacaga atatattttc catacattgg gtaggtatgc actttgtgta 2161 tatataataa tgtattttcc atgcagtttt aaaatgtaga tatattaata tctggatgca 2221 ttttctgtgc actggtttta tatgccttat ggagtatata ctcacatgta gctaaataga 2281 ctcaggactg cacattcctt gtgtaggttg tgtgtgtgtg gtggttttat gcataaataa 2341 agttttacat gtggtgaata taaa 二、 小分子抑制劑的篩選 Hotair的小分子抑制劑是從美國癌癥研究院(NIH)的癌癥治療計劃(DTP)中篩選獲得。 本發(fā)明利用計算機(jī)結(jié)構(gòu)模擬Hotair 5 '端的3D結(jié)構(gòu)(MC-SYM)，從DTP數(shù)據(jù)庫中篩選與之結(jié)合 位點(diǎn)相匹配的化合物，并挑選出匹配度前三位的化合物，分別是7-氮-2-[4-(7-氮-3-氧-4， 9_二氫呋喃[3,2-b]喹喔啉-2-基）苯基]-4，9_二氫呋喃[3,2-b]喹喔啉-3-酮，命名為 吧〇372295，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示;2,2'-苯-1，4-二基雙(4,9-二氫呋喃（2,3-13)喹喔啉-3-(2H)-酮），命名為NSC372315,化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖2所示;7-氯代-2-(4-(7-氯代-3-氧代-4,9-二氫呋喃（3,2-b)喹喔啉-2-基）苯基）-4,9-二氫呋喃（3,2-b)喹喔啉-3-酮，命名為 NSC372303,化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖3所示。這3種小分子抑制劑均可以從DTP免費(fèi)獲得（網(wǎng)站地址 http://dtp.cancer.gov/OrderAuth) 三、 小分子抑制劑IC50的檢測 利用M T T法檢測三種小分子抑制劑的IC 5 0 (被測量的拮抗劑的半抑制濃度，h a I f maximal inhibitory concentration)，實(shí)驗(yàn)方法如下： (1) 處于對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞常規(guī)消化（100mm直徑大皿，用Iml胰酶37°消化30s-lmin)，接種于96孔板中，接種量4000個(200μ1)/孔； (2) 接種24小時后，加入濃度梯度為100、200、300、400、500、600、700、800、900、 1000ug/ml 的 NSC372295，NSC372315 和 NSC372303化合物； (3) 處理72hrs后進(jìn)行MTT檢測:將濃度為5mg/ml的MTT液以每孔20μ1加入待測的96孔板 內(nèi)，37°C培養(yǎng)4小時，小心棄上清液，每孔加 DMSO 200μ1并振蕩15min已完全溶解結(jié)晶，最后 用紫外分光光度計570nm波長測定各孔的吸光度(A值），取每組10孔的均值； (4) 腫瘤細(xì)胞存活率計算方法:用未做任何處理的細(xì)胞(Control)作為對照，求出試驗(yàn) 組腫瘤細(xì)胞存活率： M 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞A值 月中瘤細(xì)胞存活率=-~~-如祕\士 -- (釋) 空白對照細(xì)胞為値 (5)統(tǒng)計學(xué)處理 所用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS16統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分 析，按照P<〇. 05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
[0016]結(jié)果顯示，NSC372295在U87細(xì)胞中的IC50值為384nM，U87vIII 中為290nM; NSC372315 在 U87 細(xì)胞中的 IC50 值為 297nM，在 U87vIII 中為 189nM;NSC372303 在 U87 細(xì)胞中的 IC50 值為356nM，在 U87vII I 中為264nM。
[0017]四、小分子抑制劑對Hotair下游活性的影響 取540mg小分子化合物NSC372295溶解于0.5ml DMSO中，配制為0.2M的母液。6孔板中接 種腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量為10-15萬，使用中皿則接種量為20-30萬；用10% FBS的DMEM培養(yǎng)24h 后，加入NSC372295母液使終濃度分別為50、100、200 μΜ，培養(yǎng)24h后，利用western blot在 膠質(zhì)瘤U87和U87_vIII細(xì)胞系中，檢測ΕΖΗ2、β -catenin和PKM2的表達(dá)。western blot具體 方法如下： (1)處理細(xì)胞24h后用預(yù)冷的PBS(0.01M，pH7.4)洗滌細(xì)胞2次，加入400μ1預(yù)冷的蛋白裂 解液（〇.lmol/L NaCl，0.01mol/L Tris-Cl PH7.6,0.001mol EDTA PH8.0，lμg/ml Aprotinin，100μg/ml PMSF，1% NP40)，置冰浴中30min使其充分裂解。4°C、12000轉(zhuǎn)/分離心 15min，取上清2μ1用NanoDrop ND-1000進(jìn)行蛋白定量，剩余混合物與等體積2 X SDS上樣緩 沖液（Tris100 mmol/L，DTT 200mmol/L，SDS 4%，溴酚蘭 0.2%，甘油 20%)混合后煮沸 10分 鐘。
[0018] (2)蛋白冷卻短暫離心后上樣，每個上樣孔加入約30yg總蛋白。80V的電壓電泳至 染料進(jìn)入分離膠后，將電壓增加到150V直至染料到達(dá)分離膠底部，終止電泳。
[0019] (3)將電泳后的凝膠浸于電泳轉(zhuǎn)移液（25mmol/L Tris，92 mmol/L甘氨酸，lg/L SDS，20% v/v甲醇，pH7.5)中平衡約20分鐘；其間裁出與凝膠大小相等的PVDF膜和2張3M濾 紙，將PVDF膜浸于甲醇中15秒，取出后迅速浸于DDW中10分鐘，將PVDF膜和3張濾紙在電轉(zhuǎn)液 中浸透;將凝膠支架打開放平，在陰極板上鋪上一層預(yù)先浸透的海綿板，將一張濾紙鋪于陰 極板中央，驅(qū)除氣泡;將凝膠平鋪于濾紙上，驅(qū)除氣泡;于凝膠上鋪PVDF膜，驅(qū)除氣泡;再在 其上鋪一張濾紙，驅(qū)除氣泡;在濾紙上鋪一層浸透的海綿板，將陽極板合上，關(guān)上支架;將支 架垂直插入電轉(zhuǎn)槽內(nèi)，連同已放入冰的冰槽一起垂直放入轉(zhuǎn)移盒中，加入預(yù)冷電轉(zhuǎn)液，使其 不超過電轉(zhuǎn)槽的上緣;4 °C或冰浴條件下80V電轉(zhuǎn)60min。
[0020] (4)電轉(zhuǎn)完畢后，取下PVDF，PBST(PBS pH 7.5,0.1% Tween-20)中漂洗洗2次每次 5m i η。封閉液中室溫封閉I h (或4 °C過夜），封閉非特異性抗體結(jié)合位點(diǎn);倒掉封閉液，加入一 抗（I :1000膜封閉液稀釋），4°C雜交過夜(或室溫3-4h);大量I3BST漂洗3次每次IOmin;加入 二抗(1:1000PBST稀釋)室溫雜交1小時，大量PBST漂洗3次每次10min。
[0021] (5)采用化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)，將PVDF膜平鋪于平皿內(nèi)，將Western blot發(fā)光液加于 PVDF膜上，放入凝膠成像系統(tǒng)(Syngene，G_box)中，采集圖像。
[0022] (6)將顯影后的PVDF膜浸于IOml洗脫緩沖液(62.5mM Tris-HCl pH6.8，2% SDS， IOOmM β-巰基乙醇）中，70°C水浴靜止孵育30分鐘；用I3BST漂洗3次每次5min;膜封閉液封閉 Ih(或4°C過夜）；倒掉封閉液，進(jìn)行二次雜交，加入一抗（1:1000膜封閉液稀釋），4 °C雜交過 夜(或室溫3-4h); 大量PBST漂洗3次每次IOmin;加入二抗（1: 1000PBST稀釋)室溫雜交1小時，大量PBST漂 洗3次每次lOmin。采用化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)，將PVDF膜平鋪于平皿內(nèi)，將Western blot發(fā)光液 加于PVDF膜上，放入凝膠成像系統(tǒng)中，采集圖像。
[0023] (7)用Quantify One軟件分析目的條帶的灰度值，以灰度值大小代表目的蛋白的 表達(dá)量。目的蛋白條帶相對表達(dá)量計算方法： 百的條帶的灰度値 目酌羅白相對表達(dá)量=--- 同一丨手本內(nèi)參的灰度值 如圖4所示，在U87細(xì)胞中，與NSC372315、NSC372303相比NSC372295能夠最有效的降低 EZH2的表達(dá)，并抑制β-catenin和PKM2的表達(dá)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出NSC372295對Hotair的下 游活性具有最好的抑制效果。
[0024] 在U87vIII細(xì)胞中進(jìn)行進(jìn)一步的研究，檢測不同濃度的NSC372295細(xì)胞對Hotair下 游蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)在50nM的微量下，即可達(dá)到抑制下游PKM2能表達(dá)的作用（圖5)。
[0025] 五、小分子抑制劑對EZH2入核的影響 EZH2在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮甲基化H3K27的生物學(xué)功能，本發(fā)明利用免疫熒光技術(shù)檢測小分 子抑制劑對EZH2入核的影響，實(shí)驗(yàn)方法如下： (I) 已加藥處理或轉(zhuǎn)染處理72 h的細(xì)胞接種于共聚焦專用培養(yǎng)皿里，冰PBS洗三遍，每 次5分鐘； (2 )細(xì)胞半干時，覆蓋以4%冷的多聚甲醛固定15分鐘，避光； (3) 吸去多余多聚甲醛后，用冰的I3BS洗三遍，每次5分鐘； (4) 0.5 % Triton X-100覆蓋細(xì)胞10分鐘，冰I3BS洗三遍，每次5分鐘； (5) 用進(jìn)口胎牛血清室溫封閉30分鐘； (6) 配制一抗(抗體按照說明書的推薦稀釋量稀釋）；加入一抗覆蓋細(xì)胞，錫紙包裹4°C 避光過夜； (7) 取出細(xì)胞復(fù)溫至室溫約I h; (8) 冰1%〇 Tween搖洗兩次，每次5分鐘;冰I3BS搖床上搖洗一次，5分鐘； (9) 用I3BS配制熒光標(biāo)記二抗(濃度參考熒光二抗的說明）；加入二抗，室溫孵育1小時 (避光）； (10) 冰1%〇 Tween于搖床上搖洗兩次，每次5分鐘;冰I3BS搖床上搖洗一次，5分鐘； (II) DAPI染核，每皿1滴，完全覆蓋住細(xì)胞即可； (12) 冰1%〇 Tween于搖床上搖洗兩次，每次5分鐘;冰I3BS搖床上搖洗一次，5分鐘； (13) 加入水性防熒光淬滅封片劑，避光； (14) 共聚焦顯微鏡(Olympus，F(xiàn)V-1000)照相。
[0026] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，與NSC372315、NSC372303相比NSC372295在IC50濃度的處理 下，能夠在U87細(xì)胞中最有效的抑制EZH2入核。
[0027 ]六、小分子抑制劑抑制小鼠腫瘤模型的生長 本實(shí)驗(yàn)選取小鼠乳腺癌皮下原位模型 (1)模型建立 取轉(zhuǎn)染過表達(dá)熒光素酶的重組慢病毒的MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞經(jīng)0.125%胰酶 消化，1000 rpm常溫離心10分鐘去上清，以PBS離心洗滌2次;計算細(xì)胞數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度 至5 X 107/ml，將細(xì)胞懸浮于無血清DMEM培養(yǎng)液中，制成細(xì)胞懸液。然后用量程為100μ1的 無菌微量進(jìn)樣器抽取IOOyL (約含5 X IO6細(xì)胞)細(xì)胞懸液，接種于裸鼠前胸皮下脂肪墊處。 接種完畢后，常規(guī)皮膚消毒，放于籠中。
[0028] (2)腫瘤大小觀察 將MDA-MB-231荷瘤小鼠各隨機(jī)分為兩組(n=6只/組），DMS0治療組及372295治療組，開 始進(jìn)行腫瘤的治療。治療劑量分別為DMSO組：100μ1 DMSO與無血清的DMEM 1:1混合溶液； 372295組：按照25mg/kg劑量溶于100μΙ DMSO與無血清的DMEM 1:1混合溶液中。隔天給藥， 共給藥2周。治療采取腹腔注射的方法共治療，每次治療前，用游標(biāo)卡尺測量一次腫瘤的長 徑(L)及寬徑(W)，按公式:V=(LW 2)/2計算腫瘤體積。同時在治療的第1天，對兩組小鼠進(jìn)行 第1次生物發(fā)光成像，以了解腫瘤細(xì)胞的生長情況，并記為Days 0。此后每1周，進(jìn)行1次成 像，連續(xù)成像5周。
[0029]結(jié)果顯示，NSC372295對裸鼠乳腺癌的生長具有顯著性的抑制作用，給藥組相較于 DMSO組，腫瘤體積得到了明顯的控制（如圖7-9所示）。進(jìn)一步的，對小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的研 究發(fā)現(xiàn)，295給藥組在熒光檢測中肺部未發(fā)現(xiàn)明顯的轉(zhuǎn)移抑制作用(如圖10-16所示）。
[0030] SEQUENCE LISTING 〈11〇>天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 〈120> Hotair小分子抑制劑及在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用 <130> 1 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2364 <212> DNA <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <220> <221> Hotair 〈222> (1)..(2364) <400> 1 cctccaggcc ctgccttctg cctgcacatt ctgccctgat ttccggaacc tggaagccta 60 ggcaggcagt ggggaactct gactcgcctg tgctctggag cttgatccga aagcttccac 120 agtgaggact gctccgtggg ggtaagagag caccaggcac tgaggcctgg gagttccaca 180 gaccaacacc cctgctcctg gcggctccca cccgggactt agaccctcag gtccctaata 240 tcccggaggt gctctcaatc agaaaggtcc tgctccgctt cgcagtggaa tggaacggat 300 ttagaagcct gcagtagggg agtggggagt ggagagaggg agcccagagt tacagacggc 360 ggcgagagga aggaggggcg tctttatttt tttaaggccc caaagagtct gatgtttaca 420 agaccagaaa tgccacggcc gcgtcctggc agagaaaagg ctgaaatgga ggaccggcgc 480 cttccttata agtatgcaca ttggcgagag aagtgctgca acctaaacca gcaattacac 540 ccaagctcgt tggggcctaa gccagtaccg acctggtaga aaaagcaacc acgaagctag 600 agagagagcc agaggaggga agagagcgcc agacgaaggt gaaagcgaac cacgcagaga 660 aatgcaggca agggagcaag gcggcagttc ccggaacaaa cgtggcagag ggcaagacgg 720 gcactcacag acagaggttt atgtattttt attttttaaa atctgatttg gtgttccatg 780 aggaaaaggg aaaatctagg gaacgggagt acagagagaa taatccgggt cctagctcgc 840 cacatgaacg cccagagaac gctggaaaaa cctgagcggg tgccggggca gcacccggct 900 cgggtcagcc actgccccac accgggccca ccaagccccg cccctcgcgg ccaccggggc 960 ttccttgctc ttcttatcat ctccatcttt atgatgaggc ttgttaacaa gaccagagag 1020 ctggccaagc acctctatct cagccgcgcc cgctcagccg agcagcggtc ggtgggggga 1080 ctgggaggcg ctaattaatt gattcctttg gactgtaaaa tatggcggcg tctacacgga 1140 acccatggac tcataaacaa tatatctgtt gggcgtgagt gcactgtctc tcaaataatt 1200 tttccatagg caaatgtcag agggttctgg atttttagtt gctaaggaaa gatccaaatg 1260 ggaccaattt taggaggccc aaacagagtc cgttcagtgt cagaaaatgc ttccccaaag 1320 gggttgggag tgtgttttgt tggaaaaaag cttgggttat aggaaagcct ttccctgcta 1380 cttgtgtaga cccagcccaa tttaagaatt acaaggaagc gaaggggttg tgtaggccgg 1440 aagcctctct gtcccggctg gatgcagggg acttgagctg ctccggaatt tgagaggaac 1500 atagaagcaa aggtccagcc tttgcttcgt gctgattcct agacttaaga ttcaaaaaca 1560 aatttttaaa agtgaaacca gccctagcct ttggaagctc ttgaaggttc agcacccacc 1620 caggaatcca cctgcctgtt acacgcctct ccaagacaca gtggcaccgc ttttctaact 1680 ggcagcacag agcaactcta taatatgctt atattaggtc tagaagaatg catcttgaga 1740 cacatgggta acctaattat ataatgcttg ttccatacag gagtgattat gcagtgggac 1800 cctgctgcaa acgggacttt gcactctaaa tatagacccc agcttgggac aaaagttgca 1860 gtagaaaaat agacatagga gaacacttaa ataagtgatg catgtagaca cagaaggggt 1920 atttaaaaga cagaaataat agaagtacag aagaacagaa aaaaaatcag cagatggaga 1980 ttaccattcc caatgcctga acttcctcct gctattaaga ttgctagaga attgtgtctt 2040 aaacagttca tgaacccaga agaatgcaat ttcaatgtat ttagtacaca cacagtatgt 2100 atataaacac aactcacaga atatattttc catacattgg gtaggtatgc actttgtgta 2160 tatataataa tgtattttcc atgcagtttt aaaatgtaga tatattaata tctggatgca 2220 ttttctgtgc actggtttta tatgccttat ggagtatata ctcacatgta gctaaataga 2280 ctcaggactg cacattcctt gtgtaggttg tgtgtgtgtg gtggttttat gcataaataa 2340 agttttacatgtggtgaata taaa 2364
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種Hotair小分子抑制劑，其特征在于:所述Hotair小分子抑制劑的化學(xué)名稱為7_ 氮-2-[4-(7-氮-3-氧-4，9-二氫呋喃[3，2-b]喹喔啉-2-基)苯基]-4，9-二氫呋喃[3，2-b] 喹喔啉-3-酮，分子量為540，其特異性的抑制Hotair的5'端與PRC2中的EZH2蛋白結(jié)合，化 學(xué)結(jié)構(gòu)式?2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種Hotair小分子抑制劑，其特征在于:所述Hotair小分子 抑制劑與hotair和EZH2的接位結(jié)合能力deltaG=_10 · 5kcal/mol。3. -種權(quán)利要求1所述Hotair小分子抑制劑在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P35/00GK105859749SQ201610291580
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月5日
【發(fā)明人】康春生, 任玉, 王琦雪, 王蘊(yùn)非, 周冰聰, 周俊虎
【申請人】天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院