血栓靶向釋放rgds的抗栓劑聚天冬酰-rgds的合成和應用
【專利說明】血栓靶向釋放RGDS的抗栓劑聚天冬釀-RGDS的合成和應用 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明涉及血栓靶向釋放RGDS的聚天冬酰-RGDS,涉及它的制備方法,涉及它在 大鼠血栓模型上的靶向抗血栓作用。因而本發(fā)明闡明了聚天冬酰-RGDS作為靶向抗血栓劑 的臨床應用前景。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域。
【背景技術】
[0002] 血小板血栓是血栓形成的起始階段,可以分為血小板粘附、活化和聚集三個過程。 在血小板血栓形成過程中,血小板膜上GPIIb/IIla活化,構象發(fā)生改變,然后在Ca2+的參與 下,與纖維蛋白原或vWF上的R⑶四肽序列特異性結(jié)合將血小板和紅血球偶聯(lián)起來,形成血 栓。在血小板聚集過程中,纖維蛋白原或vWF上的RGDS與活化的血小板表面受體GPlib/ Ilia結(jié)合起至關重要的作用。外源性RGDS與被GPIlb/IIIa識別并競爭性抑制纖維蛋白 原或vWF與血小板結(jié)合,抑制血小板聚集。血栓形成部位富集了活化的血小板,這些血小板 是血栓形成的重要構件。如果能把RGDS定向釋放到血栓形成部位,就可以使這些活化的血 小板不能參與血栓形成,從而有效地抑制血栓形成??墒?,這個目標在本發(fā)明申請之前沒有 達到。根據(jù)這些認識,發(fā)明人提出了本發(fā)明。本發(fā)明的突出創(chuàng)造性在于用聚天冬酰-RGDS 將RGDS輸送到血栓形成部位,然后在血栓中有效地釋放RGDS,發(fā)揮靶向抗血栓作用。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003] 本發(fā)明的第一個內(nèi)容是采用常規(guī)的液相合成,逐步接肽制備HC1 ·Αα(Τ〇8)-617_Α sp(OBzl)_Se(Bzl)-〇Bzl。
[0004] 本發(fā)明的第二個內(nèi)容是采用標準方法,制備平均分子量為20964,鏈長為173個天 冬氨酸殘基的聚天冬氨酸。
[0005]本發(fā)明的第三個內(nèi)容是采用EDC法將HC1*Arg(Tos) -Gly-Asp(OBzl)-Se(Bzl) -0B zl偶聯(lián)到聚天冬氨酸的羧基上然后脫去RGDS的側(cè)鏈和羧端保護基,制備聚天冬酰-RGDS。
[0006] 本發(fā)明的第四個內(nèi)容是測定聚天冬酰-RGDS的抗血小板聚集活性。
[0007] 本發(fā)明的第五個內(nèi)容是測定聚天冬酰-RGDS的抗血栓活性。
[0008] 本發(fā)明的第六個內(nèi)容是測定聚天冬酰-RGDS對GPIIb/IIIa的影響。
[0009] 本發(fā)明的第七個內(nèi)容是測定聚天冬酰-RGDS在血栓中釋放RGDS。
[0010] 本發(fā)明中所出現(xiàn)的縮略語的說明:
[0011]RGDSArg-Gly-Asp-Ser
[0012]PD 聚天冬氨酸
[0013]聚天冬酰-RGDS聚天冬酰-Arg-Gly-Asp-Ser
[0014]THF 四氫呋喃
[0015]DCC 二環(huán)己基酰亞胺
[0016]DCU 二環(huán)己基脲
[0017]OBzl芐氧基
[0018]Boc 叔丁氧羰基
[0019]Tos 對甲苯橫酸基
[0020] OMe 甲氧基
[0021] HOBtN-羥基苯并三唑
[0022] NMMN-甲基嗎啉
[0023]EDC 1_ (3_二甲氛基丙基)_3_乙基碳二亞胺
[0024]PAF 血小板活性因子
[0025] ADP 腺苷二磷酸
[0026] AA 花生四烯酸
[0027]TE 凝血酶
【附圖說明】
[0028]圖 1.聚天冬酰-RGDS的合成路線·i)85%H3P04,180°C,減壓;ii)NaOH,H20,0°C; iii)EDC/H0Bt;iv)DCC,HoBt,0°C;v)Na0H(2N),H20,0°C;vi)氯化氫的乙酸乙酯溶液(4N); vii)CF3C02H,CF3S03H〇
[0029] 圖2.聚天冬酰-RGDS治療的大鼠血液提取物的FT-MS譜(上)和血栓提取物的 FT-MS譜(下)。
【具體實施方式】
[0030] 為了進一步闡述本發(fā)明,下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的,它 們僅用來對本發(fā)明進行具體描述,不應當理解為對本發(fā)明的限制。
[0031]實施例 1 制備HC1 ·Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl
[0032]1)制備Boc-Arg(Tos)-Gly-〇Bzl
[0033]將 4. 986g(ll. 64mmol)Boc-Arg(Tos),1. 310g(9. 7mmol)H0Bt溶于 30mL無水THF, 往得到的溶液中加2. 398g(11. 64mmol)DCC的無水THF溶液,冰浴攪拌20min,得到反應液 I。 將3. 273g(9. 7mmol)Tos·Gly-〇Bzl與30mL無水THF的溶液用NMM調(diào)pH9,得到反應液 II。 將反應液II加到反應液I中,室溫反應12小時。TLC(丙酮:石油醚=2 : 1)顯示反 應完成。過濾除去DCU沉淀,濾液減壓濃縮,殘留物用150mL乙酸乙酯溶解,過濾除去DCU 沉淀。濾液分別用飽和NaHC03 (50mLX1),5 %NaHC03 (50mLX2),飽和NaCl(50mLX3),5 % KHS04 (50mLX 3),飽和NaCl(50mLX 3),5 %NaHC03 (50mLX 3),飽和NaCl(50mLX 3)洗,加無 水NaS04干燥。濾出干燥后的乙酸乙酯溶液,減壓濃縮得到的5.339g淡黃色固體粗品用硅 膠柱純化(丙酮:石油醚=1:4),得到4. 93g(88%)純品,為無色固體。
[0034] 2)制備Boc-Arg(Tos)-Gly
[0035]在冰浴下將 5. 291g(9. 19mmol)Boc-Arg(Tos)-Gly-〇Bzl溶于 20mL甲醇,往得到 的溶液中加14mLNaOH水溶液(2N),攪拌1小時,TLC(丙酮:石油醚=1 : 1)顯示反應完 成。反應液用飽和KHS〇3fpH7,減壓濃縮。殘留液先用NaOH水溶液(2N)調(diào)pH9,再用乙醚 萃取。水層用飽和KHS04調(diào)pH2,用50mL乙酸乙酯萃取3次,合并的乙酸乙酯萃取液加無水 NaS04干燥。濾出干燥后的乙酸乙酯溶液,減壓濃縮得到3. 782g(84% )B〇C-Arg(T〇s)-Gly, 為無色固體。ESI-MS(m/e) :377[M+H]+。
[0036] 3)制備Boc-Asp(OBzl)_Se(Bzl)-OBzl
[0037]按照制備Boc-Arg(Tos)-Gly-〇Bzl的方法,從 2. 716g(8. 4mmol)Boc-Asp(OBzl)和 3. 273g(7mmol)HCl.Ser(Bzl)-〇Bzl,得到 3. 339g(81% )Boc-Asp(0Bzl)_Val-0Bzl,為淺黃 色固體。
[0038] 4)制備HC1 ·Asp(OBzl)-Se(Bzl)-OBzl
[0039]在冰浴下將 2. 379g(4mmo1)Boc-Asp(OBzl)-Se(Bzl)-OBzl溶于 6mL乙酸乙酯 中,往得到的溶液中加入20mL氯化氫的乙酸乙酯溶液,攪拌4小時,TLC(丙酮:石油醚 =1 : 5)顯示反應完成,減壓抽去乙酸乙酯。殘留物加20mL無水乙醚溶解,溶液減壓濃 縮。該操作反復5次,以除去產(chǎn)品中的氯化氫。殘留物最后加5mL無水乙醚研磨,得到 1.862g(92%)產(chǎn)品,為無色粉末,直接用于下一步反應。ESI-MS(m/e) :413[M+H]+。
[0040] 5)制備Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Se(Bzl)-OBzl
[0041]按照制備Boc-Arg(Tos)-Gly-〇Bzl的方法,從 1398mg(2. 88mmol) 8〇。-八找(1'〇8)-617和 126411^(2.4臟〇1)!1(:1.八8口((》21)-56(821)-(?21得到 202311^(88%) Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(0Bzl)-Se(Bzl)-0Bzl。ESI-MS(m/e) :958[M+H]+. 4NMR(500MHz, CDC13)d/ppm= 7. 725 (d,2H),7. 583 (m,2H),7. 235 (m,18H),6. 436 (s,2H),6. 200 (s, 1H) ,5. 653 (d,J= 7. 0Hz, 1H), 5. 240(m,4H) ,4. 907 (m, 1H) ,4. 677 (m, 1H) ,4. 213 (s, 1H), 3. 942 (m, 1H) , 3. 289 (s, 1H) , 3. 144 (s, 1H) , 2. 904 (m, 1H) , 2. 795 (s, 1H) , 2. 336 (m, 3H), 2. 251(s,2H),l. 775 (d,J= 5. 5Hz,lH),l. 594 (d,J= 6. 5Hz,lH),l. 509(s,2H),l. 385 (s, 11H),1. 257(s,1H)。
[0042] 6)制備HC1 ·Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Se(Bzl)-OBzl
[0043]按照制備HC1 ·Asp(OBzl)-Val-OBzl的方法,從 2.lg(2. 19mmol)Boc-Arg(Tos)_G ly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl得 1. 782g(91 % )HC1.Arg(Tos) -Gly-Asp(OBzl)-Se(Bzl) -0 Bzl固體,直接用于下一步反應。ESI-MS(m/z)817[M+H] +。
[0044] 實施例2制備聚天冬氨酸
[0045]1)制備聚丁二酰亞胺
[0046] 將20.(^0,1^-厶8口和10.48氏?04(85%)混勻并在18〇1:減壓(0.1]\0^)反應3.5小 時。反應物趁熱產(chǎn)物用80mLDMF溶解,得到的溶液滴入400mL水中。生成的沉淀用砂芯漏斗 抽濾,濾餅磨碎成粉末,用水洗至中性,35°C減壓干燥至恒重,得到14. 4g(98. 8% )聚丁二 酰亞胺,為淡灰色粉末。1HNMR(500MHz,CDC13)d/ppm:5· 294 ( 丁二酰亞胺的H-3),3. 233 ( 丁 二酰亞胺的H-4) ·13CNMR(125MHz,CDC13)d/ppm: 173. 96 ( 丁二酰亞胺的C-3),172. 69 ( 丁二 酰亞胺的C-1),47. 82 ( 丁二酰亞胺的C-4),33. 10 ( 丁二酰亞胺的C-5).IRδ/cm1 :1711 和 1801 ( 丁二酰亞胺的C= 0),1160 和 1213 ( 丁二酰亞胺的C-N)。
[0047] 2)制備聚天冬氨酸
[0048] 冰浴下將3g聚丁二酰亞胺和1. 4gNaOH用20mL水溶解,攪拌1小時,用濃度為 35%的鹽酸調(diào)pHl,得到的溶液倒入300mL甲醇中。濾出生成的沉淀在40°C真空干燥,得 3. 2g聚天冬氨酸,為淡黃色固體。采用凝膠滲透色譜-多角激光光散射法測得聚天冬氨 酸的數(shù)均分子量(Μη)為20964g/mol,重均分子量(Mw)為30476g/mol,分子量分布(d)為 1. 4537,數(shù)均聚合度為 173。[a]D25= 1.21(C= 0.01,H20)。13CNMR(125MHz,CDC13)d/ppm =177. 87,173. 41,172. 75,172. 05,171. 89,51. 76,51. 60,39. 12,37. 61。
[0049]實施例 3 制備聚天冬酰-Arg(Tos)-Gly-Asp-(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl
[0050] 先將87mg(0. 75mmol)聚天冬氨酸溶于lmL無水DMF,冰浴下加入101mg(0. 75mmol) HOBt和 288mg(l. 50mmol)EDC,0. 5 小時后加入 624mg(0. 75mmol)HCl·Αα(Τ〇8)-61γ-Α8ρ(0 Bzl)-Val-〇Bzl,NMM調(diào)pH9。室溫攪拌24小時,TLC(二氯甲烷:甲醇,5 : 1)顯示HCl,Ar g(Tos) -Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl) -OBzl消失。反應混合物減壓