一種小分子抑制劑及在抑制鳥氨酸脫羧酶上的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及鳥氨酸脫羧酶（Ornithine decarboxylase ;0DC)的小分子抑制劑及 其應(yīng)用，具體涉及人源鳥氨酸脫羧酶的小分子抑制劑及其在抑制和殺傷腫瘤細胞中的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)是生物體的主要組成成分之一，是完成各種生命活動的主要物質(zhì)。在各種 蛋白質(zhì)中，蛋白酶對生命活動至關(guān)重要，幾乎所有生物體內(nèi)的生化反應(yīng)過程都由蛋白酶進 行催化。生物體內(nèi)各種蛋白酶的活性具有嚴(yán)格的調(diào)控機制，一旦其調(diào)控機制出現(xiàn)問題，造成 蛋白酶的活性過高、過低或者是完全失活，都會造成相應(yīng)的各類疾病。因此，通過藥物來調(diào) 控蛋白酶的活性，使其恢復(fù)和保持在正常水平，具有非常重要的理論意義和現(xiàn)實意義。以結(jié) 構(gòu)為基礎(chǔ)的藥物設(shè)計，是設(shè)計以蛋白質(zhì)為靶標(biāo)的藥物的一個非常重要的手段。
[0003] 多胺（polyamines)是一類從氨基酸代謝產(chǎn)生的帶正電的陽離子小分子，在所有 生物體中都存在，對細胞生長、分化、存活及正常生物學(xué)功能等都不可缺少。多胺帶多正電 荷的特性，使它們能通過與帶負電荷的生物大分子（DNA、RNA、蛋白質(zhì)、細胞膜等）形成靜 電作用，從而調(diào)控非常廣泛的生物學(xué)過程，包括染色體結(jié)構(gòu)形成、DNA合成與穩(wěn)定、DNA復(fù) 制、轉(zhuǎn)錄和翻譯、蛋白質(zhì)磷酸化、核糖體生成、離子通道和膜表面受體的調(diào)控、自由基清除 等。天然的多胺有很多種。在哺乳動物中，天然存在的有三種，即腐胺（putrescine)，精脒 (spermidine),精胺（spermine),它們對哺乳動物正常生長和發(fā)育必不可少。由于多胺具有 重要的生物學(xué)功能，其細胞內(nèi)水平受到嚴(yán)格的調(diào)控。在快速繁殖的細胞中，如腫瘤細胞，多 胺水平及ODC表達水平也會上升和失調(diào)。多胺水平升高，伴隨著細胞增殖加快、凋亡減少、 以及腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達水平升高等。因此，多胺的調(diào)控，成為腫瘤治療和藥物 研發(fā)中的一個重要手段。
[0004] 多胺代謝的起始底物是鳥氨酸（ornithine)，它是精氨酸在尿素循環(huán)（urea cycle)中被精氨酸酶（arginase)催化的反應(yīng)產(chǎn)物。ODC是多胺合成途徑的第一個酶，催化 從鳥氨酸（ornithine)到腐胺的反應(yīng)，該步催化反應(yīng)也是多胺合成途徑的一個限速步驟。 因此，合成ODC抑制劑，抑制腐胺的生成，是目前很受關(guān)注的一個腫瘤治療途徑。同時，由于 病原微生物也需要正常的多胺水平，ODC抑制劑也成為針對病原微生物（如導(dǎo)致非洲錐蟲 病的布氏錐蟲）的重要靶標(biāo)。
[0005] 當(dāng)前，ODC的抑制劑DFM0( a-二氟甲基鳥氨酸）已經(jīng)被用于臨床，輔助癌癥的化 療。但其與ODC的結(jié)合能力較弱，作用濃度很高，且由于是與ODC形成共價鍵的自殺性抑制 劑，毒副作用非常大。因此，非常有必要開發(fā)出具有更好效果的ODC新型抑制劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是通過計算機輔助的高通量藥物篩選，提供一種針對ODC的新型小 分子抑制劑，將其應(yīng)用于鳥氨酸脫羧酶的抑制劑，可能可以用于制備治療腫瘤、病原微生物 感染的藥物。具體為：
[0007] -種小分子抑制劑，其特征在于，該小分子抑制劑的結(jié)構(gòu)式為：
【主權(quán)項】
1. 一種小分子抑制劑，其特征在于，該小分子抑制劑的結(jié)構(gòu)式為：
其中，Ri為鄰位或間位或?qū)ξ?，Ri烷基醋、烷基釀、烷基醒或烷基麗。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小分子抑制劑，其特征在于，R1包招

3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的小分子抑制劑，其特征在于，該小分子抑制劑的結(jié)構(gòu)式為：
4. 權(quán)利要求1或2或3所述的小分子抑制劑在抑制鳥氨酸脫羧酶（ODC)上的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求1或2或3中所述的小分子抑制劑在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求1或2或3中所述的小分子抑制劑在制備治療病原微生物感染藥物中的應(yīng) 用。
7. -種小分子抑制劑抑制鳥氨酸脫羧酶（ODC)的方法，其特征在于，包括如下步驟： 1. ODC原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建 將ODC的基因序列，通過BamH I和Xho I酶切位點，插入到pET28a質(zhì)粒中，構(gòu)建出 pET28a_h0DC質(zhì)粒，經(jīng)DNA測序驗證； 2. ODC蛋白的表達 將步驟1)構(gòu)建的pET28a-h0DC質(zhì)粒通過CaCl2法，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21菌株中，通過 卡那霉素進行篩選，然后將在含有卡那霉素的Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)板上生長的菌株， 接種至含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、250rpm培養(yǎng)至對數(shù)生長期，再添加異丙 基硫代半乳糖苷（IPTG)至0. 5mM，在28°C誘導(dǎo)表達4小時，最后，離心收集細菌； 3. ODC蛋白的純化 將步驟2)中收集的細菌，用裂解液重新懸浮，然后通過超聲方法進行細胞裂解，再將 裂解液在4°C、12000轉(zhuǎn)/min，離心后，保留上清；最后將上清利用Ni-NTA His標(biāo)簽蛋白結(jié) 合填料進行結(jié)合和純化，得到ODC蛋白，ODC蛋白的洗脫緩沖液為50mM三羥甲基氨基甲烷 (Tris)/HCl, pH 8.0, 300mM NaCl，ImM DTT，IOOmM 咪唑（imidazole); 4. ODC蛋白的活性檢測 在EP管中，加入400uL底物反應(yīng)混合物、50ug的ODC蛋白，混勻后將EP管放置在37°C 水浴中30min ;加入400uL 10%的三氯乙酸終止反應(yīng)，室溫離心5000rpm、5min，然后取出 IOOuL上清，與200uL 4mol/L的NaOH溶液混合，加入400uL正戊醇，充分混合，2000rpm離 心5min，再將上層液200uL轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入200uL0.1mol/LpH為8. 0的四硼酸鈉 混合均勻、加入200uL10mmol/L三硝基苯磺酸混合充分、加入400uL DMSO,充分混合lmin， 3000rpm離心5min ;最后取出上層液到96孔板中，用酶標(biāo)儀檢測426nm處的吸光值，得到未 加酶的OD值 5)抑制劑對ODC蛋白的抑制活性的檢測 根據(jù)步驟4)中所述的方法，在加入400uL底物反應(yīng)混合物后，隨即加入鳥氨酸脫羧酶 的小分子抑制劑，后續(xù)操作同步驟4); 通過以下公式計算出ODC抑制率： 對照差=加小分子抑制劑對照組平均OD值-未加小分子抑制劑對照組平均OD值，其 中對照組在步驟5)中加入的抑制劑為DFMO抑制劑； 實驗差=加小分子抑制劑實驗組平均OD值-未加小分子抑制劑實驗組組平均OD值； ODC抑制率=[(對照差-實驗差）/對照差]X 100 %。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：步驟3)中所述的裂解液為50mM三羥甲 基氨基甲烷（Tris)/HCl, pH 8.0, 300mM NaCl，ImM DTT，ImM PMSF，5mM 咪唑（imidazole)的 混合液。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7中所述的方法，其特征在于：步驟4)中的底物反應(yīng)混合物為在 150mM pH為7. 1的磷酸鹽緩沖液（PBS)中溶解17. 57ul β -巰基乙醇，55. 84mg I. 5mM EDTA 二鹽鈉，75nM磷酸吡哆醛（PLP)儲液，2mM鳥氨酸鹽酸鹽。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：所述的鳥氨酸脫羧酶為人源鳥氨酸脫羧 酶、非人源鳥氨酸脫羧酶或與人源鳥氨酸脫羧酶的腐胺底物及磷酸吡哆醛結(jié)合位點高度同 源的蛋白質(zhì)。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種鳥氨酸脫羧酶(ODC)的小分子抑制劑及其應(yīng)用；通過計算機輔助的高通量藥物篩選，發(fā)現(xiàn)針對鳥氨酸脫羧酶(ODC)的新型小分子抑制劑，驗證其效果，發(fā)現(xiàn)對ODC具有良好的抑制作用，尤其可用于抑制人源ODC，預(yù)防、治療和診斷腫瘤疾病、病原微生物感染，研發(fā)制備腫瘤藥物或病原微生物感染類藥物。
【IPC分類】A61P31-00, A61K31-245, A61K31-167, A61P35-00, A61K31-196
【公開號】CN104739820
【申請?zhí)枴緾N201410524151
【發(fā)明人】劉森, 王艷林, 占景瓊
【申請人】三峽大學(xué)
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2014年9月30日