雞生長激素重組蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)及純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程領(lǐng)域中重組蛋白的生產(chǎn)和純化方法，特別設(shè)及雞生長激素重 組蛋白在畢赤酵母中的高效表達(dá)及純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞生長激素（chicken growth hormone，cGH)不僅對雞的正常生長發(fā)育起著必要 的調(diào)節(jié)作用，而且對雞的多種生產(chǎn)性狀也有著顯著的影響，如體重、飼料轉(zhuǎn)化率、脂肪蓄積、 蛋生產(chǎn)、抗病性等。此外，通過注射外源GH，可W在胚胎時期顯著提高雞胚重量，促進(jìn)其長骨 及軟骨組織的發(fā)育，從而提高肉用品種雞的上市體重。相對于人和哺乳動物的生長激素的 研究，雞生長激素的研究起步較晚，但是隨著蛋白異源表達(dá)的飛速發(fā)展，越來越多的表達(dá)系 統(tǒng)被建立并得到應(yīng)用，酵母作為單細(xì)胞真核生物，因具有比較完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和 對表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾能力，表現(xiàn)出不可比擬的優(yōu)勢。其中畢赤酵母(PicMa pastoris)表 達(dá)系統(tǒng)是近年來發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛的一種真核表達(dá)系統(tǒng)，目前還未見任何雞生長激素重 組蛋白在畢赤酵母中表達(dá)的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 發(fā)明目的:本發(fā)明提供一種雞生長激素重組蛋白在畢赤酵母中的高效表達(dá)及純化 方法，通過該方法獲得高純度且具有活性的雞生長激素重組蛋白。
[0004] 技術(shù)方案:為了達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供的雞生長激素重組蛋白在畢赤酵 母中的表達(dá)及純化方法，包括W下步驟：
[0005] (1)從雞垂體中提取總RNA并做反轉(zhuǎn)錄PCR得到其cDNA，WcDNA為模板，PCR得到雞 生長激素的基因片段，其堿基序列如SEQ ID N0:1所示；
[0006] (2)將步驟(1)所得基因片段插入畢赤酵母分泌表達(dá)載體PPIC9K，并在C端添加6個 His標(biāo)簽，得到重組表達(dá)載體pPIC9K-cGH;
[0007] (3)重組表達(dá)載體pPIC9K-c(iH電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,并通過組氨酸缺陷篩選和 G418篩選得到轉(zhuǎn)基因重組酵母菌株GS115-pPIC9K-cGH;
[000引（4)通過甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)儀柱、凝膠柱純化得到雞生長激素重組蛋白。
[0009] 所述雞生長激素(chicken growth hormone,cGH)的基因位于1號常染色體的長臂 末端，全長約為4kb，由5個外顯子及4個內(nèi)含子構(gòu)成。CGH由191個氨基酸組成，分子量約為 22KDa，與鴨的生長激素具有很高的同源性，只有4個氨基酸的差異，與火雞生長激素的同源 性為96% Xenbank已公布的雞生長激素mRNA序列(NM_204359)。
[0010] 所述雞生長激素基因片段的堿基序列如SEQ ID N0:1所示，其編碼的重組蛋白的 氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0011] 所述步驟(2)重組表達(dá)載體的構(gòu)建中，為了便于后續(xù)純化重組蛋白，將步驟（1)所 得基因片段插入畢赤酵母分泌表達(dá)載體PPIC9即寸，需要在C端添加6個化S標(biāo)簽。其操作可W 借助于含有化S標(biāo)簽的祀T-30a( + )載體，具體為:將步驟（1)所得基因片段插入含有化S標(biāo)簽 的祀T-30a( + )載體，并W其為模板，PCR擴(kuò)增得到含有化S標(biāo)簽的雞生長激素的基因片段并 插入畢赤酵母分泌表達(dá)載體PPIC9K，得到重組表達(dá)載體PPIC9K-C細(xì)。其中，可W先將步驟 (1)所得基因插入PMD19-T載體，命名為PMD19-T-CGH，然后根據(jù)設(shè)計引物進(jìn)行上述PCR擴(kuò)增。
[0012] 所述步驟(3)具體可W為:將構(gòu)建好的PPIC9K-CCT1重組表達(dá)載體用SacI線性化，然 后與畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞混合，經(jīng)電轉(zhuǎn)之后培養(yǎng)長出轉(zhuǎn)化子。將所有轉(zhuǎn)化子用無菌去 離子水洗下涂含有不同濃度G418的YTO平板，培養(yǎng)篩選高拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化子。采取煮-凍-煮法 提取轉(zhuǎn)化子基因組，做PCR鑒定，鑒定正確的高拷貝轉(zhuǎn)化子命名為GS115-pPIC9K-cGH。
[0013] 所述電轉(zhuǎn)條件為1500V，6ms。
[0014] 所述步驟(4)具體可W為:將轉(zhuǎn)基因重組酵母菌株GS115-pPIC9K-c(iH單菌落接種 于培養(yǎng)基中培養(yǎng)活化;將活化后的菌液接種于BMGY培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16-2化至0D600達(dá)到2-6， 2500 X g，5min離屯、收集菌體，換用BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)，添加甲醇連續(xù)誘導(dǎo)，篩選出高表達(dá) 困株。
[0015] 所述誘導(dǎo)表達(dá)所用甲醇為培養(yǎng)基體積的1 %。
[0016] 所述誘導(dǎo)表達(dá)時間為24-9化，最優(yōu)表達(dá)時間為96h。
[0017] 步驟(4)中儀柱、凝膠柱純化具體為：取IOOmL的GS115-PPIC9K-C細(xì)誘導(dǎo)上清，用 8000邸a透析袋在儀柱化結(jié)合液中透析1她，每化換一次液;將透析后的誘導(dǎo)上清用儀柱純 化，再采用凝膠層析方法去除其中雜蛋白，即得純度達(dá)到95% W上的雞生長激素重組蛋白。 最后通過細(xì)胞活性試驗(yàn)鑒定所得重組蛋白的活性。
[0018]有益效果：本發(fā)明首次實(shí)現(xiàn)雞生長激素重組蛋白在畢赤酵母中的高效表達(dá)并純 化，從而得到高純度的雞生長激素重組蛋白；產(chǎn)生的目的蛋白可W直接分泌到培養(yǎng)液中，方 便分離，而細(xì)胞可W被重新利用進(jìn)行誘導(dǎo)目的蛋白，可應(yīng)用于連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)的模式，大大提 高目的蛋白的產(chǎn)生，提高發(fā)酵效率，簡化發(fā)酵過程和降低成本;同時避免了原核細(xì)胞所產(chǎn)生 的一些內(nèi)毒素物質(zhì)和熱源等一些不易去除的物質(zhì)，目的蛋白純度更高。即本發(fā)明方法操作 簡單、產(chǎn)量高、成本低。
【附圖說明】
[0019] 圖l:pPIC9K-c細(xì)重組載體酶切檢驗(yàn)瓊脂糖電泳分析圖（M為DL2000DNA Maker;l為 EcoRI、Not I雙酶切的pPIC9K-c(iH重組載體。經(jīng)雙酶切后產(chǎn)生一條60化P左右的cGH條帶和 一條大于2000bp的質(zhì)粒條帶，表明cGH序列已成功插入表達(dá)載體。）
[0020] 圖2:GS115-pPIC9K-cGH基因組PCR檢驗(yàn)瓊脂糖電泳分析圖(M為DL2000DNAMaker;l 為陰性對照;2-6為W不同轉(zhuǎn)化子基因組做模板PCR產(chǎn)物。提取轉(zhuǎn)化子基因組做PCR能得到與 C細(xì)大小相符的條帶說明PPIC9K-C細(xì)成功轉(zhuǎn)入GS115。）
[00別]圖3:GS115-pPIC9K-cGH不同誘導(dǎo)時相培養(yǎng)上清的SDS-PAGE電泳分析圖（M為 Premixed Protein Marker; 1為誘導(dǎo)96h的上清；2為誘導(dǎo)7化的上清；3為誘導(dǎo)4她的上清；4 為誘導(dǎo)2地的上清。）
[0022] 圖4: GSl 15-PPIC9K-C細(xì)誘導(dǎo)上清儀柱純化SDS-PAGE電泳分析圖（M為Premixed Protein Marker; 1為誘導(dǎo)液上清;2為過柱液;3、4為50mM咪挫洗涂液;5、6為IOOmM咪挫洗涂 液;7、8為SOOmM咪挫洗脫液。結(jié)果表明，洗涂液咪挫為50mM時可洗掉部分雜蛋白，當(dāng)咪挫濃 度提高IOOmM時目的蛋白開始被洗下，用SOOmM咪挫洗脫可得到大部分預(yù)測大小為25KDa左 右的雞生長激素重組蛋白，但是純度不高。）
[0023] 圖5:雞生長激素重組蛋白凝膠層析純化SDS-PAGE電泳分析圖（M為Premixed Protein Marker; 1為儀柱純化得到的重組蛋白；2、3、4分別為凝膠層析不同峰中的蛋白。從 4中單一條帶可W看出，經(jīng)凝膠層析后可得到純度較高的雞生長激素重組蛋白。）
[0024] 圖6: LMH細(xì)胞經(jīng)雞生長激素重組蛋白處理后IGF-I mRNA相對于內(nèi)參GAPDH表達(dá)量 柱狀圖（C細(xì)-為PBS處理的陰性對照組；C細(xì)巧00為500ng/mL雞生長激素重組蛋白處理組； cGH+1000為lOOOng/mL雞生長激素重組蛋白處理組;CG化1500為1500ng/mL雞生長激素重組 蛋白處理組。經(jīng)雞生長激素重組蛋白處理后LMH細(xì)胞的IGF-I mRNA表達(dá)量明顯提高，與對照 組相比呈極顯著（P<〇.01)，表明本發(fā)明得到的雞生長激素重組蛋白具有較高的生物學(xué)活 性。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 實(shí)施例1:構(gòu)建雞生長激素重組蛋白的重組表達(dá)載體和轉(zhuǎn)基因重組酵母菌株
[0026] 1、從雞垂體中得到CGH的基因片段
[0027] 從垂體中提取總RNA并做反轉(zhuǎn)錄PCR得到其CDNAsGenbank已公布的雞生長激素 mRNA序列(NM_204359)設(shè)計引物，W上述得到的CDNA為模板，做PCR得到cGH基因的全長CDS 片段。把上述C細(xì)的基因片段插入到PMD19-T載體，命名為pMD19-T-cGH，并測序確定正確獲 取目的基因。
[002引 2、構(gòu)建pPIC9K-cGH重組表達(dá)載體
[0029] 根據(jù)雞生長激素成熟多膚的基因序列設(shè)計引物，其中上游引物Pl帶有NdeI酶切位 點(diǎn)，下游引物P2帶有趾Ol酶切位點(diǎn)：根據(jù)pET-30a-c(iH重組載體中化S標(biāo)簽序列設(shè)計上游引 物P3帶有EcoRI酶切位點(diǎn)，下游引物P4帶有NotI酶切位點(diǎn)。
[0030] Pl:5 ' 一ATcatatgACCTTCCCTGCCATGC-3 '
[0031] P2:5，一ATctcgagGATGGTGCAGTTGCTCTC-3，
[0032] P3:5 ' _ATgaattcACCTTCCCTGCCATGC_3 '
[0033] P4 ： 5' -ATgcggccgcTTAGCAGCCGGATCTCA-3'
[0034] Wl中PMD19-T-C細(xì)質(zhì)粒為模板，用P1、P巧I物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0035] PCR 體系：<