一種二醇脫水酶基因pduCDE的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程和發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種二醇脫水酶基因Pdu⑶E的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]二醇脫水酶(D1l dehydratase , EC 4.2.1.28)和甘油脫水酶(Glycero Idehydratase,EC 4.2.1.30)是同功酶，它們能以甘油、I，2_丙二醇或I，2_乙二醇為底物，分別轉(zhuǎn)化生成重要的化工原料3-羥基丙醛、丙醛或乙醛，最值得關(guān)注的是，該酶是催化甘油脫水生成重要的中間產(chǎn)物3-羥基丙醛的限速酶和關(guān)鍵酶(Lee H.A.J.R.and Abeles R.H.，1963，Purificat1n and properties of d1ldehydrase,and enzyme requiring acobamide coenzyme, J.B1l.Chem.，238:2367-2373)。由于3-輕基丙酸可作為食物防腐的抗菌劑，而且還是丙烯醛、丙烯酸、3-羥基丙酸以及I，3_丙二醇等多種重要化工原料的合成前體(如圖1所示)，因此，和甘油脫水酶一樣，二醇脫水酶由于能將甘油催化脫水生成3-羥基丙醛而在生物化工界中占有重要的地位(Slininger P.J.，Bothast R.J.，1983，SmileyK.L.Product 1n of3-hydroxyprop1naldehyde from glycerol，Appl EnvironMicrob1l，46(l):62-67.)0
[0003]近年來(lái)，由于石油資源和生產(chǎn)能源的日益枯竭，通過(guò)化學(xué)合成法制備丙烯醛、丙烯酸、3-羥基丙酸以及I，3_丙二醇等這類(lèi)重要的化工原料已無(wú)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。生物法制備3-羥基丙醛，是通過(guò)脫水酶的催化作用，直接將甘油脫水形成的產(chǎn)物3-羥基丙醛;3-羥基丙醛作為重要的中間產(chǎn)物，再通過(guò)其它反應(yīng)轉(zhuǎn)化成丙烯醛、丙烯酸、3-羥基丙酸以及I，3_丙二醇(Vollenweider S.,Lacroix C.,2004,3-Hydroxyprop1naldehyde applicat1ns andperspectives of b1technological product1n，Appl Microb1l B1technol,64(I):16-27.);生物法制備I，3-丙二醇，是通過(guò)I，3-丙二醇氧化還原酶的還原作用，將上述的中間產(chǎn)物3-羥基丙醛轉(zhuǎn)化成I，3-丙二醇；生物法制備3-羥基丙酸，而是在乙醛脫氫酶(Aldehyde dehydrogenase,AldH,EC 1.2.1.5)的氧化作用下，將3_輕基丙醛轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物3_輕基丙酸(Mohan Raj S.,Rathnasingh C.，Jung W.C.,et al.2009,Effect of processparameters on 3-hydroxyprop1nic acid product1n from glycerol using arecombinant Escherichia col1.Appl Microb1l B1technol，84(4):649-657.)。
[0004]生物發(fā)酵法(酶法)制備上述化工原料，是通過(guò)微生物發(fā)酵可再生的生物原料為出發(fā)點(diǎn)，具有多種優(yōu)勢(shì)而成為研究重點(diǎn)。特別是隨著3-羥基丙酸和I，3_丙二醇需求量的急劇增加，二醇脫水酶和甘油脫水酶在生物催化甘油生成重要的化工原料進(jìn)程中起到無(wú)可替代的作用，而引起了生化工業(yè)界足夠的重視，并成為研究熱點(diǎn)。
[0005]目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)二醇脫水酶的研究主要集中在一些腸桿菌中，如克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae )、沙門(mén)氏菌(Salmone I la enter i ca)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)和乳酸桿菌屬(LactobaciIIus d1Ivorans和LactobaciIIusbrevis)等，由于它們可能存在的致病性或嚴(yán)格的培養(yǎng)條件，限制了這些天然菌發(fā)酵甘油制備上述化工原料的應(yīng)用，所以從這些天然菌中克隆相關(guān)基因以構(gòu)建高效的基因工程菌逐漸成為研究重點(diǎn)。
[0006]研究發(fā)現(xiàn)，二醇脫水酶和甘油脫水酶理化性質(zhì)的差異除了對(duì)底物的親和力不同以夕卜，他們一個(gè)明顯的差異是在于其表達(dá)的可溶性，甘油脫水酶的可溶性好，而二醇脫水酶的可溶性較差，特別是乳桿屬的丘狀乳桿菌(Lactobaci I Ius col Iinoides)和Lactobaci I Iusd1lvorans 二醇脫水酶基因表達(dá)產(chǎn)物的可溶性更差，可溶性問(wèn)題嚴(yán)重制約了這類(lèi)二醇脫水酶的研究和應(yīng)用(Tobimatsu T.,Nishiki T.,Morimoto M.，et al.2009,Low-solubilityglycerol dehydratase，a chimeric enzyme of coenzyme Bi2~dependent glycerol andd1l dehydratases.Arch Microb1l，191(3):199-206.)。
[0007]2002年Nicolas S.等人對(duì)丘狀乳桿菌(Lactobacillus collinoides)的二醇脫水酶相關(guān)操縱子進(jìn)行了詳細(xì)的研究并遞交了基因序列(Nicolas S.,Muller C.,Hartke A.，et al.2002，Characterisat1n of the d1l dehydratase pdu operon ofLactobacillus collinoides.FEMS Microb1logy Letters，209( I):66?71.)。盡管他們研究小組對(duì)該天然菌中的二醇脫水酶進(jìn)行分離純化與酶學(xué)性質(zhì)研究，然而，當(dāng)從該菌株克隆的二醇脫水酶基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)時(shí)，無(wú)論應(yīng)用什么表達(dá)條件和方法，都沒(méi)有檢測(cè)該酶的活力，可能是發(fā)酵條件的限制或是大腸桿菌缺少一些修飾系統(tǒng)，使某些外源蛋白沒(méi)有得到正確的折疊，從而嚴(yán)重限制了該脫水酶進(jìn)一步研究和應(yīng)用(Nicolas S，VianneyP,LoIc L,et.al.2002.Purificat1n,characterizat1n and subunits identificat1nof the d1l dehydratase of Lactobacillus collinoides.Eur.J.B1chem.269:5731~5737.)o
[0008]到目前為止，沒(méi)有檢索到任何有關(guān)丘狀乳桿菌(Lactobacillus collinoides)二醇脫水酶基因在大腸桿菌中成功克隆表達(dá)和應(yīng)用的論文和專(zhuān)利，也沒(méi)有檢索到應(yīng)用該重組酶轉(zhuǎn)化甘油制備3-羥基丙醛、I，3_丙二醇和3-羥基丙酸的相關(guān)文獻(xiàn)。
[0009]本發(fā)明專(zhuān)利運(yùn)用現(xiàn)代基因工程技術(shù)和特殊的發(fā)酵條件，首次實(shí)現(xiàn)了丘狀乳桿菌(Lactobacillus col lino ides) 二醇脫水酶在大腸桿菌的高效而可溶地表達(dá)，并顯示良好的二醇脫水酶活力，該基因編碼的二醇脫水酶能夠?qū)⒏视痛呋?-羥基丙醛。在此發(fā)明基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步分別把I，3_丙二醇氧化還原酶或乙醛脫氫酶等相關(guān)基因一起重組到大腸桿菌中得到新的重組工程菌，工程菌可以通過(guò)發(fā)酵甘油轉(zhuǎn)化為I，3_丙二醇或3-羥基丙酸，首次挖掘了丘狀乳桿菌(LactobaciIIus colIinoides)二醇脫水酶基因工程菌發(fā)酵甘油的能力，并展現(xiàn)了其良好工業(yè)應(yīng)用的前景，顯示了技術(shù)上的先進(jìn)性和獨(dú)創(chuàng)性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明目的是提供一種二醇脫水酶基因PduCDE在含有該基因的工程菌在發(fā)酵甘油制備3-羥基丙醛、I，3-丙二醇和3-羥基丙酸過(guò)程中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明所述的一種二醇脫水酶基因pduCDE，是通過(guò)提取丘狀乳桿菌(Lactobacillus collinoides，LMG 18850)基因組DNA，根據(jù)GenBank中已報(bào)道的基因序列為依據(jù)設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過(guò)PCR方法擴(kuò)增得到的二醇脫酶基因pduCDE。在合適的發(fā)酵條件下，該基因能在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)高效而可溶地表達(dá)，并顯示出良好二醇脫水酶活力，由該基因構(gòu)建的重組大腸桿菌能夠?qū)⒏视娃D(zhuǎn)化生成3-羥基丙醛。
[0012]在此發(fā)明基礎(chǔ)上，把1，3-丙二醇氧化還原酶基因yqhD和該二醇脫水酶基因pduCDE一起重組到大腸桿菌中進(jìn)行共表達(dá)，得到的重組工程菌可以通過(guò)發(fā)酵甘油轉(zhuǎn)化為I，3_丙二醇。
[0013]在此發(fā)明基礎(chǔ)上，當(dāng)把乙醛脫氫酶基因aldH和該二醇脫水酶基因pduCDE—起重組到大腸桿菌中進(jìn)行共表達(dá)，得到新的工程菌可以通過(guò)發(fā)酵將甘油轉(zhuǎn)化為3-羥基丙酸。
[0014]丘狀乳桿菌二醇脫水酶基因pdu⑶E在大腸桿菌中的成功表達(dá)和應(yīng)用，促進(jìn)了生物轉(zhuǎn)化甘油制備3-羥基丙醛、I，3_丙二醇和3-羥基丙酸等的新工藝的誕生。
[0015]本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的方案如下:
[0016]本發(fā)明所述二醇脫水酶基因pduCDE是根據(jù)GenBank已公布的丘狀乳桿菌(Lactobacillus collinoides，LMG 18850)的二醇脫水酶基因序列(GenBank Access1nN0.AJ297723.3)為依據(jù)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，通過(guò)PCR的方法，從丘狀乳桿菌基因組上得到的；將pduCDE基因與表達(dá)載體pET-22b( + )連接構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pET-22b-pduCDE，其表達(dá)產(chǎn)物為二醇脫水酶Pdu⑶E，其重組大腸桿菌用于發(fā)酵甘油轉(zhuǎn)化為3-羥基丙醛。