一種長效的重組狂犬病病毒疫苗株及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動(dòng)物疫苗技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種長效的重組狂犬病病毒疫苗株及其 制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 狂犬病是最古老的傳染病之一，是由狂犬病毒(Rabies virus,RABV)引起的一種 人畜共患傳染病。狂犬病是迄今為止人類病死率最高的急性傳染病，一旦發(fā)病，病死率幾乎 達(dá)100%。近些年，我國平均每年約有3000人左右死于狂犬病，位居傳染病死亡人數(shù)前=位， 多數(shù)是由于被動(dòng)物咬傷或者抓傷而被感染。而在暴露前和暴露后及時(shí)接種疫苗可W有很好 的保護(hù)作用，當(dāng)前廣泛應(yīng)用的狂犬病疫苗主要是原代細(xì)胞培養(yǎng)疫苗和傳代細(xì)胞純化疫苗等 滅活疫苗，運(yùn)些疫苗雖然具有安全、有效等優(yōu)點(diǎn)，但狂犬病暴露人群通常需要在較長時(shí)間 (21天）內(nèi)進(jìn)行多次免疫注射(至少4次）。此外，此種疫苗價(jià)格昂貴，進(jìn)一步阻止了其在發(fā)展 中國家的使用。運(yùn)樣對(duì)于一些流浪動(dòng)物及野生動(dòng)物的免疫接種則很難實(shí)現(xiàn)。在我國，街頭的 流浪狗、貓等動(dòng)物為當(dāng)前主要的傳染源，將流浪的動(dòng)物進(jìn)行有效的免疫是狂犬病防控的關(guān) 鍵。因此，當(dāng)前狂犬病毒研究的主要目標(biāo)之一是發(fā)展低毒、可簡(jiǎn)化免疫程序及長期有效的狂 犬病疫苗。
[0003] 重組狂犬病病毒疫苗是一種利用反向遺傳技術(shù)對(duì)狂犬病毒進(jìn)行改造，有目的性地 改變病毒的基因組結(jié)構(gòu)，從而改變病毒的生物學(xué)特性，W增加安全性和免疫原性。歐美許多 國家已經(jīng)將重組狂犬病病毒疫苗應(yīng)用于野生動(dòng)物的狂犬病防控。1994年Schnell等第一次 運(yùn)用反向遺傳技術(shù)成功的改造并捶救出狂犬病毒SAD B19株(Schnell MJl ,Mebatsion T, Conzelmann KK.Infectious rabies viruses from cloned cDNA.EMBO J 1994,13(18): 4195-203.)，目前應(yīng)用的重組狂犬病病毒疫苗包括SAD B19株、RC-HL株（Ito H,Minamoto N,Watanabe T,Goto H,Rong LI,Sugiyama M,Kinjo T,Mannen K,Mifune K,Konobe T,et al.(A unique mutation of glycoprotein gene of the attenuated RC-HL strain of r曰bies virus,曰 seed virus used for production of 曰nim曰I v曰ccine in Japan.Microbiol Immunol.1994,38:479-482.)、皿P-Fluiy株（Inoue Ki,Shoji Y,Kurane !,Iijima T,Sakai T,Morimoto K.An improved method for recovering rabies virus from cloned cDNA. J Virol Methods.2003Feb; 107(2) :229-36.)等。隨后基于W運(yùn)些病毒 為母本，通過反向遺傳學(xué)系統(tǒng)基礎(chǔ)上構(gòu)建了表達(dá)各種細(xì)胞因子，如MIP-lalpha(Zhao L, Toriumi H,Wang H,Kuang Y,Guo X,et al.Expression of MIP-lalpha(CCL3)by a recombinant rabies virus enhances its immunogenicity by inducing innate immunity and recruiting dendritic cells and B cells.J Virol.2010,84:9642-9648.)、GM-CSF(Ming Zhou,Lei Wang,Ling Zhao,Zhen F.Pu,et al.Recombinant rabies virus expressing dog GM-CSF is an efficacious oral rabies vaccine for dogs.0ncotarget.2015Nov 17;6(36) :38504-16.),缺失相關(guān)結(jié)構(gòu)蛋白，如缺失M基因、P基 因或G基因的重組病毒疫苗（McGettigan JP,David F,Schnell MJ,et al.Safety and serological response to a matrix gene-deleted rabies virus-based vaccine vector in dogs.Vaccine.2014Mar26;32(15):1716-9.Cenna Jl,Hunter M,,McGettigan JP，et al.民eplication-deficient rabies virus-based vaccines are safe and immunogenic in mice and nonhuman primates.J Infect Dis.20090ct 15；200(8): 1251-60.Sato S,Ohara S,Tsutsui K,Iijima !.Effects of G-gene Deletion and 民eplacement on 民abies Virus Vector Gene Expression.PLoS One.2015May 29:10(5): e0128020.)、過表達(dá)相關(guān)結(jié)構(gòu)蛋白（Hosokawa-Muto J，Ito N，Yamada K，et al.Characterization of recombinant rabies virus carrying double glycoprotein genes.Microbiol Immunol，2006，50(3):187-196.Tao LI,Ge J，Bu Z，et al.Generation of recombinant rabies Flury LEP virus carrying an additional G gene ere ates an improved seed virusfor inactivated vaccine production.Virol J.2011Sep25;8: 454.)等重組病毒疫苗株。但這些疫苗均存在許多不足，其中很重要的一點(diǎn)是中和抗體滴度 不能維持長期有效的水平上。例如，HEP-dG在第21天時(shí)中和抗體滴度達(dá)至頂峰后便下降 (Xiaohui Liu,Youtian Yang,Xiaofeng Guo，et al.A Recombinant 民abies Virus Encoding Two Copies of the Glycoprotein Gene Confers Protection in Dogs against a Virulent Challenge.PLoS 0ne.2014;9(2):e87105.)D因此，當(dāng)前狂犬疫苗研 究的主要目標(biāo)之一是發(fā)展長期有效的狂犬病疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一株重組狂犬病病毒疫苗株，該病毒疫苗可^促進(jìn)狂犬病毒 免疫記憶性，維持機(jī)體長久體液免疫反應(yīng)。
[0005] 本發(fā)明W我們之前報(bào)道的狂犬病疫苗株LBN沈?yàn)槟副?Wen Y，Wang H，Wu HJang F,Tripp RA,et al.(2011)Rabies virus expressing dendritic cell-activating molecules enhances the innate and adaptive immune response to vaccination.J Virol 85:1634-1.)，將贏源IL-7基因插入到LBN沈毒株基因組中，通過反向遺傳操作技術(shù) 捶救出可W表達(dá)鼠 IL-7基因的重組狂犬病毒rLBNSE-IL7,該病毒株具有較高的病毒滴度， 致病性低，并且能維持機(jī)體長久體液免疫反應(yīng)，長期誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著高水平的中和抗體，尤其 是再次免疫后，中和抗體水平顯著快速升高。
[0006] 本發(fā)明的上述目的通過W下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
[0007] 所用的LBNSE毒株來源于用于歐洲野生動(dòng)物免疫用的疫苗株SAD-B19,但在SAD-B19病毒G蛋白上將194位的天冬氨酸(AAT)突變?yōu)榻z氨酸(TCC)，將333位的精氨酸(AGA)突 變?yōu)楣劝彼?GAA)，相當(dāng)于另一株疫苗株SAG2(在歐洲廣泛用于野生動(dòng)物口服免疫的疫苗 株），大大減弱了病毒的致病性(Wen Y，Wang H，Wu H，Yang F，Tripp RA，et al.(2011) Rabies virus expressing dendritic cell-activating molecules enhances the innate and adaptive immune response to vaccination.J Virol 85:1634- 1.Rasalingam P,Rossiter JP,Mebatsion T,Jackson AC.Comparative pathogenesis of the SAD-L16strain of rabies virus and a mutant modifying the dynein light chain binding site of the rabies virus phosphoprotein in young mice. Virus Res . 2005,111: 55-60.Conzelmann KK,Cox JH,Schneider LG, Thiel HJ.Molecular cloning and complete nucleotide sequence of the attenuated rabies virus SAD 819.￥1萬〇1〇容7.1990，175:485-499.)。另夕^，還將5六0-819毒株基因組中6和1基因之間的假 基因敲除，在G基因和L基因之間加入兩個(gè)酶切位點(diǎn)BsiWI和化el作為插入外源基因的位點(diǎn)。 [000引狂犬病病毒疫苗株SAD-B19的基因，其核巧酸序列如SEQ