本發(fā)明涉及分子生物學技術和醫(yī)學檢驗領域，更具體地，涉及基于高分辨熔解曲線技術的遲發(fā)性耳聾基因突變檢測引物組，和包括該引物組的試劑盒，以及上述引物組和試劑盒作為遲發(fā)性耳聾基因突變檢測試劑的應用。
背景技術：
：耳聾是導致交流障礙最常見的疾病，也是臨床上最為常見的遺傳性疾病之一，嚴重影響人類的生活質量，我國耳聾人群的現(xiàn)狀尤為嚴重。據(jù)第二次(2006年)全國殘疾人抽樣調查統(tǒng)計結果，我國現(xiàn)有聽力語言殘疾人數(shù)高達2780萬人，占殘疾人總數(shù)的34％，其中單純聽力殘疾人數(shù)約2004萬人；耳聾在新生兒中發(fā)病率高達1～3‰，7歲以下耳聾患者超過70萬人，并且以每年新增2-3萬人的速度增長。所有耳聾患者中，一半以上為遺傳性耳聾。遺傳性耳聾可以分為先天性耳聾，藥物性耳聾和遲發(fā)性耳聾。遺傳性耳聾的致病基因目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)100多個。國內外大樣本的流行病學研究表明，約70％耳聾患者除耳聾外不伴有其他癥狀，其中gjb2、slc26a4、線粒體12srrna是最常見的致病基因。slc26a4基因，又稱pds基因，是最常見的致聾基因之一，其突變導致大前庭水管綜合征(主要臨床特征：神經(jīng)性耳聾、前庭水管擴大，伴或不伴內耳畸形)，是遲發(fā)性耳聾的主要致病基因。slc26a4基因主要表達在內耳內淋巴管和內淋巴囊，作為氯、碘等陰離子的轉運體，調節(jié)內淋巴液的離子平衡。我國漢族人群中，slc26a4基因最常見的突變?yōu)椋篿vs7-2a>g、c.2168a>g、c.1229c>t、c.1174a>t。耳聾，嚴重地影響兒童語言、認知體系的發(fā)育，而它的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是避免因聾致啞、促進患兒發(fā)育的有效措施。新生兒聽力篩查在我國已經(jīng)普遍開展，但是對于遲發(fā)性耳聾及耳聾高?；純翰荒茏龅皆绨l(fā)現(xiàn)。對新生兒開展聽力和耳聾基因聯(lián)合篩查，可以早期發(fā)現(xiàn)先天遺傳性耳聾，明確遺傳學病因，便于早期干預。并且，耳聾基因的篩查能夠對適齡婚育的男女進行遺傳咨詢和婚育指導，減少聾兒出生，減輕家庭和社會負擔。目前現(xiàn)有的檢測基因點突變的檢測方法主要有：pcr-sanger測序法、pcr-rflp分析法、等位基因特異性pcr法、taqman探針法、基因芯片法、hrm分析法。pcr-sanger測序法是基因突變檢測的金標準，但是存在測序周期長、工作量大、成本高的缺點，不適合于做大量樣本的檢測。pcr-rflp分析法，受到序列的限制多數(shù)snp位點沒有合適的酶切序列，并且操作復雜，耗時較長，容易產(chǎn)生假陽性。等位基因特異性pcr法，根據(jù)snp位點的堿基差異設計特異性引物，方法簡便、快捷、費用低廉，缺點是假陽性率較高，對實驗條件要求嚴格。taqman探針法，是高度特異的定量pcr技術，檢測通量高，結果可靠，近年來使用較多。缺點是僅適合于檢測已知snp，不能檢測未知的snp位點；并且taqman探針的合成成本較高，對于少量或者中等通量樣本的檢測而言，不是一個經(jīng)濟的選擇；另外，該方法受到snp位點附近序列的限制，一些snp不適合采用taqman探針。基因芯片技術，與傳統(tǒng)的儀器檢測方法相比具有自動化、高通量、微型化、操作簡便等特點，缺點是需要專門的撒掃描儀器，價格昂貴，不適合于單個或者少量snp位點的檢測，且無法同時處理大量樣本。基于現(xiàn)有技術的現(xiàn)狀，亟需一種高效、靈敏、準確的檢測上述遺傳性耳聾常見突變熱點的方法。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術存在的缺陷和不足，本發(fā)明的目的是提供一種基于高分辨熔解曲線技術(hrm)的遲發(fā)性耳聾基因突變檢測引物組，以及包括該引物組的試劑盒。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種基于高分辨熔解曲線技術的遲發(fā)性耳聾基因突變檢測引物組，該引物組包括具有seqidno：1～seqidno：8所示堿基序列的引物：①slc26a4基因ivs7-2a>g(rs111033313)引物序列為：slc26a4-ivs7-forward：5'-gccaatggagtttttaacatctt-3'(seqidno：1)slc26a4-ivs7-reverse：5'-ccatatgaaatggcagtagcaat-3'(seqidno：2)②slc26a4基因c.2168a>g(rs121908362)引物序列為：slc26a4-2168-forward：5'-cgagaaaggacacattctttttg-3'(seqidno：3)slc26a4-2168-reverse：5'-cgcgtggttctgtagatagagtatag-3'(seqidno：4)③slc26a4基因c.1229c>t(rs111033220)引物序列為：slc26a4-1229-forward：5'-gccaccactgctctttcc-3'(seqidno：5)slc26a4-1229-reverse：5'-gttgttcctacctgtgtctttc-3'(seqidno：6)④slc26a4基因c.1174a>t(rs201562855)引物序列為：slc26a4-1174-forward：5'-gccaatggagtttttaacatctt-3'(seqidno：7)slc26a4-1174-reverse：5'-ccatatgaaatggcagtagcaat-3'(seqidno：8)。本發(fā)明還提供一種基于高分辨熔解曲線技術的遲發(fā)性耳聾基因突變檢測試劑盒，該試劑盒包括上述的引物組。根據(jù)本發(fā)明，上述各引物可獨立存管或部分混合存管；為便于后續(xù)pcr檢測，優(yōu)選地，每一對引物混合存管，即具有seqidno：1和seqidno：2所示堿基序列的引物混合存管；具有seqidno：3和seqidno：4所示堿基序列的引物混合存管；具有seqidno：5和seqidno：6所示堿基序列的引物混合存管；具有seqidno：7和seqidno：8所示堿基序列的引物混合存管。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，該試劑盒還包括兩對內標引物：高溫內標正向引物：5'-gcggtcagtcggcctagcggtagccagctgcggcactgcgtgacgctcag-3'(seqidno：9)高溫內標反向引物：5'-ctgagcgtcacgcagtgccgcagctggctaccgctaggccgactgaccgc-3'(seqidno：10)低溫內標正向引物：5'-atcgtgatttctatagttatctaagtagttggcattaataatttcatttt-3'(seqidno：11)低溫內標反向引物：5'-aaaatgaaattattaatgccaactacttagataactatagaaatcacgat-3'(seqidno：12)。本領域技術人員公知，上述內標引物的反向引物是與正向完全互補的序列，且3’-端堿基為磷酸修飾，不能進行擴增。根據(jù)本發(fā)明，所述兩對內標引物可單獨存管，優(yōu)選地，當上述四組引物對各自混合存管時，所述兩對內標引物優(yōu)選分別加入四管引物對中。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，該試劑盒還包括：pcr反應試劑和熒光染料。所述pcr反應試劑的概念為本領域技術人員公知，即pcr反應中所需要的試劑，包括但不限于：dna聚合酶、dntps、mgcl2、pcr反應液。上述組分的選擇和用量可以根據(jù)需要調整。所述熒光染料例如可以為lcgreen，lcgreenplus，syto9或evagreen等飽和熒光染料。這類飽和熒光染料與sybrgreeni等非飽和熒光染料相比，與dna雙鏈有更強的結合能力、不抑制pcr反應、在dna解鏈過程中不會發(fā)生遷移、重排，是實現(xiàn)熔解曲線分辨率的基礎。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明還提供上述基于高分辨熔解曲線技術的遲發(fā)性耳聾基因突變檢測引物組或上述基于高分辨熔解曲線技術的遲發(fā)性耳聾基因突變檢測試劑盒作為遲發(fā)性耳聾基因突變檢測試劑的應用。本發(fā)明的試劑盒可用于slc26a4基因熱點突變(ivs7-2a>g、c.2168a>g、c.1229c>t、c.1174a>t)的檢測。具體方法如下：(1)合成seqidno：1～seqidno：10所示堿基序列的引物；(2)提取外周血細胞樣本的基因組dna，利用步驟(1)得到的引物進行pcr擴增；touchdownpcr擴增程序為：變性，95℃分鐘；循環(huán)擴增：變性，95℃15秒，退火，63→55℃(從63℃開始每個循環(huán)降低0.5℃，直至55℃)20sec，延伸72℃20sec，共45個循環(huán)；接著72℃繼續(xù)延伸5min；(3)利用高分辨率熔解曲線分析技術對擴增后的目的基因突變位點進行檢測，通過熔解曲線偏移和曲線形狀變化區(qū)分不同的基因型。具體地，pcr結束之后，直接進行高分辨熔解曲線分析。應用lightscanner32軟件分析hrm結果，通過高、低溫內標對熔解曲線歸一化處理，減少樣品間的誤差；利用已知純合野生型、純合突變型、野生/突變雜合型的樣本dna為對照，根據(jù)熔解曲線的位置和峰形，完成對待測樣本基因型的判斷。hrm利用檢測體系具有極高的溫度均一性和溫度分辨率，可以用于區(qū)分檢測單個堿基差異，并且不受突變堿基位點與類型局限。hrm分析無需昂貴的設備和試劑，pcr之后，不需要經(jīng)過酶切、電泳、測序等繁雜操作步驟，在pcr結束后直接運行hrm程序制作熔解曲線，真正實現(xiàn)閉管操作。檢測不需要taqman等標記的熒光探針，僅在pcr體系中加入飽和熒光染料，顯著降低成本。利用本發(fā)明的試劑盒進行檢測，操作簡便、高特異性、結果重復性好、成本低廉。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后具體實施方式部分予以詳細說明。附圖說明通過結合附圖對本發(fā)明示例性實施方式進行更詳細的描述。圖1為本發(fā)明實施例突變熱點pcr擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2a-圖2b為本實施例中slc26a4基因ivs7-2a>g突變的高分辨率熔解曲線圖。圖3a-圖3b為本實施例中slc26a4基因c.1174a>t突變的高分辨率熔解曲線圖。圖4a-圖4b為本實施例中slc26a4基因c.1229c>t突變的高分辨率熔解曲線圖。圖5a-圖5b為本實施例中slc26a4基因c.2168a>g突變的高分辨率熔解曲線圖。具體實施方式下面將參照附圖更詳細地描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。1、引物合成委托上海生物技術有限公司合成seqidno：1～seqidno：10所示堿基序列的引物。2、提取外周血或足底血樣本的基因組dna，進行pcr擴增。pcr實驗選擇天根生化科技highaffinityhotstarttaq試劑盒(et108)。在pcr反應體系中，加入緩沖液、dntps、dna聚合酶、引物、模板dna、h2o。為減少人為誤差，簡化操作流程，本實施例中首先將pcr擴增試劑配置成mix(包括habuffer、dntps、h2o、lcgreenplus、dnapolymerase)，然后分別與不同突變的特異性引物對混勻，分裝至每個反應孔；最后加入不同樣本dna(各反應組分如表1所示)。表1pcr反應體系pcr擴增程序為：變性：95℃分鐘；pcr循環(huán)擴增：95℃變性15秒，65℃降至55℃，退火20sec，72℃延伸20sec，共45個循環(huán)；接著72℃繼續(xù)延伸5min。為了針對每一對引物摸索、優(yōu)選合適的pcr條件。pcr結束后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，pcr產(chǎn)物為預期大小的、明亮的單一條帶(如圖1所示)。3、根據(jù)高分辨率熔解曲線法對擴增后的目的基因突變位點進行檢測pcr后，高分辨率熔解曲線的條件(lightscanner32)如表2所示。為確保結果判讀的準確性，每一組突變的檢測，均設置純合野生型、純合突變型、野生/突變雜合型的對照樣本。表2過程溫度時間pre-melt95℃30sechrm40℃3minmelt58→94℃升溫：1℃/0.04sec，每秒檢測熒光25次冷卻40℃30sec圖2-圖5示出了本實施例中各熱點突變的高分辨率熔解曲線圖。其中，圖2a、圖2b為ivs7-2a位點的hrm熔解曲線圖；圖3a-圖3b為c.1174a位點的hrmhrm熔解曲線圖；圖4a-圖4b為c.1229位點的hrm熔解曲線圖；圖5a-圖5b為c.2168a位點的hrm熔解曲線圖。結果顯示該方法適用于slc26a4基因熱點突變的檢測，具有直觀清晰、靈敏度高，特異性好，快速簡便的特點。以上已經(jīng)描述了本發(fā)明的各實施例，上述說明是示例性的，并非窮盡性的，并且也不限于所披露的各實施例。在不偏離所說明的各實施例的范圍和精神的情況下，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說許多修改和變更都是顯而易見的。sequencelisting<110>鄭州大學第一附屬醫(yī)院<120>基于高分辨熔解曲線技術的遲發(fā)性耳聾基因突變檢測引物組及試劑盒和應用<130>1700020<160>12<170>patentinversion3.3<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列<400>1gccaatggagtttttaacatctt23<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列<400>2ccatatgaaatggcagtagcaat23<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列<400>3cgagaaaggacacattctttttg23<210>4<211>26<212>dna<213>人工序列<400>4cgcgtggttctgtagatagagtatag26<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列<400>5gccaccactgctctttcc18<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列<400>6gttgttcctacctgtgtctttc22<210>7<211>23<212>dna<213>人工序列<400>7gccaatggagtttttaacatctt23<210>8<211>23<212>dna<213>人工序列<400>8ccatatgaaatggcagtagcaat23<210>9<211>50<212>dna<213>人工序列<400>9gcggtcagtcggcctagcggtagccagctgcggcactgcgtgacgctcag50<210>10<211>50<212>dna<213>人工序列<400>10ctgagcgtcacgcagtgccgcagctggctaccgctaggccgactgaccgc50<210>11<211>50<212>dna<213>人工序列<400>11atcgtgatttctatagttatctaagtagttggcattaataatttcatttt50<210>12<211>50<212>dna<213>人工序列<400>12aaaatgaaattattaatgccaactacttagataactatagaaatcacgat50當前第1頁12