一種抗o型口蹄疫的疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及獸用生物制品領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種抗0型口蹄疫的疫苗 組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫（FMD)為一種急性、高度接觸傳染性和可快速遠(yuǎn)距離傳播的動(dòng)物疾病，是 哺乳類動(dòng)物中感染性最強(qiáng)的疾病，其中偶蹄類動(dòng)物染病更會造成全球重大的經(jīng)濟(jì)損失。遭 受口蹄疫危害的動(dòng)物包括牛、羊、山羊和豬。致病因子，口蹄疫病毒（FMDV)，是小核糖核酸 病毒屬家族的一種口瘡病毒。該病毒分為7個(gè)血清型（A、0、C、Asia 1、SAT1、SAT2JPSAT3 型），其中〇型口蹄疫病毒流行最為廣泛。疫苗免疫是控制此病、保護(hù)家畜免受危害的有 效措施。傳統(tǒng)的疫苗包括滅活疫苗和減毒疫苗，他們雖然具有較好的免疫原性，也確實(shí)在 FMD的預(yù)防和控制中起到了非常重要的作用。但是也存在以下幾個(gè)缺點(diǎn)：1.病毒必須在高 度密封的設(shè)備中生產(chǎn)，以防止污染周圍環(huán)境；生產(chǎn)過程中，病毒有可能沒有完全殺死或充分 減毒，會導(dǎo)致疫苗中含有高毒性致病物質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致被免疫動(dòng)物發(fā)病而使疾病大規(guī)模流行。 2.有效期很短，而且常常需要冷凍保存，這增大了疫苗在農(nóng)村推廣使用的難度。3.滅活苗 免疫與感染FMD的動(dòng)物區(qū)分不開，限制了動(dòng)物出口。4.生產(chǎn)依賴于FMDV，故而不能徹底消 滅FMDV。目前使用的滅活疫苗和減毒疫苗防控已不能適應(yīng)當(dāng)前畜牧業(yè)的健康發(fā)展。
[0003] 基因工程疫苗相比來說安全穩(wěn)定性比較好，同時(shí)能給被免疫的動(dòng)物提供有效的保 護(hù)效果。但是僅僅是用抗原決定簇的表達(dá)蛋白來做疫苗，由于其分子小，結(jié)構(gòu)簡單，往往并 不能起到很好的免疫效果；只有將抗原決定簇與大分子物質(zhì)（如脂質(zhì)體或者蛋白等）一起 免疫才能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)。
[0004] 病毒樣顆粒（VLPs)是一種在體外和/或體內(nèi)表達(dá)時(shí)能夠自主包裝成病毒外殼結(jié) 構(gòu)的類病毒粒子，它們是具有病毒的相似外殼結(jié)構(gòu)但不具有病毒復(fù)制能力的假病毒。VLPs 疫苗能有效地激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗感染，抗腫瘤免疫，基于病毒樣顆粒設(shè)計(jì)的疫苗是一種較為 理想的疫苗形式。然而，〇型口蹄疫病毒抗原性很弱，尤其是我國流行的CATHAY型變異株， 其抗原發(fā)生較大變異，原有疫苗對其保護(hù)力明顯下降，加之自身免疫原性較弱，不能誘導(dǎo)動(dòng) 物機(jī)體產(chǎn)生足夠的免疫力。因此，篩選理想的毒株序列制備病毒樣顆粒是當(dāng)務(wù)之急，也符合 國家提出的有效防控重大動(dòng)物疫病，保障畜牧業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的需要。
[0005] 此外，0型口蹄疫各亞型之間的抗原性不同，彼此之間不能交互免疫，在我國，0型 口蹄疫CATHAY型及其變異株長期流行，加上近年SEA型的流行，使得0型口蹄疫的流行更 趨復(fù)雜化，迫切需要能同時(shí)防治三種亞型感染的新型疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種0型 口蹄疫病毒樣顆粒，其中，病毒樣顆粒由結(jié)構(gòu)蛋白VP0、VP3和VP1構(gòu)成。
[0007] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的0型口蹄疫病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VPO氨基酸序列為SEQ ID NO. 2, VP3氨基酸序列為SEQ ID NO. 4, VP1氨基酸序列為SEQ ID NO. 6。
[0008] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的0型口蹄疫病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VPO氨基酸序列為SEQ ID NO. 8, VP3氨基酸序列為SEQ ID NO. 10, VP1氨基酸序列為SEQ ID NO. 12。
[0009] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的0型口蹄疫病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VPO氨基酸序列為SEQ ID NO. 14, VP3氨基酸序列為SEQ ID NO. 16, VP1氨基酸序列為SEQ ID NO. 18。
[0010] 本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種預(yù)防和/或治療0型FMDV感染的疫 苗組合物，包含0型口蹄疫病毒氨基酸序列為SEQ ID N0. 2所示的VPO、SEQ ID N0. 4所示 的VP3、SEQ ID NO. 6所示的VP 1組成的病毒樣顆粒和/或氨基酸序列為SEQ ID NO. 8所示 的VP0、SEQ ID NO. 10所示的VP3、SEQ ID NO. 12所示的VP1組成的病毒樣顆粒和/或氨基 酸序列為 SEQ ID NO. 14 所示的 VPO、SEQ ID NO. 16 所示的 VP3、SEQ ID NO. 18 所示的 VP1 組成的病毒樣顆粒及佐劑。
[0011] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的預(yù)防和/或治療〇型FMDV感染的疫苗組合物，所述編碼0 型口蹄疫病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP0的核苷酸序列為SEQ ID N0. 1，VP3的核苷酸序列為SEQ ID NO. 3, VP1的核苷酸序列為SEQ ID NO. 5。
[0012] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的預(yù)防和/或治療0型FMDV感染的疫苗組合物，所述編碼0 型口蹄疫病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP0的核苷酸序列為SEQ ID NO. 7, VP3的核苷酸序列為SEQ ID NO. 9, VP1的核苷酸序列為SEQ ID NO. 11。
[0013] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的預(yù)防和/或治療0型FMDV感染的疫苗組合物，所述編碼0 型口蹄疫病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP0的核苷酸序列為SEQ ID NO. 13，VP3的核苷酸序列為SEQ ID NO. 15, VP1的核苷酸序列為SEQ ID NO. 17。
[0014] 作為本發(fā)明的另外一種實(shí)施方式，本發(fā)明提供的預(yù)防和/或治療0型FMDV感染的 疫苗組合物包含氨基酸序列為SEQ ID N0. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18及核苷酸序列為SEQ IDN0. 1，3, 5, 7, 9, 11，13, 15, 17 所示的變體。
[0015] "變體"旨在表示基本上類似序列。對于多核苷酸，變體包含在天然多核苷酸之內(nèi) 的一個(gè)或更多位點(diǎn)的一個(gè)或更多核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中一個(gè) 或更多位點(diǎn)的一個(gè)或更多核苷酸的取代。如本文所用，"天然"多核苷酸或多肽分別包含天 然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。本發(fā)明的特定多核苷酸（即，參照多核苷酸）的變體 也可通過比較由變體多核苷酸編碼的多肽和由參照多核苷酸編碼的多肽之間的百分率序 列同一性來評價(jià)。"變體"蛋白旨在表示通過在天然蛋白中的一個(gè)或更多位點(diǎn)的一個(gè)或更 多氨基酸的缺失或添加，和/或天然蛋白中的一個(gè)或更多位點(diǎn)的一個(gè)或更多氨基酸的取代 而源于天然蛋白的蛋白。本發(fā)明包括的變體蛋白有生物學(xué)活性，即，它們有引發(fā)免疫應(yīng)答的 能力，能對〇型FMDV攻擊具有保護(hù)性反應(yīng)的能力。
[0016] 變體包括等位基因變體。術(shù)語〃等位基因變體〃指稱含有導(dǎo)致蛋白的氨基酸序列 變化及在天然的群（例如，病毒物種或變種）之內(nèi)存在的多態(tài)性的多核苷酸或多肽。該天 然的等位基因變異可一般導(dǎo)致多核苷酸或多肽的1%~5%變異。等位基因變體可通過在 許多不同物種中測序目的核酸序列來鑒定，其可通過使用鑒定那些物種中的相同的遺傳座 位的雜交探針來容易進(jìn)行。任何和全部該核酸變異及得到的氨基酸多態(tài)性或是天然的等位 基因變異的結(jié)果且不改變目的基因的功能活性的變異旨在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0017] 術(shù)語"預(yù)防"指通過其與0型FMDV相關(guān)的感染或疾病的癥狀被阻斷或延遲；術(shù)語 "治療"指通過與0型FMDV相關(guān)的感染或疾病的癥狀被緩和或完全消除的過程。
[0018] 術(shù)語"保護(hù)性反應(yīng)"意為在動(dòng)物中預(yù)防0型FMDV相關(guān)疾病或由0型FMDV導(dǎo)致的 感染的發(fā)作或減輕存在的這樣的疾病的嚴(yán)重性。
[0019] 本發(fā)明涉及的0型FMDV蛋白，其有利地激發(fā)動(dòng)物中的保護(hù)性反應(yīng)。具體地，本發(fā) 明實(shí)施方式的蛋白序列包含與其功能衍生物基本相同的氨基酸序列。
[0020] "基本上相同"可以理解為本發(fā)明的蛋白優(yōu)選地具有這樣的氨基酸序列，其與SEQ ID NO :2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18中所示的序列的部分或全部具有至少70%同源性，或甚 至優(yōu)選地80%同源性，或甚至更優(yōu)選地90%同源性，或最優(yōu)選地95%同源性。
[0021] 在本文中術(shù)語"同源性"還包括與參比序列相同或類似，同時(shí)提供任何氨基酸的簡 單替換/修飾?？梢杂肂LAST-P (基本局部排比檢索工具），本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的程序進(jìn) 行該方面的同源性檢索。對于相應(yīng)的核酸序列，同源性涉及在本領(lǐng)域中已知的BLASTX和 BLASTN 程序。
[0022] 術(shù)語"佐劑"指加入到本發(fā)明的組合物中以增加組合物的免疫原性的物質(zhì)。已知 的佐劑包括，但不限于：⑴氫氧化錯(cuò)，皂苷（Saponine)(例如QuilA)，阿夫立定，DDA，（2) 丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，順丁烯二酸酐和鏈烯基衍生物的聚合物，或（3)疫苗可以 以水包油，油包水或水包油包水乳劑形式制成。
[0023] 尤其是，乳劑可以基于輕液體石蠟油、類異戊二烯油，例如角鯊?fù)榛蚪酋徬?；烯烴， 特別是異丁烯或癸烯低聚化產(chǎn)生的油，帶直鏈烷基的酸或醇形成的酯，更特別是植物油，油 酸乙基酯，丙二醇二（辛酸酯/癸酸酯）