專利名稱：利用生物催化法合成腺苷蛋氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腺苷蛋氨酸的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
腺苷蛋氨酸SAM存在于從低等生物細(xì)菌到高等多細(xì)胞生物人類的一切生物體內(nèi)，在細(xì)胞和人體代謝過程中扮演著重要生物學(xué)功能。腺苷蛋氨酸以兩種同分異構(gòu)體形式存在(S，S)S-adenosyl-L-methionine and(R，S)S-adenosyl-L-methionine。它的主要生物學(xué)功能包括在體內(nèi)轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)中作為甲基供體(它為體內(nèi)脫氧核糖核酸、蛋白質(zhì)、激素、兒茶酚(Catechol)，吲哚胺(Indoleamine)，磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine)和磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine)的生物合成提供甲基)；它作為裂解酶的底物參與生物化學(xué)反應(yīng)生成Methylthioadenosine和高半胱氨酸；脫梭后在體內(nèi)為神經(jīng)調(diào)解劑多氨(polyamines spermidine and spermine)的生物合成提供氨丙基，為tRNA的生物合成提供氨丁基前體；它還作為輔酶參與生物素(Biotin)合成酶促反應(yīng)，為生物素的生物合成提供前體；參與體內(nèi)激素、神經(jīng)遞質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)、和磷脂的生物合成和代謝。可見腺苷蛋氨酸是維護(hù)細(xì)胞膜正常功能和人體正常代謝和健康不可缺少的重要生命物質(zhì)。SAM還參與細(xì)胞中的主要抗氧化劑谷胱甘肽的合成，與體內(nèi)抗氧化和各種解毒過程密切相關(guān)。
自二十世紀(jì)五十年代被發(fā)現(xiàn)以來，人們對(duì)腺苷蛋氨酸的化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)功能進(jìn)行了大量的研究。到目前為止已有來自十幾個(gè)物種的腺苷蛋氨酸合成酶基因被分子克隆，其中包括大腸桿菌、枯草桿菌、酵母、脈孢菌、大鼠、以及水稻等。
二十多年來歐洲和北美醫(yī)藥界的大量的動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)表明，腺苷蛋氨酸能促進(jìn)和維護(hù)肝臟的正常功能，對(duì)多種肝炎和肝功能衰竭具有明顯的治療效果；腺苷蛋氨酸可促進(jìn)軟骨組織的形成和損傷愈合，維護(hù)骨骼關(guān)節(jié)的健康，對(duì)各種關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)損傷具有明顯療效；腺苷蛋氨酸參與磷脂和多胺的生物合成，對(duì)維護(hù)細(xì)胞膜正常通透性和中樞神經(jīng)細(xì)胞的正常功能至關(guān)重要。腺苷蛋氨酸可調(diào)節(jié)中樞系統(tǒng)功能，對(duì)抑郁癥具有顯著的治療效果。老年性癡呆癥患者腦脊液中腺苷蛋氨酸含量明顯減少，帕金森氏綜合癥患者血液中腺苷蛋氨酸含量也顯著降低。臨床試驗(yàn)還證實(shí)腺苷蛋氨酸能明顯減輕老年性癡呆癥。
上世紀(jì)八十年代人們開始研究利用重組腺苷蛋氨酸合成酶在體外催化合成腺苷蛋氨酸，為腺苷蛋氨酸的酶促大規(guī)模生產(chǎn)做了大量工作。
盡管腺苷蛋氨酸在人體代謝中的重要功能和它的臨床價(jià)值，腺苷蛋氨酸在常溫條件下的吸濕性和不穩(wěn)定性以及生產(chǎn)工藝的復(fù)雜性嚴(yán)重限制了腺苷蛋氨酸在醫(yī)療保健領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。因此，歐美科技界在腺苷蛋氨酸的穩(wěn)定成鹽和生產(chǎn)工藝方面申報(bào)了多項(xiàng)專利。以下是藥物原料市場上具有代表性的一些專利如美國專利6,635,615、5,102,791、4,028,183、4369177、4764603等。
傳統(tǒng)的腺苷蛋氨酸生產(chǎn)是通過酵母發(fā)酵實(shí)現(xiàn)的，酵母發(fā)酵方法的缺點(diǎn)是原料轉(zhuǎn)化率低，產(chǎn)品生產(chǎn)周期長，發(fā)酵法一個(gè)生產(chǎn)周期至少需10天時(shí)間，終產(chǎn)品分離純化程序復(fù)雜。生產(chǎn)工藝的復(fù)雜導(dǎo)致了腺苷蛋氨酸產(chǎn)品的價(jià)格昂貴。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種利用生物催化法合成腺苷蛋氨酸的方法。以解決通過酵母發(fā)酵方法生產(chǎn)腺苷蛋氨酸存在的原料轉(zhuǎn)化率低，產(chǎn)品生產(chǎn)周期長，終產(chǎn)品分離純化程序復(fù)雜、價(jià)格昂貴的問題。
本發(fā)明采取的技術(shù)方案是由L-蛋氨酸(L-methionine)和三磷酸腺苷(adenosine 5’-triphosphate)反應(yīng)形成的產(chǎn)物腺苷蛋氨酸在催化反應(yīng)體系中直接與有機(jī)磺酸反應(yīng)成鹽，其中有機(jī)磺酸在反應(yīng)體系中的濃度為0.1-0.5mol/L。
本發(fā)明中合成反應(yīng)、成鹽反應(yīng)、催化劑回收、結(jié)晶反應(yīng)采用的PH范圍為1-7，鉀、鎂離子的濃度為20-200毫摩/升，有機(jī)磺酸濃度為50-500毫摩/升，L-蛋氨酸濃度為1-500毫摩/升，羧甲基纖維素等弱堿性樹脂與催化劑的質(zhì)量比為1∶1-10∶1。
本發(fā)明中編碼生物催化劑腺苷蛋氨酸合成酶(EC2.5.1.6)的基因是由化學(xué)合成方法獲得，合成酶的表達(dá)受啟動(dòng)子TAC調(diào)控。
本發(fā)明中催化劑的回收重復(fù)利用是通過羧甲基纖維素類樹脂吸附固化實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明中生物催化劑的非共價(jià)吸附固化明顯增加了腺苷蛋氨酸合成酶的催化活性和穩(wěn)定性。
本發(fā)明中催化終產(chǎn)物腺苷蛋氨酸鹽的分離與合成酶的吸附固化過程相結(jié)合，使催化劑回收的同時(shí)達(dá)到產(chǎn)物的純化。
本發(fā)明由于催化合成與產(chǎn)物成鹽相結(jié)合，催化劑回收與產(chǎn)物純化相結(jié)合，產(chǎn)物鹽晶體穩(wěn)定性高，該工藝方法明顯降低了酶促合成生產(chǎn)腺苷蛋氨酸的生產(chǎn)成本。
本發(fā)明應(yīng)用低溫結(jié)晶方法獲得高穩(wěn)定腺苷蛋氨酸鹽晶體制劑，結(jié)晶的條件是1-500毫摩/升腺苷蛋氨酸鹽，加1-10倍于原液體積的丙酮，酸堿度PH1-7，溫度0-20攝氏度。
本發(fā)明為產(chǎn)物對(duì)酶活的反饋抑制通過重組無機(jī)焦磷酸酶得到克服。
反應(yīng)原料L-蛋氨酸在體系中的轉(zhuǎn)化率超過95％，每次反應(yīng)后合成酶回收率大于90％，成鹽結(jié)晶后產(chǎn)率60％-80％，純度大于95％。
本發(fā)明先利用基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)生物化學(xué)技術(shù)制備高活性生物催化劑腺苷蛋氨酸合成酶；再利用生物催化工程技術(shù)對(duì)腺苷蛋氨酸合成反應(yīng)的催化條件、產(chǎn)物分離工藝、產(chǎn)物對(duì)催化劑活性反饋抑制的克服工藝、和催化劑的穩(wěn)定重復(fù)利用工藝進(jìn)行優(yōu)化；最后利用藥物化學(xué)和藥物制劑技術(shù)在增加產(chǎn)物穩(wěn)定性的同時(shí)簡化產(chǎn)物成鹽、純化、和催化劑回收程序。
本發(fā)明利用基因工程技術(shù)和酶工程技術(shù)將化學(xué)合成法獲得的腺苷蛋氨酸合成酶基因利用高效原核表達(dá)系統(tǒng)制備重組腺苷蛋氨酸合成酶，重組腺苷蛋氨酸合成酶純酶比活性高達(dá)2-5IU/毫克，可將大于95％的反應(yīng)原料L-蛋氨酸和ATP在PH5-9、15-35攝氏度、和少量無機(jī)焦磷酸酶存在的條件下轉(zhuǎn)化為腺苷蛋氨酸；而酵母發(fā)酵發(fā)合成腺苷蛋氨酸的轉(zhuǎn)化率僅為15-30％，形成的產(chǎn)物直接與有機(jī)多磺酸成鹽，催化劑由羧甲基纖維素等陰離子交換樹脂吸附回收后，產(chǎn)物腺苷蛋氨酸純度近90％，低溫結(jié)晶后純度超過95％。本發(fā)明生產(chǎn)周期短，一個(gè)生產(chǎn)周期僅3天時(shí)間，工藝簡單，放大簡易可行。本發(fā)明進(jìn)一步完善了腺苷蛋氨酸規(guī)模生產(chǎn)中的催化劑回收和產(chǎn)品純化技術(shù)，在原有催化技術(shù)基礎(chǔ)上大大簡化了生產(chǎn)工藝、降低了生產(chǎn)成本、提高了生物催化技術(shù)在大規(guī)模生產(chǎn)腺苷蛋氨酸產(chǎn)品中的實(shí)用性。
具體實(shí)施例方式
實(shí)驗(yàn)材料和方法1、工程菌和試劑大腸桿菌基因重組工程菌，該菌種已提交中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村，保藏日期2005年10月17日，保藏編號(hào)CGMCC No.1492，分類命名大腸埃希氏菌Escherichia coli，攜帶化學(xué)合成腺苷蛋氨酸合成酶(EC2.5.1.6)基因。
試劑全部為國產(chǎn)分析純級(jí)。各試劑配成以下濃度備用。1mol/l硼酸鹽或N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸HEPES緩沖液，pH值為7.5±1；1mol/l K2SO4；1mol/l MgSO4；0.4mol/l三磷酸腺苷ATP；0.2mol/l L-蛋氨酸；對(duì)甲苯磺酸鈉；對(duì)1，4-丁烷二磺酸鈉；99％β-巰基乙醇；0.5mol/l乙二胺四乙酸EDTA；去離子水。羧甲基纖維素CM cellulose均孔弱堿性陰離子交換樹脂(SIGMA)。
2、培養(yǎng)基A培養(yǎng)基蛋白胨12g/l；酵母粉24g/l，K2HPO49.4g/L，KH2PO42.2g/l，Glycerol 0.2％。上述試劑用去離子水溶解后，在120℃、16PSI壓力下滅菌20分鐘。接種前加入胺卞青霉素至終濃度25μg/ml。
B培養(yǎng)基在A培養(yǎng)基中加入1.5％的瓊脂后進(jìn)行滅菌，條件同A培養(yǎng)基，滅菌后未凝固前加入胺卞青霉素，終濃度為25μg/ml，凝固后即制成瓊脂平板培養(yǎng)基。
3、發(fā)酵將上述瓊脂平板培養(yǎng)基，也就是B培養(yǎng)基上培養(yǎng)的腺苷蛋氨酸合成酶基因工程菌，挑起單菌落，接入40ml A培養(yǎng)基中(含25μg/ml胺卞青霉素)，37℃搖床培養(yǎng)16小時(shí)。將以上的菌液接種到6L的A培養(yǎng)基中(含25μg/ml胺卞青霉素)，37℃搖床培養(yǎng)20小時(shí)左右，測(cè)菌液的OD600＝1.8以上。將二級(jí)培養(yǎng)后收集的菌液進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為4000rpm，離心時(shí)間10分針，棄去上清液，收集沉淀的菌體，-70℃凍存。
4、催化劑制備將發(fā)酵獲得的工程菌菌體(檢驗(yàn)后目的蛋白應(yīng)占總蛋白的20％以上)用HEPES緩沖液進(jìn)行懸浮，每克細(xì)胞泥用4毫升緩沖液，懸浮后的菌液利用均質(zhì)機(jī)進(jìn)行破碎，操做的壓力為60MPa，溫度控制在15℃以下，循環(huán)兩次。收集懸浮液進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為18000rpm，溫度為4℃。離心后收集含有催化劑的上清液備用，24小時(shí)內(nèi)使用可儲(chǔ)存在4℃，長期儲(chǔ)存應(yīng)在-20℃。
實(shí)施例一 酶催化腺苷蛋氨酸合成反應(yīng)以一升的反應(yīng)體系為例1、加入試劑分別加入上述配制好的試劑N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸HEPES緩沖液50毫升；1mol/l K2SO4100毫升；1mol/l MgSO450毫升；0.4mol/l三磷酸腺苷ATP20毫升；0.2mol/l L-蛋氨酸60毫升；對(duì)甲苯磺酸鈉77克；99％β-巰基乙醇1毫升；0.5mol/l乙二胺四乙酸EDTA 2毫升；0.001-0.01單位(IU)無機(jī)焦磷酸酶，含有20-30單位(IU)的催化劑上清液，去離子水定容至1升。
2、反應(yīng)溫度和時(shí)間將上述混合液加到反應(yīng)器中，設(shè)置反應(yīng)溫度為35℃，反應(yīng)時(shí)間10小時(shí)。
3、中止反應(yīng)反應(yīng)結(jié)束后加入硫酸至終濃度為0.05mol/L中止反應(yīng)。
實(shí)施例二 酶催化腺苷蛋氨酸合成反應(yīng)以一升的反應(yīng)體系為例1、加入試劑分別加入上述配制好的試劑硼酸緩沖液60毫升；1mol/l K2SO490毫升；1mol/l MgSO460毫升；0.4mol/l三磷酸腺苷ATP 20毫升；0.2mol/lL-蛋氨酸60毫升；對(duì)1，4-丁烷二磺酸鈉70克；99％β-巰基乙醇1毫升；0.5mol/國EDTA 2毫升；去離子水定容至1升。
2、反應(yīng)溫度和時(shí)間將上述混合液加到反應(yīng)器中，設(shè)置反應(yīng)溫度為30℃，反應(yīng)時(shí)間10小時(shí)。
3、中止反應(yīng)反應(yīng)結(jié)束后加入硫酸至終濃度為0.05mol/L中止反應(yīng)。
實(shí)施例三 催化劑回收1、加入弱堿性離子交還樹脂在催化反應(yīng)終止后的上述混合液中加入CM cellulose均孔弱堿性陰離子交換樹脂，終濃度為50g/l，調(diào)PH至5.5，溫度20℃，輕度攪拌～30分鐘。
2、離心取1.0mL小樣離心，上清紫外吸收A280/A260＜1.0后即可確定合成酶吸附完成。樣品經(jīng)4℃下3000rpm離心15分鐘，沉淀經(jīng)50毫摩HEPES緩沖液(pH7.5)重懸后既可進(jìn)行重新催化反應(yīng)。上清經(jīng)HPLC檢測(cè)腺苷蛋氨酸鹽純度達(dá)到90％。
實(shí)施例四 產(chǎn)物腺苷蛋氨酸鹽的濃縮和結(jié)晶(1)合成酶經(jīng)吸附回收后上清液經(jīng)鈉濾濃縮至腺苷蛋氨酸鹽濃度為～90毫摩/L后即可投入丙酮進(jìn)行結(jié)晶。丙酮對(duì)腺苷蛋氨酸鹽溶液的容積比為5，酸堿度為PH本5.0，溫度為10攝氏度。晶體由乙醇沖洗后低溫冷卻干燥。晶體樣品經(jīng)HPLC、電噴霧質(zhì)譜、核磁共振碳譜檢測(cè)純度達(dá)到95％。
實(shí)施例五 產(chǎn)物腺苷蛋氨酸鹽的濃縮和結(jié)晶(2)合成酶經(jīng)吸附回收后上清液經(jīng)鈉濾濃縮至腺苷蛋氨酸鹽濃度為～100毫摩/L。投入丙酮的量為丙酮對(duì)腺苷蛋氨酸鹽溶液的容積比為10，酸堿度為PH本3.0，溫度為10攝氏度。晶體由甲醇沖洗后低溫冷卻干燥。晶體樣品經(jīng)HPLC、電噴霧質(zhì)譜、核磁共振碳譜檢測(cè)純度達(dá)到95％。
權(quán)利要求
1.一種利用生物催化法合成腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于由L-蛋氨酸和三磷酸腺苷反應(yīng)形成的產(chǎn)物腺苷蛋氨酸在催化反應(yīng)體系中直接與有機(jī)磺酸反應(yīng)成鹽，其中有機(jī)磺酸在反應(yīng)體系中的濃度為0.1-0.5mol/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用生物催化法催化合成腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于編碼生物催化劑腺苷蛋氨酸合成酶(EC2.5.1.6)的基因是由化學(xué)合成方法獲得，合成酶的表達(dá)受啟動(dòng)子TAC調(diào)控。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用生物催化法催化合成腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于催化劑的回收重復(fù)利用是通過羧甲基纖維素類樹脂吸附固化實(shí)現(xiàn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用生物催化法催化合成腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于生物催化劑的非共價(jià)吸附固化明顯增加了腺苷蛋氨酸合成酶的催化活性和穩(wěn)定性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用生物催化法催化合成腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于催化終產(chǎn)物腺苷蛋氨酸鹽的分離與合成酶的吸附固化過程相結(jié)合，使催化劑回收的同時(shí)達(dá)到產(chǎn)物的純化。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用生物催化法催化合成腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于應(yīng)用低溫結(jié)晶方法獲得高穩(wěn)定腺苷蛋氨酸鹽晶體制劑，結(jié)晶的條件是1-500毫摩/升腺苷蛋氨酸鹽，加1-10倍于原液體積的丙酮，酸堿度PH值1-7，溫度0-20攝氏度。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用生物催化法催化合成腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于產(chǎn)物對(duì)酶活的反饋抑制通過重組無機(jī)焦磷酸酶得到克服。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用生物催化法合成腺苷蛋氨酸的方法，屬于腺苷蛋氨酸的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的特征是腺苷蛋氨酸的催化合成反應(yīng)與腺苷蛋氨酸產(chǎn)物的成鹽反應(yīng)結(jié)合為一步完成，催化劑的吸附回收和產(chǎn)物純化結(jié)合為一步完成。該方法大大簡化了傳統(tǒng)腺苷蛋氨酸生產(chǎn)工藝、縮短生產(chǎn)周期40％、明顯降低了腺苷蛋氨酸的生產(chǎn)成本。利用本發(fā)明所述生產(chǎn)工藝生產(chǎn)腺苷甲硫氨酸產(chǎn)物下游純化簡易，產(chǎn)物穩(wěn)定性強(qiáng)，為低成本大規(guī)模生產(chǎn)藥用腺苷蛋氨酸提供了一條新途徑。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1814774SQ20051011901
公開日2006年8月9日 申請(qǐng)日期2005年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月25日
發(fā)明者陳大偉 申請(qǐng)人:吉林省奇健生物技術(shù)有限公司