一種s-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的活性檢測方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的活性檢測方法，括如下步驟：將二氧化碳測定試劑R1混合試劑、R2混合試劑在1.5mL的EP試管進(jìn)行混合，再添加腺苷甲硫氨酸，最后添加S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(AdoMetDC)，得到總體積為1000ul的混合液，啟動反應(yīng)；將上述混合液在37℃的水浴中孵育反應(yīng)1-30min后，再將該混合液轉(zhuǎn)至200uL/孔的透明96孔板，利用酶標(biāo)儀等儀器檢測體系在340nm波長處的光吸收，對該混合物的反應(yīng)活性進(jìn)行檢測。該方法操作簡單，效果良好，只需要簡單的光吸收檢測，即可實(shí)現(xiàn)。該方法適用于快速進(jìn)行AdoMetDC活性的檢測和抑制劑的篩選與設(shè)計(jì)。
【專利說明】一種S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的活性檢測方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶（s-adenosylmethionine decarboxylase ;AdoMetDC)，具體涉及人源S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶活性檢測方法和及在藥 物篩選上的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)是生物體的主要組成成分之一，是完成各種生命活動的主要物質(zhì)。在各種 蛋白質(zhì)中，蛋白酶對生命活動至關(guān)重要，幾乎所有生物體內(nèi)的生化反應(yīng)過程都由蛋白酶進(jìn) 行催化。生物體內(nèi)各種蛋白酶的活性具有嚴(yán)格的調(diào)控機(jī)制，一旦其調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)問題，造成 蛋白酶的活性過高、過低或者是完全失活，都會造成相應(yīng)的各類疾病。因此，通過藥物來調(diào) 控蛋白酶的活性，使其恢復(fù)和保持在正常水平，具有非常重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。以結(jié) 構(gòu)為基礎(chǔ)的藥物設(shè)計(jì)，是設(shè)計(jì)以蛋白質(zhì)為靶標(biāo)的藥物的一個非常重要的手段。
[0003] 多胺（polyamines)是一類從氨基酸代謝產(chǎn)生的帶正電的陽離子小分子，在所 有生物體中都存在，對細(xì)胞生長、分化、存活及正常生物學(xué)功能等都不可缺少。多胺帶多 正電荷的特性，使它們能通過與帶負(fù)電荷的生物大分子（DNA、RNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜等）形 成靜電作用，從而調(diào)控非常廣泛的生物學(xué)過程，包括染色體結(jié)構(gòu)形成、DNA合成與穩(wěn)定、 DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯、蛋白質(zhì)磷酸化、核糖體生成、離子通道和膜表面受體的調(diào)控、自由 基清除等。天然的多胺有很多種。在哺乳動物中，天然存在的有三種，即putrescine(腐 胺），spermidine(精脒），spermine.(精胺），它們對哺乳動物正常生長和發(fā)育必不可少。 由于多胺具有重要的生物學(xué)功能，其細(xì)胞內(nèi)水平受到嚴(yán)格的調(diào)控。在快速繁殖的細(xì)胞（如 腫瘤細(xì)胞）中，多胺水平也會上升和失調(diào)。多胺水平升高，伴隨著細(xì)胞增殖加快、凋亡減少、 以及腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)水平升高等。因此，多胺的調(diào)控，成為腫瘤治療和藥物 研發(fā)中的一個重要手段。
[0004] AdoMetDC是多胺體內(nèi)合成的一個關(guān)鍵酶，對于精胺和精脒的合成至關(guān)重要，因?yàn)?精胺和精脒的氨丙基來源于AdoMetDC的脫羧反應(yīng)。因此，合成AdoMetDC抑制劑，抑制精胺 和精脒的生成，是目前很受關(guān)注的一個腫瘤治療途徑。同時，由于病原微生物也需要維持正 常的多胺水平，因此AdoMetDC抑制劑也成為針對病原微生物的一個重要藥物靶標(biāo)。
[0005] 當(dāng)前，AdoMetDC的抑制劑MGBG (米托胍腙）已經(jīng)被用于臨床中的抗白血病治療和 癌癥的化療輔助藥物。但MGBG會導(dǎo)致嚴(yán)重的線粒體損傷，因此毒副作用非常大。AdoMetDC 的抑制劑CGP 48664(SAM486A)已經(jīng)進(jìn)入I期和II期臨床評估。因此，篩選和設(shè)計(jì)新的 AdoMetDC抑制劑具有重要意義和價值。
[0006] 在篩選和設(shè)計(jì)AdoMetDC抑制劑的過程中，一個很重要的評價指標(biāo)是檢測藥物對 AdoMetDC的酶活性抑制能力。目前，檢測AdoMetDC的活性和抑制劑效果，比較有效的是采 用C14同位素標(biāo)記的腺苷甲硫氨酸（[ 14C00H]Ad〇Met)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過檢測14CO2的產(chǎn)生進(jìn)行 評價。該方法雖然很靈敏和準(zhǔn)確，但是由于涉及到同位素操作，需要特殊的設(shè)備和操作，藥 品價格也比較昂貴，因此普通實(shí)驗(yàn)室難以使用，且無法用于高通量的AdoMetDC藥物篩選。 因此，開發(fā)出價格低廉、操作簡便、普適度高的AdoMetDC活性檢測體系，具有重要價值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是確定建立一個簡便的、非放射性同位素標(biāo)記的AdoMetDC活性檢 測的方法，用于AdoMetDC的活性檢測和抑制劑評價、篩選和設(shè)計(jì)。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案是，基于脫羧酶產(chǎn)生CO2的原理，利用二氧化碳測定的PEPC酶 法，通過調(diào)節(jié)有關(guān)組成成分，確定了一個能夠進(jìn)行AdoMetDC活性檢測和抑制劑效果評價的 測活方法。該方法的Rl和R2試劑的主要組成如下：
[0009]

【權(quán)利要求】
1. 一種S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的活性檢測方法，其特征在于，包括如下步驟： 1) 將二氧化碳測定試劑Rl混合試劑、R2混合試劑在I. 5mL的EP試管進(jìn)行混合，再添 加腺苷甲硫氨酸，最后添加S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶（AdoMetDC)，得到總體積為IOOOuI的混 合液，啟動反應(yīng)； 2) 將上述混合液在37°C的水浴中孵育反應(yīng)l_30min后，再將該混合液轉(zhuǎn)至200uL/孔 的透明96孔板，利用酶標(biāo)儀等儀器檢測體系在340nm波長處的光吸收，對該混合物的反應(yīng) 活性進(jìn)行檢測； 3) 在步驟1)、2)的基礎(chǔ)上同時檢測不加S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶（AdoMetDC)或不加腺 苷甲硫氨酸的混合液的反應(yīng)活性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的活性檢測方法，其特征在于：所述 的Rl的混合試劑為5. 5-10. 5mmol/L的磷酸烯醇式丙酮酸及4. 6-10. 8mmol/L的氯化鎂的 混合溶液；R2的混合試劑為360-450U/L的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，520-680U/L的蘋果酸 脫氫酶，0. 35-0. 55mmol/L的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的混合溶液，所述的腺苷甲硫氨酸的濃 度為0. 01-500mM ;所述的S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶（AdoMetDC)的濃度為0. 1-lOOuM。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的活性檢測方法，其特征在于：所述 的Rl的混合試劑為7. Ommol/L的磷酸烯醇式丙酮酸及8. Ommol/L的氯化鎂的混合溶液；R2 的混合試劑為400U/L的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，600U/L的蘋果酸脫氫酶，0. 45mmol/L的 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的混合溶液；腺苷甲硫氨酸的濃度為ImM ;S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶 (AdoMetDC)的濃度為 luM。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的活性檢測方法，其特征在于：R1混 合試劑、R2混合試劑、腺苷甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶（AdoMetDC)的體積比為1 : 2. 8-3. 5 ：0. OOl-O. 003 ：0. 5-0. 8〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的活性檢測方法，其特征在于：步驟 1)中所述的反應(yīng)是在空氣條件下或者在N2保護(hù)條件下進(jìn)行。 6. S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的活性檢測方法在篩選抑制S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的抑制 劑上的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/573GK104316682SQ201410530672
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月10日
【發(fā)明者】劉森, 廖陳曾, 王艷林, 占景瓊 申請人:三峽大學(xué)