一種頭孢菌素c酰化酶突變體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體地說，設及通過點突變法構建的用于一步酶 法生產(chǎn)7-ACA(7-氨基頭抱燒酸)的頭抱菌素 C酷化酶。
【背景技術】
[0002] 頭抱類抗生素是現(xiàn)在應用最廣泛的β-內酷胺類抗生素，該類抗生素大部分是通過 7-氨基頭抱燒酸(7-aminocephalosporanic acid,簡稱為7-ACA)合成的7-ACA衍生物，運類 抗生素占到了全球抗生素市場40%的份額。
[0003] 7-ACA-般通過化學法或生物酶法裂解頭抱菌素 "Cephalosporin C，簡稱為 CPC)，脫去分子側鏈而獲得。因化學法工藝復雜、能耗高，污染嚴重，近幾年來，工業(yè)生產(chǎn)7- ACA基本已替換為生物酶法制備。目前使用的生物酶法又分為兩步酶法和一步酶法。兩步酶 法采用得較早，主要用到D-氨基酸氧化酶(D-Amino Acid化idase，W下簡稱為DAA0)和戊 二酷基-7-氨基頭抱燒酸(Glu1:a;ry；L-7-Amidoc邱halospranic Acid, W下簡稱為化-7-ACA) 酷化酶，CPC在DAA0的作用下生成化-7-ACA，然后再在化-7-ACA酷化酶的作用下脫去側鏈， 生成7-ACA。雖然該方法因環(huán)保、低能耗、高收率等特點已經(jīng)基本取代了化學法，但該方法中 DAA0催化反應的副產(chǎn)物也化對CPC有降解作用，且為兩步催化反應，步驟較為復雜。因此，人 們開發(fā)出了 一步酶法制備7-ACA的技術，即利用CPC酷化酶催化CPC脫去側鏈，生成7-ACA。
[0004] 自20世紀80年代W來，人們從自然界中發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)CPC酷化酶(頭抱菌素 C酷化酶)的 菌株，女日Pseudomonas sp. SE83、Pseudomonas diminuta N176、Pseudomonas sp.PlSO、 Pseudomonas sp.GK16等，但運些酶嚴格來說是化-7-ACA酷化酶，它們的CPC酷化酶活力均 比較低，只有化-7-ACA酷化酶活力的2-4%。迄今為止，自然界尚未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)高催化活力的CPC 酷化酶野生菌。野生型的CPC酷化酶還不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)CPC的要求，因此一步酶法至今 不能完全取代兩步酶法來大規(guī)模生產(chǎn)7-ACA?，F(xiàn)在對Pseudomonas sp. SE83來源的CPC酷化 酶改造的研究相對比較多，通過改造篩選，CPC酷化酶活性較野生酶提高了幾十倍，但該類 型的CPC酷化酶都有很強的7-ACA產(chǎn)物抑制性。近年來，對Pseudomonas SP.GK16菌株來源的 CPC酷化酶改造出現(xiàn)了較大的進展，將該來源的CPC酷化酶的β亞基的第45位由I替換成v、e 亞基的第58位由F替換成ν、β亞基的第153位由Y替換成Τ、β亞基的第177位由F替換成L、i3亞 基的第382位由V替換成L，獲得的突變體的CPC酷化酶酶活提高了 25.3倍，但該酶活仍然無 法滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求。

【發(fā)明內容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有一步酶法生產(chǎn)7-ACA技術中的上述缺陷，得到酶活性更高、底物特異 性更高的CPC酷化酶，本發(fā)明利用基因工程技術來對微生物來源的野生型CPC酷化酶進行改 造和篩選，構建高酶活性的CPC酷化酶突變體，從而實現(xiàn)一步酶法生產(chǎn)7-ACA的工業(yè)化。
[0006] 為此，本發(fā)明通過隨機突變、半理性設計等技術對Pseudomonas SP.GK16來源的 化-7-ACA酷化酶(SEQ ID NO: 1)進行改造，獲得WCPC作為特異性底物的高酶活的CPC酷化 酶突變體，W便高效地將CPC催化生成7-ACA。
[0007] 因此，本發(fā)明的第一個目的在于提供一種用于生產(chǎn)7-ACA的高酶活力的CPC酷化酶 突變體。
[0008] 本發(fā)明的第二個目的在于提供編碼上述CPC酷化酶突變體的基因。
[0009] 本發(fā)明的第Ξ個目的在于提供包含上述基因的質粒。
[0010] 本發(fā)明的第四個目的在于提供轉化了上述質粒的微生物。
[0011] 本發(fā)明的第五個目的在于提供上述CPC酷化酶突變體或微生物在生產(chǎn)7-ACA中的 用途。
[001 ^ 為了達至化述目的，本發(fā)明提供如下頭抱菌素 C酷化酶：
[0013] -種頭抱菌素 C酷化酶(CPC酷化酶），其氨基酸序列為：
[0014] SEQ ID NO:3,其為SEQ ID NO: 1第240位的V替換為F的突變體，其氨基酸序列為：
[0015]

[0026] SEQ ID N0:9,其為SEQ ID N0:1第215位的I替換為V、第228位的F替換為V、第240 位的V替換為F、第306位的A替換為T、第323位的Y替換為T、第347位的F替換為L、第552位的V 替換為L的突變體、第553位的R替換為L的突變體、第623位的Η替換為T的突變體，其氨基酸 序列為：
[0027]
[00%]優(yōu)選上述頭抱菌素 C酷化酶的氨基酸序列為SEQ ID Ν0:9。
[0029] -種編碼上述頭抱菌素 C酷化酶的基因。
[0030] 優(yōu)選地，編碼上述頭抱菌素 C酷化酶SEQ ID N0:9的基因具有下述堿基序列：
[0031]

[0032] -種包含上述基因的質粒。該質粒包含用于表達上述基因的載體，優(yōu)選載體是PET 系列，比如載體是祀T24a( + )，但并不受限于此。
[0033] -種轉化了上述質粒的微生物，該微生物可作為宿主用于表達上述頭抱菌素 C酷 化酶。
[0034] 優(yōu)選地，上述微生物選自枯草芽抱桿菌、畢赤酵母、釀酒酵母、大腸桿菌，優(yōu)選大腸 桿菌，更優(yōu)選大腸桿菌化21 (DE3)。
[0035] 上述頭抱菌素 C酷化酶或者微生物可W用于生產(chǎn)7-ACA、尤其是一步酶法生產(chǎn)7- ACA。
[0036] 在生產(chǎn)7-ACA中，W頭抱菌素 C為底物原料，用上述頭抱菌素 C酷化酶或者微生物作 為催化劑來催化反應。
[0037] 生產(chǎn)7-ACA可采用常規(guī)的工藝條件，比如，頭抱菌素 C(CPC)的濃度可選擇1~ 3wt %，優(yōu)選2.5wt % ;反應溫度選擇10~37°C，優(yōu)選15°C。
[003引本發(fā)明的CPC酷化酶突變體水解CPC產(chǎn)生7-ACA的活性相較野生酶提高了 20.5倍至 150倍，底物特異性更高，產(chǎn)物抑制性更低，當應用于一步法生產(chǎn)7-ACA時，7-ACA生成率超過 98%，極具工業(yè)化前景。
【具體實施方式】
[0039] W下結合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。應理解，W下實施例僅用于說 明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0040] 本文中設及到多種物質的添加量、含量及濃度，其中所述的百分含量，除特別說明 夕h皆指質量百分含量。
[0041] 為簡要起見，本文中的氨基酸縮寫既可W使用英文Ξ字母、也可W采用英文單字 母，運是本領域技術人員熟知的，運些縮寫列于下表中：
[0042] 表1氨基酸中英文對照及縮寫
[0043]
[0045] 作為構建頭抱菌素 C酷化酶突變體的基礎模板，Pseudomonas SP.GK16來源的野生 型化-7-ACA酷化酶的氨基酸序列是序列表中的SEQ ID N0:1。其編碼基因是序列表中的SEQ ID N0:2。
[0046] 為了獲得酶活性更高的CPC酷化酶突變體，本發(fā)明對野生型CPC酷化酶SEQ ID NO: 1的基因序列SEQ ID NO: 2進行點突變。通過易錯PCR技術獲得一個或多個氨基酸位點取代 的突變體氨基酸序列，篩選出多個可提高CPC酷化酶的酶活的位點，包括240位鄉(xiāng)氨酸(β膚 第70位）、306位丙氨酸(β膚第136位）、553位精氨酸(β膚第383位)和623位組氨酸(β膚第453 位）。然后W定點突變技術對上述位點進行隨機組合突變，獲得本發(fā)明中具有氨基酸序列 SEQ ID NO:7-8的突變體。最后再在SEQ ID NO:8的基礎上進行定點突變，獲得本發(fā)明中具 有氨基酸序列SEQ ID NO:9的突變體。
[0047] 其中，SEQ ID NO: 1是運些氨基酸序列SEQ ID NO: 3-9的共同序列，運些氨基酸序 列都是在SEQ ID NO: 1的基礎上進行1個、或2個、最多9個氨基酸的替換而獲得的突變體，運 些突變體氨基酸序列保持了98% W上的同源性。
[004引在本發(fā)明中，術語乂PC酷化酶突變體"、"突變體CPC酷化酶"、"突變CPC酷化酶"和 "突變酶"表示相同的意義，都是指頭抱菌素 C酷化酶的突變體。
[0049] 在本發(fā)明中，術語"野生（型r、"野生酶"、"野生型酶"表示相同的意義，都是指野 生型的化-7-ACA酷化酶或稱CPC酷化酶(SEQ ID NO: 1)。
[0050] 本發(fā)明的CPC酷化酶突變體的氨基酸數(shù)量只有692個，且結構明確，因此本領域技 術人員很容易獲得其編碼基因、包含運些基因的表達盒和質粒、W及包含該質粒的轉化體。
[0051] 運些基因、表達盒、質粒、轉化體可W通過本領域技術人員所熟知的基因工程構建 方式獲得。
[0052] 上述轉化體宿主可W使任何適合表達CPC酷化酶的微生物，包括細菌和真菌。優(yōu)選 微生物是枯草芽抱桿菌、畢赤酵母、釀酒酵母、或者大腸桿菌，優(yōu)選大腸桿菌，更優(yōu)選大腸桿 菌化21(DE3)。
[0053] 當作為生物催化劑用于生產(chǎn)7-ACA時，本發(fā)明的CPC酷化酶可W呈現(xiàn)酶的形式或者 菌體的形式。所述酶的形式包括游離酶、固定化酶，包括純化酶、粗酶、發(fā)酵液、載體固定的 酶等;所述菌體的形式包括存活菌體和死亡菌體。
[0054] 本發(fā)明的CPC酷化酶分離純化、包括固定化酶制備技術也是本領域技術人員所熟 知的。
[00巧]實施例
[0056]本文中的全基因合成、引物合成及測序委托蘇州金唯智公司完成。
[0化7] 實施例1野生型CPC酷化酶基因重組大腸桿菌的構建
[0化引對于Pseudomonas SP.GK16來源的CPC酷化酶，W其已經(jīng)公布的基因序列SEQ ID NO: 2 為基礎(Matsuda et.al.，J.Bacteriol. 163:1222-1228,1985)，全基因合成基因序列， 并在基因兩端設計限制性內切酶位點Ndel和趾01，亞克隆到載體pET24a(Novagen)的相應 位點，獲得重組質粒祀T24a-wt-CPC，轉化表達宿主大腸桿菌化2UDE3)，得到野生型CPC酷 化酶的重組大腸桿菌。
[0059] 實施例2易錯PCR法構建隨機突變點庫及篩選
[0060] 2.1易錯PCR法構建隨機突變點庫
[0061] WCPC酷化酶野生型基因 SEQ ID ^:2為模板，應用易錯?〔3技術構建隨機突變體 庫。正向引物CPC-Nde-F為5 ' -CATATGGAGCCGACCTCGAC-3 '，反向引物CPC-趾〇-R為5 ' - CTCGAGTGGCTTGAAGTTGAAG-3，
[0062] 50化易錯PCR反應體系包括：50ng質粒模板祀T24a-wt-CPC，30pmol-對引物CPC- Nde-F和CPC-趾〇-R，lX Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，lmM dCTP，lmM dTTP，7mM MgCl2，（0mM、0.05mM、0. lmM、0.15mM、0.2mM)MnCl2，2.5個單位的Taq酶（fermen化s) JCR反應 條件為：95°C 5min;94°C 30s，55°C 30s，72°C 2minAbp;30個循環(huán)；72°C lOmin。膠回收 2.0化隨機突變片段作為大引物，用KOD-plus DM聚合酶做MegaPrimer PCR:94°C 5min，； 98°(3 103,60°〇303,68°〇2111111/此口，25個循環(huán);68°(3 10111111。化111消化質粒模板，電轉化大 腸桿菌E.coli化21(DE3)，得到超過ΙΟ4個克隆的隨機突變庫。
[0063] 2.2突變體庫的高通量篩選