一種頭孢菌素c?；D(zhuǎn)移酶的純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種從發(fā)酵液中純化頭孢菌素 C?；D(zhuǎn)移酶 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 7_氨基頭抱燒酸(簡(jiǎn)稱(chēng)7-ACA)，是頭抱菌素合成中最常用、最重要的母核。7-ACA 生產(chǎn)工藝主要有化學(xué)法和酶法兩種?；瘜W(xué)法主要包括酰氯法和混酐法，需要經(jīng)過(guò)活化、縮 合、保護(hù)和去保護(hù)等繁瑣的過(guò)程，存在合成路線程長(zhǎng)、步驟多、反應(yīng)條件苛刻、產(chǎn)生大量的三 廢等諸多弊端。相較化學(xué)法，酶法合成工藝具有許多優(yōu)點(diǎn)，如：生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、周期短、反應(yīng) 條件溫和、PH接近中性，另外，由于反應(yīng)具有高度的區(qū)域和立體選擇性，無(wú)需保護(hù)和去保護(hù) 過(guò)程，從而割除了化學(xué)合成中所需的毒害物質(zhì)，勞動(dòng)環(huán)境得到改善，減少了三廢的排放。
[0003] 酶法合成7-ACA，因?yàn)槭褂玫拿覆煌?，又分為兩步法和一步法。利?-ACA f氨 基酸氧化酶和GL-7-ACA?；傅膬刹矫阜?，從頭孢菌素 C到7-ACA的轉(zhuǎn)化率較低，且 7-ACA A氨基酸氧化酶催化反應(yīng)難以控制。一步酶法利用頭孢菌素 C?；D(zhuǎn)移酶，不經(jīng)過(guò) GL-7-ACA等中間體，直接將頭孢菌素 C轉(zhuǎn)變到7-ACA。一步酶法的轉(zhuǎn)化率與化學(xué)法相當(dāng)，而 且得到較高質(zhì)量的7-ACA。因?yàn)榫哂猩鲜鰞?yōu)勢(shì)，一步酶法逐步成為研發(fā)和應(yīng)用的熱點(diǎn)。
[0004] 如果頭孢菌素 C酰基轉(zhuǎn)移酶純度不夠，用于生產(chǎn)7-ACA時(shí)，其中的雜酶會(huì)參與酶裂 解作用，產(chǎn)生與7-ACA理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)相似的雜質(zhì)，如D-7ACA、D0-7ACA、GL-7ACA等。這些 雜質(zhì)因?yàn)榕c7-ACA的高度相似性，難以分離，從而影響7-ACA的質(zhì)量；同時(shí)企業(yè)的生產(chǎn)成本 也因?yàn)榉蛛x提純而增加。因?yàn)橐徊矫阜▽?duì)頭孢菌素 C酰基轉(zhuǎn)移酶的高度依賴(lài)，使得高品質(zhì) 的頭孢菌素 C?；D(zhuǎn)移酶成為制約7-ACA生產(chǎn)的關(guān)鍵因素。目前頭孢菌素 C酰基轉(zhuǎn)移酶還 沒(méi)有實(shí)現(xiàn)國(guó)產(chǎn)化，幾乎全部依賴(lài)進(jìn)口。韓國(guó)立科公司的頭孢菌素 C?；D(zhuǎn)移酶占據(jù)了中國(guó) 市場(chǎng)的90%以上，另外國(guó)際上，德國(guó)Sandoz的頭孢菌素 C?；D(zhuǎn)移酶也占據(jù)主流市場(chǎng)。所 以，優(yōu)質(zhì)、價(jià)廉的國(guó)產(chǎn)頭孢菌素 C?；D(zhuǎn)移酶的工業(yè)化批量生產(chǎn)迫在眉睫。
[0005] 頭孢菌素 C?；D(zhuǎn)移酶大部分是通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生的，從發(fā)酵液中提取頭孢菌素 C酰 基轉(zhuǎn)移酶工藝復(fù)雜，現(xiàn)在的技術(shù)大多在分離步驟中或早或晚的使用樹(shù)脂層析法。如公開(kāi)號(hào) CN1641019A(公開(kāi)日2005年7月20日）的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)"頭孢菌素 C?；D(zhuǎn)移酶"， 公開(kāi)了使用亞氨基二乙酸基的螯合樹(shù)脂柱。其中，說(shuō)明書(shū)實(shí)施例2中記載，投入90U的頭孢 菌素 C酰基轉(zhuǎn)移酶，回收72U，回收率為80%，頭孢菌素 C?；D(zhuǎn)移酶成品的活性為12U/ml， 比活性為6. 5U/mg。公開(kāi)號(hào)CN1085252A (公開(kāi)日1994年4月13日）的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)， 公開(kāi)了利用高效液體色譜柱：Tsk_gel ? DEAE-Toyopearl_5PW(Toso Co.，Ltd·, Japan) 純化頭孢菌素 C?；D(zhuǎn)移酶，成品純度95%。US 5320948也記載了使用DEAE-Toyopearl 650H (Toso Co.，Ltd·，Japan) (15X15 cm)分離提純一種新的頭孢菌素 C酰基轉(zhuǎn)移酶 的方法。公開(kāi)號(hào)CN1836044A (公開(kāi)日2006年9月20日）的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)則公開(kāi)了使 用DEAE-瓊脂糖陰離子交換柱（5X 18. 5cm)和Phenyl- Toyoperl柱。
[0006] 以柱層析為主要手段的頭孢菌素 C?；D(zhuǎn)移酶純化方法，需要用到大量的洗脫 液，操作復(fù)雜；洗脫過(guò)程繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)；并且柱的體積和載樣量等嚴(yán)重的限制了產(chǎn)量的 提高。因此，柱層析法在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用受到限制。
[0007] 因此，有必要開(kāi)發(fā)出一種產(chǎn)品純度高、生產(chǎn)操作簡(jiǎn)單便捷、適用于工業(yè)生產(chǎn)的頭孢 菌素 C?；D(zhuǎn)移酶的純化方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種新的頭孢菌素 C?；D(zhuǎn)移酶的純化方法。該方 法用鹽析法替代柱層析法，不僅操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期短、成本低。而且產(chǎn)品的純度高；從而可 以大幅度提高我國(guó)高品質(zhì)頭孢菌素 C?；D(zhuǎn)移酶的產(chǎn)能，滿足國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的需求。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下的技術(shù)方案： 發(fā)明人通過(guò)精密調(diào)節(jié)鹽析法中所使用鹽種類(lèi)、使用量以及溫度等條件，能夠獲得高純 度的頭孢菌素 C?；浮?br>[0010] 本發(fā)明的另一目的是提供了一種新的頭孢菌素 C?；傅奶釤挿椒ǎ涮卣髟谟?該方法獲得的頭孢菌素 C?；讣兌雀哂?7%。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)證明，【背景技術(shù)】中所提到韓國(guó)立科 和德國(guó)Sandoz所生產(chǎn)的頭孢菌素 C酰基酶進(jìn)行一步酶生產(chǎn)7-ACA，含有D0-7ACA雜質(zhì)；而 本發(fā)明所公開(kāi)的方法提純而得的頭孢菌素 C?；高M(jìn)行一步酶生產(chǎn)7-ACA，不含有D0-7ACA 雜質(zhì)。
[0011] 本發(fā)明的技術(shù)方案是： 一種頭孢菌素 C酰基轉(zhuǎn)移酶的純化方法，包括以下步驟：頭孢菌素 C?；D(zhuǎn)移酶粗品溶 液，0~15°C下，加入硫酸銨，使硫酸銨濃度為I. 6~2. 4 mol/L，攪拌，鹽析，收集鹽析沉淀物。
[0012] 優(yōu)選的，硫酸銨在所述頭孢菌素 C?；D(zhuǎn)移酶粗品溶液的濃度為I. 8~2. 2mol/L ; 更優(yōu)選為2. 0mol/L〇
[0013] 優(yōu)選的，鹽析溫度為0~10°C ;更優(yōu)選為4°C。
[0014] 本發(fā)明所述頭孢菌素 C酰基轉(zhuǎn)移酶的純化方法，還包括所述鹽析沉淀物的純化； 具體操作為：鹽析沉淀物溶解于磷酸鹽溶液2,攪拌，收集沉淀物，即得。
[0015] 優(yōu)選的，所述磷酸鹽溶液2為磷酸氫二鉀溶液或磷酸二氫鉀溶液，所述磷酸鹽溶 液 2 濃度為 0· 005-0.1 mol/L。
[0016] 更優(yōu)選的，所述磷酸鹽溶液2為0. 02mol/L、pH=8. 0的磷酸氫二鉀溶液。
[0017] 還優(yōu)選的，上述磷酸鹽溶液2與所述鹽析沉淀物的重量比為4. 7:1~10. 3:1 ;更優(yōu) 選為 7. 5:1~10. 3:1 ;最優(yōu)選為 7. 5:1。
[0018] 本發(fā)明所述頭孢菌素 C?；D(zhuǎn)移酶的純化方法，所述頭孢菌素 C酰基轉(zhuǎn)移酶粗品 溶液通過(guò)破碎頭孢菌素 C?；D(zhuǎn)移酶發(fā)酵液的細(xì)胞獲得。
[0019] 優(yōu)選的，所述頭孢菌素 C?；D(zhuǎn)移酶粗品溶液具體通過(guò)如下操作制備： 0~15°C下將頭孢菌素 C?；D(zhuǎn)移酶發(fā)酵液離心，得到細(xì)胞沉淀物，向所述細(xì)胞沉淀物 中加入磷酸鹽溶液1，使細(xì)胞沉淀物重新懸浮，攪拌均勻，破碎細(xì)胞，去除菌渣，即得。
[0020] 優(yōu)選的，頭孢菌素 C?；D(zhuǎn)移酶發(fā)酵液在0~10°C下離心，更優(yōu)選為4°C。
[0021] 優(yōu)選的，所述磷酸鹽溶液1為磷酸氫二鉀溶液或磷酸二氫鉀溶液，所述磷酸鹽溶 液 1 濃度為 〇· 005-0.1 mol/L。
[0022] 更優(yōu)選的，所述磷酸鹽溶液1為0. 02mol/L、pH=8. 0的磷酸氫二鉀溶液。
[0023] 還優(yōu)選的，上述磷酸鹽溶液1與所述細(xì)胞沉淀物的重量比為4:1~6:1 ;更優(yōu)選為 5:1〇
[0024] 優(yōu)選的，采用高壓均質(zhì)機(jī)破碎細(xì)胞。
[0025] 優(yōu)選的，細(xì)胞破碎后，離心，上清液即為所述頭孢菌素 C?；D(zhuǎn)移酶粗品溶液。
[0026] 作為一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明提供一種頭孢菌素 C?；D(zhuǎn)移酶的純化方法， 所述方法包括如下步驟： 1) 將頭孢菌素 C?；赴l(fā)酵液降溫至0~10°C，離心，得到細(xì)胞沉淀物； 2) 向所述細(xì)胞沉淀物中加入0. 02mol/L、pH=8. 0