用于鑒別綠殼蛋雞基因型的引物組合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于鑒別綠殼蛋雞的引物組合物及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 分子標(biāo)記輔助選擇(MAS，markerassistedselection)是隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技 術(shù)的迅速發(fā)展而產(chǎn)生的新技術(shù)，它可以從分子水平上快速準確地分析個體的遺傳組成，從 而實現(xiàn)對基因型的直接選擇，進行分子育種。目前，MAS技術(shù)應(yīng)用主要集中在基因聚合（Gene pyramiding)、基因滲入（Genetransgression)、根據(jù)育種計劃構(gòu)建基因系等方面。在家禽 育種上，分子輔助標(biāo)記選擇運用的非常廣泛。如對羽速，脛長，及裸頸性狀的表型選擇非常 成功，而且廣泛應(yīng)用與生產(chǎn)，以相應(yīng)的快慢羽基因（Kk)，性連鎖矮小基因（dwarf，dw)及裸 頸基因作為分子標(biāo)記進行MAS的技術(shù)，在育種和生產(chǎn)中也逐漸得到應(yīng)用。
[0003] SLC01B3基因?qū)儆谟袡C陰離子轉(zhuǎn)運蛋白（organicanion-transporting polyp印tide)家族，能幫助膽鹽類物質(zhì)跨膜運輸至卵殼腺，卵殼腺上皮細胞將膽綠素 分泌至蛋殼中，使得蛋殼最終呈現(xiàn)綠色。DavidWragg和JoramM.Mwacharo等人通過 RT-PCR(real-timePCR)的檢測在美國和歐洲本地雞種Mapuchefowl的研宄上發(fā)現(xiàn) SLC01B3基因在母雞的輸卵管和殼腺部有過量的表達。他們通過全基因組相關(guān)聯(lián)分析 (GWAS)的方法發(fā)現(xiàn)雞3號染色體上EAV-HP的長末端重復(fù)序列轉(zhuǎn)插入到了雞1號染色體 SLC01B3基因和SLC01C1基因之間，這就是SLC01B3過量表達的原因。另一個候選基因 HM0X1，則未過量表達。由于SLC01B3基因SLC01C1之間存在EAV-HP插入序列促使SLC01B3 基因過量表達，從而產(chǎn)生綠殼蛋。綠殼蛋基因型（LS)相對非綠殼蛋基因型（CC)為顯性，所 以在母雞體細胞中只要包含一條SLC01B3基因的染色體單鏈就可以出現(xiàn)綠殼蛋的表型，而 如果公雞是雜合子，則理論上后代一半群體中含有非綠殼蛋基因型，而但在表型選育種無 法將這一部分剔除，從而選育精準度不高，所以有必要對進行分子標(biāo)記選擇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種用于鑒別綠殼蛋雞的引物組合物及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明中用于鑒別綠殼蛋雞及其基因型的引物組合物，包括2對引物 對，其中，1對引物對為SLC01B3基因插入EAV-HP序列引物，序列為：上游引物： 5'-ATCAGGAAGGTGTGAATGACTTG-3'，下游引物：5' -GGACGAGCGAACGGAGAC-3'，如 SEQIDNO. 1、2所示；另一對引物對為SLC01B3非插入序列引物，序列為：上游引物： 5' -ATCAGGAAGGTGTGAATGACTTG-3'，下游引物：5' -ACAGAAGTTATACTACCACACGAAT-3'，如SEQ IDNO. 1、3 所示。
[0006] 所述引物組合物可以應(yīng)用于鑒別綠殼蛋雞的基因型。
[0007] 應(yīng)用所述引物組合物鑒別綠殼蛋雞基因型的方法，包括如下步驟：以待測雞的 DNA基因組為模板，用權(quán)利要求1所述的引物進行PCR擴增，獲得PCR擴增產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物進 行瓊脂糖凝膠電泳，觀察電泳結(jié)果：若只得到209bp的條帶，則待測雞的SLC01B3基因基因 型為LS/LS顯性純合型；若只得到312bp的條帶，則待測雞的SLC01B3基因基因型為CC/CC 隱性純合型；若得到209bp和312bp的兩條帶，則待測雞的SLC01B3基因基因型為為LS/CC 雜合型。。
[0008] 其中，所述PCR擴增反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性5min;95°C變性30s，57°C退火30s， 72°C延伸30s，38個循環(huán)；之后，72°C延伸5min;反應(yīng)體系：25微升體系，2XPCRMasterMix 12. 5yL，上游引物（10yM) 1yL，下游引物 1 (10yM) 0. 5yL，下游引物 2 (10yM) 0. 5yL， DNA模板1yL，滅菌過的超純水9. 5yL。
[0009] 本發(fā)明還保護所述引物組合物在制備鑒別綠殼蛋雞及其基因型試劑盒中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明還包括含有權(quán)利要求1所述的引物組合物的試劑盒，及其在鑒別綠殼蛋雞 及其基因型中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明還包括一種用于鑒別綠殼蛋雞基因型的分子標(biāo)記，顯性SLC01B3基因分子 標(biāo)記的序列如SEQIDNO. 4所示，隱性SLC01B3基因分子標(biāo)記的序列如SEQIDNO. 6所示。 該分子標(biāo)記可用于鑒別綠殼蛋雞的基因型。
[0012] 根據(jù)Ensemble數(shù)據(jù)庫的信息，雞SLC01B3基因共20032bp，位于1號染色體的 65, 317, 306-65, 337, 388bp。SLC01B3基因SLC01C1之間存在EAV-HP插入序列，插入位點位 于雞1號染色體基因序列的65,319,447處。本發(fā)明通過設(shè)計合成3條引物用于多重PCR 擴增，擴增SLC01B3基因插入EAV-HP引物序列為序列1和序列2組成的引物組合物，擴增 SLC01B3非插入引物序列為序列1和序列3組成的引物組成物。可以通過檢測擴增產(chǎn)物來 鑒定待測雞的SLC01B3基因基因型。
【附圖說明】
[0013] 圖1 :SLC01B3基因插入EAV-HP測序圖；
[0014] 圖2 :SLC01B3基因非插入EAV-HP測序圖；
[0015] 圖3 :SLC01B3基因EAV-HP插入序列的三種基因型瓊脂糖電泳圖。
【具體實施方式】
[0016] 下面將結(jié)合本發(fā)明中的實施例和附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、 完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；?于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其 他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0017] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0018] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0019] 以包含SLC01B3基因的待測雞全基因組DNA為模板，設(shè)計特定的引物對以引物對 擴增雞SLC01B3基因EAV-HP插入片段序列，將擴增產(chǎn)物直接在1%的瓊脂糖凝膠電泳上進 行電泳，電泳完畢后采用凝膠成像系統(tǒng)拍照，判定個體基因型進行判定。具體實施方法：
[0020] (1)特定引物的設(shè)計：
[0021] 以NCBI公布的紅色原雞序列（NC_006093. 2)和文獻《EndogenousRetrovirus EAV-HPLinkedtoBlueEggPhenotypeinMapucheFowl》中公布序列做為參考，利用 Primer6. 0 設(shè)計PCR引物，
[0022] 其EAV-HP插入片段擴增序列為：
[0023] 上游引物：ATCAGGAAGGTGTGAATGACTTG，（序列表中的序列 1)
[0024] 下游引物：GGACGAGCGAACGGAGAC，（序列表中的序列2)。
[0025] 其擴增產(chǎn)物長度為209bp;
[0026] 非插入片段擴增序列為：
[0027] 上游引物：ATCAGGAAGGTGTGAATGACTTG，（序列表中的序列 1)
[0028] 下游引物：ACAGAAGTTATACTACCACACGAAT，（序列表中的序列 2)
[0029] 其擴增產(chǎn)物長度為312bp。
[0030] (2)雞樣本的采集：
[0031] 以2個雞品種/系作為檢測對象，其中綠殼蛋雞從江西引進，屬于培育品種，舊院 黑雞屬于地方品種。具體采集樣本見下表：
[0032] 表1試驗材料
[0033]
【主權(quán)項】
1. 用于鑒別綠殼蛋雞基因型的引物，其特征在于，包括2對引物對，其中，1對引物對為 SLCO1B3基因插入EAV-HP序列引物，序列為：上游引物：5'-ATCAGGAAGGTGTGAATGACTTG-3'， 下游引物：5' -GGACGAGCGAACGGAGAC-3'，如 SEQ ID NO. 1、2 所示；另一對引物對為 SLC01B3 非插入序列引物，序列為：上游引物：5' -ATCAGGAAGGTGTGAATGACTTG-3'，下游引物： 5' -ACAGAAGTTATACTACCACACGAAT-3'，如 SEQ ID NO. 1、3 所示。
2. 權(quán)利要求1所述的引物在鑒別綠殼蛋雞基因型中的應(yīng)用。
3. -種應(yīng)用權(quán)利要求1所述引物鑒別綠殼蛋雞基因型的方法，其特征在于，包括如下 步驟：以待測雞的DNA基因組為模板，用權(quán)利要求1所述的引物進行PCR擴增，獲得PCR擴 增產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察電泳結(jié)果：若只得到209bp的條帶，則待測雞 的SLC01B3基因基因型為LS/LS顯性純合型；若只得到312bp的條帶，則待測雞的SLC01B3 基因基因型為CC/CC隱性純合型；若得到209bp和312bp的兩條帶，則待測雞的SLC01B3基 因基因型為為LS/CC雜合型。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的鑒別綠殼蛋雞基因型的方法，其特征在于，所述PCR擴增 反應(yīng)條件為：95°〇預(yù)變性511^11;95°〇變性308,57°〇退火308,72°〇延伸308,38個循環(huán) ；之后，72°C延伸5min;反應(yīng)體系：25微升體系，2XPCR Master Mix 12.5yL，上游引物 (10 μΜ) 1 μ L，下游引物 1 (10 μΜ)0· 5 μ L，下游引物 2(10 μΜ)0· 5 μ L，DNA 模板 1 μ L，滅菌過 的超純水9. 5 μ L。
5. 權(quán)利要求1所述的引物在制備鑒別綠殼蛋雞基因型的試劑盒中的應(yīng)用。
6. 用于鑒別綠殼蛋雞基因型的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中含有權(quán)利要求1所 述的引物。
7. 權(quán)利要求6所述的試劑盒在鑒別綠殼蛋雞基因型中的應(yīng)用。
8. -種用于鑒別綠殼蛋雞基因型的分子標(biāo)記，其特征在于：顯性SLC01B3基因分子標(biāo) 記的序列如SEQ ID NO. 4所示，隱性SLC01B3基因分子標(biāo)記的序列如SEQ ID NO. 6所示。
9. 如權(quán)利要求8所述分子標(biāo)記在鑒別綠殼蛋雞基因型中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于鑒別綠殼蛋雞基因型的引物組合物及其應(yīng)用。該引物組合物包括2對引物對，其中，1對引物對為SLCO1B3基因插入EAV-HP序列引物，序列如SEQ ID NO.1、2所示；另一對引物對為SLCO1B3非插入序列引物，序列如SEQ ID NO.1、3所示。以待測雞的DNA基因組為模板，用所述引物對其進行PCR擴增，獲得PCR擴增產(chǎn)物，可以通過檢測擴增出的209bp和312bp條帶來鑒定待測雞是否產(chǎn)綠殼蛋，同時可以鑒定雞綠殼蛋基因型。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104830843
【申請?zhí)枴緾N201510194180
【發(fā)明人】趙小玲, 李思辰, 舒剛, 朱慶, 張露, 崔璨, 尹華東, 王彥, 劉凌斌, 竭航
【申請人】四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年4月22日