一種雞柔嫩艾美爾球蟲(chóng)微線(xiàn)蛋?2突變體EtMIC2?2119的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及基因工程和遺傳工程領(lǐng)域，提供了一種雞柔嫩艾美爾球蟲(chóng)微線(xiàn)蛋?2突變體EtMIC2?2119，該突變體是以野生型柔嫩艾美耳球蟲(chóng)SD?01的EtMIC2(GenBank:KC333870.1)為基礎(chǔ)蛋白質(zhì)進(jìn)行體外定向進(jìn)化，并建立基因突變庫(kù)，使用酵母表面展示蛋白突變庫(kù)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選以及動(dòng)物免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)等手段，篩選免疫原性以及免疫保護(hù)力顯著提高的變異蛋白質(zhì)最終獲得的，該突變體變異蛋白質(zhì)有11個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)；變異后的EtMIC2較天然EtMIC2免疫保護(hù)效果ACI提高約為25.06％，可作為疫苗在抵抗雞柔嫩艾美爾球蟲(chóng)感染等領(lǐng)域中應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種雞柔嫩艾美爾球蟲(chóng)微線(xiàn)蛋-2突變體EtM IC2-2119
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程和遺傳工程領(lǐng)域，提供了一種雞柔嫩艾美爾球蟲(chóng)微線(xiàn)蛋-2突 變體 EtMIC2-2119。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞球蟲(chóng)病是一類(lèi)由專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生的艾美耳球蟲(chóng)引起的腸道原蟲(chóng)疾病。據(jù)估計(jì)每 年全世界用于預(yù)防和治療球蟲(chóng)病成本會(huì)超過(guò)30億美元，中國(guó)每年約有30多億人民幣。目前 球蟲(chóng)病的防控主要依靠藥物與疫苗，隨著耐藥蟲(chóng)株的出現(xiàn)和針對(duì)抗球蟲(chóng)藥物的立法限制， 人們更加重視免疫預(yù)防。市場(chǎng)上的疫苗主要為多種雞艾美耳球蟲(chóng)活卵囊的混合，具有很好 的免疫保護(hù)效果，但是由于活疫苗存在安全問(wèn)題以及較高的生產(chǎn)成本，研究者們將更多的 精力用于以亞單位為基礎(chǔ)的新型分子疫苗的研制。
[0003] 新型分子疫苗研制依靠具有較好抗原性以及免疫原性的抗原，由于球蟲(chóng)復(fù)雜的抗 原結(jié)構(gòu)以及生活史，抗原鑒定的難度以及抗原免疫原性篩選的限制阻礙了亞單位疫苗研制 的進(jìn)展。研究者們也開(kāi)展了大量的研究來(lái)改善抗原的免疫保護(hù)效果，包括新佐劑的研制，益 生菌誘導(dǎo)的非特異性免疫等，但是這些都不能從根本上改善抗原的免疫原性。因此，如何獲 得一種高效的新疫苗成為亟待解決的問(wèn)題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種雞柔嫩艾美爾球蟲(chóng)微線(xiàn)蛋-2突變 體EtMIC2-2119及其編碼基因，該突變體是以野生型柔嫩艾美耳球蟲(chóng)SD-01的EtMIC2 (GenBank: KC333870.1)為基礎(chǔ)蛋白質(zhì)進(jìn)行體外定向進(jìn)化，并建立基因突變庫(kù)，使用酵母表 面展示蛋白突變庫(kù)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選以及動(dòng)物免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)等手段，篩選免疫原 性以及免疫保護(hù)力顯著提高的變異蛋白質(zhì)最終獲得的，該突變體變異蛋白質(zhì)有11個(gè)氨基酸 突變位點(diǎn)。變異后的EtMIC2-2119較天然EtMIC2免疫保護(hù)效果ACI提高約為25.06%，可作為 疫苗在抵抗雞柔嫩艾美爾球蟲(chóng)感染等領(lǐng)域中應(yīng)用。
[0005] 發(fā)明人在本發(fā)明中應(yīng)用的主要機(jī)理如下：
[0006] 定向進(jìn)化被廣泛用于蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，其中重要的應(yīng)用之一就是改善抗原的免疫 原性。關(guān)鍵氨基酸的改變對(duì)于抗原的免疫反應(yīng)和免疫識(shí)別有很大影響，比如可逆抑制宿主 的免疫反應(yīng)、影響T細(xì)胞的激活、改善蛋白質(zhì)免疫原性等，使用隨機(jī)突變構(gòu)建基因突變庫(kù)是 定向進(jìn)化常用的方法之一。
[0007] 而EtMIC家族蛋白質(zhì)在球蟲(chóng)移行、入侵宿主細(xì)胞以及胞內(nèi)生存方面有重要的作用， EtMIC2蛋白質(zhì)能夠在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的整個(gè)生活周期內(nèi)都表達(dá)，研究表明EtMIC2基因或者 蛋白質(zhì)能夠誘導(dǎo)部分免疫保護(hù)反應(yīng)，是很好的疫苗候選抗原。
[0008] 因此本發(fā)明的發(fā)明人使用隨機(jī)突變技術(shù)針對(duì)EtMIC2進(jìn)行定向進(jìn)化，建立基因突變 庫(kù)，使用酵母表面展示技術(shù)結(jié)合FACS以及動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)篩選目的變異蛋白質(zhì)，從而改 善EtMIC2蛋白質(zhì)的免疫原性，為抵抗雞柔嫩艾美爾球蟲(chóng)感染提供技術(shù)支持。
[0009] 本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：
[0010] 本發(fā)明首先根據(jù)GenBank公布的EtMIC2核苷酸序列（GenBank: KC333870 · 1)人工合 成天然EtMIC2序列，其核苷酸序列如Seq ID N0:3所示，將該EtMIC2核苷酸序列與pEASY-Tl 載體連接建模EtMIC2-Tl。
[0011] 發(fā)明人利用易錯(cuò)PCR擴(kuò)增上述EtMIC2-Tl并獲得突變體，之后建立基因突變庫(kù)，使 用酵母表面展示蛋白突變庫(kù)，而后應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選以及動(dòng)物免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)等手 段，篩選免疫原性以及免疫保護(hù)力顯著提高的變異蛋白質(zhì)，最終獲得了本發(fā)明所述的突變 體，命名為EtMIC2_2119，該突變體核苷酸序列如Seq ID No: 1所示，其編碼的氨基酸序列如 Seq ID N〇:2所示，通過(guò)與未突變EtMIC2比較，該突變體變異蛋白質(zhì)有11個(gè)氨基酸突變位 點(diǎn)，具體突變位置如下：
[0012] EtMIC2-2119與EtMIC2相比差異氨基酸及其位點(diǎn)
[0014] 發(fā)明人在獲得上述突變體之后，對(duì)其進(jìn)行了免疫保護(hù)效果驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比于 未突變的EtMIC2蛋白質(zhì)，突變體EtMIC2-2119蛋白質(zhì)免疫組體重增長(zhǎng)顯著；突變體EtMIC2-2119蛋白質(zhì)免疫組的盲腸平均病變計(jì)分要顯著低于未突變EtMIC2免疫組；突變體EtMIC2-2119蛋白質(zhì)免疫組在克糞便卵囊數(shù)方面與天然蛋白EtMIC2相比，卵囊排出量雖有所減少， 但沒(méi)有表現(xiàn)出明顯差異；突變體EtMIC2-2119蛋白質(zhì)免疫組的ACI為172.48，比未突變 EtMIC2蛋白免疫組高約25.06 %，具有良好的抗球蟲(chóng)效果，可見(jiàn)本發(fā)明所提供的突變體 EtMIC2-2119可作為疫苗在抵抗雞柔嫩艾美爾球蟲(chóng)感染等領(lǐng)域中應(yīng)用。
[0015] 綜上所述，本發(fā)明獲得了一種全新的雞柔嫩艾美爾球蟲(chóng)微線(xiàn)蛋-2突變體EtMIC2-2119,該突變體較之為突變體免疫保護(hù)效果ACI提高約為25.06%，可作為疫苗在抵抗雞柔 嫩艾美爾球蟲(chóng)感染等領(lǐng)域中應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1為酵母表面展示蛋白質(zhì)EtMIC2以及突變EtMIC2蛋白質(zhì)SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果灰度 圖，
[0017] 圖中Μ為Marker; 1為EBY100陰性對(duì)照；2為EtMIC2蛋白質(zhì)；3為EtMIC2-2119變異蛋 白質(zhì)；
[0018] 圖2為酵母表面展示蛋白質(zhì)EtMIC2以及突變EtMIC2蛋白質(zhì)Western blot檢測(cè)結(jié)果 灰度圖，
[0019] 圖中Μ為Marker;l為EtMIC2蛋白質(zhì)；2為EtMIC2-2119變異蛋白質(zhì)；
[0020]圖3為流式細(xì)胞儀分選展示有EtMIC2蛋白的酵母細(xì)胞示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]試驗(yàn)材料和試劑
[0022] 1、菌株、載體:本發(fā)明所涉及的各種菌株均為常規(guī)菌株，可從市場(chǎng)上直接夠得;所 采用的克隆載體pEASY-ΤΙ購(gòu)自全式金公司；表達(dá)載體pET-30a( + )，采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)獲 得或購(gòu)買(mǎi)。
[0023] 2、主要試劑與藥品：rTaq酶、dNTPs、DNA Marker、Protein Marker、PCR產(chǎn)物純化試 劑盒、DNA膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性?xún)?nèi)切 酶BamH I、Nhe I、Hindm和Sal I購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；T4DNA連接酶購(gòu)自 Fermentas ;FITC標(biāo)記羊抗鼠 IgG、HRP標(biāo)記羊抗鼠 IgG和IgA購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公 司；Quick Start?Bradford lx Dye Reagent購(gòu)自Bio-Rad公司；His·.Bind?Purificat ion Kit購(gòu)自Merck公司；完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑等購(gòu)自Sigma公司；二硫蘇糖醇 (DTT)購(gòu)自Sigma公司；酵母質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖匈?gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，其它 常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
[0024] 3、培養(yǎng)基的配制：
[0025] (1)LB液體培養(yǎng)基:使用電子天平稱(chēng)取酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化鈉 10g，溶 解于1L去離子水中，121°C高壓滅菌20min。
[0026] (2)固體LB培養(yǎng)基：按以上方法配制LB液體培養(yǎng)基100mL，加入1.5g瓊脂粉，121°C 高壓滅菌20min，冷卻后倒入培養(yǎng)皿中。
[0027] (3)固體LB/AMP (Kan)培養(yǎng)基:按以上方法配制LB液體培養(yǎng)基100mL，待溫度降至不 燙手時(shí)，加入l〇〇yL Amp(Kan)貯存液，混勻后，倒入培養(yǎng)皿中，冷卻后4°C保存。
[0028] (4)YPD液體培養(yǎng)基:使用電子天平稱(chēng)取酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，葡萄糖20g 溶解于1L去離子水中，121°C滅菌15min。
[0029] (5)固體YPD培養(yǎng)基:按以上方法配制Yro液體培養(yǎng)基100mL，加入1.5g瓊脂粉，121 °C高壓滅菌20min，冷卻后倒入培養(yǎng)皿中。
[0030] (6)SD-CAA液體培養(yǎng)基:使用電子天平稱(chēng)取酵母氮源6.7g，酸水解酪素 5g，葡萄糖 2〇g溶解于1L去離子水中，使用磁力攪拌器充分溶解，121°C高壓滅菌15min。
[0031] (7)固體SD-CAA培養(yǎng)基:將100ml SD-CAA液體培養(yǎng)基中加入1.5-2g瓊脂粉，高壓滅 菌后，傾入培養(yǎng)皿。
[0032] (8)SG-CAA液體培養(yǎng)基:使用電子天平稱(chēng)取無(wú)氨基酸無(wú)硫酸銨酵母氮源6.7g，酸水 解酪素5g溶解于1L去離子水中，使用磁力攪拌器充分溶解，121°C高壓滅菌15min，之后加入 20g的過(guò)濾除菌的半乳糖4°C保存。
[0033] 4、本實(shí)施例中未做詳細(xì)具體說(shuō)明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書(shū)中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 進(jìn)行。
[0034] 實(shí)施例1突變體EtMIC2-2119的獲得
[0035] 根本發(fā)明首先根據(jù)GenBank公布的EtMIC2核苷酸序列(GenBank:KC333870.1)人工 合成天然EtMIC2序列，所獲得的EtMIC2核苷酸序列，其核苷酸序列如Seq ID N〇:3所示，之 后將其與pEASY-Tl載體連接建模EtMIC2-Tl;以EtMIC2-Tl為模板，使用EtMIC2-951-F和 EtMIC2_951_R為引物，利用Divers ify PCR Random Mutagenes is Kit(Clontech,USA)進(jìn) 行易錯(cuò)PCR擴(kuò)增EtMIC2突變體獲得易錯(cuò)PCR產(chǎn)物;其中所用引物如表1所示：
[0036] 表1.所述突變體EtMIC2-2119特異性引物
[0038]實(shí)施例2所述突變體的制備
[0039]將實(shí)施例1中獲得的易錯(cuò)PCR產(chǎn)物在未純化的情況下，與pEASY-T 1載體連接后，轉(zhuǎn) 入Top 10感受態(tài)細(xì)胞，涂布氨芐LB瓊脂平板，于37°C溫箱中培養(yǎng)直至單克隆菌落增至107為 止，構(gòu)建EtMIC2基因突變庫(kù)；
[0040] 上述包含有基因突變文庫(kù)的重組質(zhì)粒以及pCTC0N2質(zhì)粒，使用Nhe I和Sal I進(jìn)行 雙酶切，將雙酶切的基因突變庫(kù)與PCTC0N2載體連接后轉(zhuǎn)染釀酒酵母EBY100 (購(gòu)自 Invitrogen)，得到重組菌株EBY100/EtMIC2，PCR鑒定陽(yáng)性菌落(設(shè)計(jì)所用引物如表2所示）； 取含有重組質(zhì)粒的菌株EBY100,涂布SD-CAA固體培養(yǎng)基上30°C溫箱中，培養(yǎng)48h，直至酵母 菌菌落為1〇 8個(gè)為止，構(gòu)建EtMIC2突變蛋白質(zhì)庫(kù)重組菌株EBY100/EtMIC2;
[0041] 表 2
[0043] 取含有重組質(zhì)粒的EBY100菌株按體積比1:100的比例接種于100mL的SD-CAA中，30 °C，220rpm培養(yǎng)約8h，至0D600約1.0左右停止培養(yǎng)，將菌體在無(wú)菌的條件下4°C，3000r/min， 離心5min，棄掉上清，使用無(wú)菌蒸餾水洗滌三次以徹底除去葡萄糖，3000r/min，離心5min， 使用新鮮配制的SG-CAA培養(yǎng)基100mL重懸菌體，并轉(zhuǎn)移至滅菌的三角瓶中，30°C，220rpm誘 導(dǎo)培養(yǎng)約12h;
[0044] 將誘導(dǎo)表達(dá)的酵母菌濃度調(diào)整為5xl07個(gè)/10yL，加入終濃度為100mM的DTT溶液，4 °(：作用過(guò)夜，期間不斷震蕩。將獲得的蛋白質(zhì)溶液加入到透析袋中，在4°C條件下使用PBS溶 液透析多次(每次2h)除去DTT，10,000rpm，離心lmin，吸取上清，使用SDS-PAGE及Western blot分析表達(dá)情況，結(jié)果顯示在50kDa左右出現(xiàn)陽(yáng)性條帶(如圖1和2所示）；
[0045] 取上述誘導(dǎo)表達(dá)的酵母菌細(xì)胞，使用pH為7.2的PBS-BSA(lmg/mL)洗2遍，10，000r/ min，離心lmin，將菌體重懸于40yLl:200稀釋的兔源抗EtMIC2多抗(利用現(xiàn)有技術(shù)制備）中， 混勾，冰浴30min，使用pH為7.2的PBS_BSA( lmg/mL)洗2遍，10，000r/min，離心lmin，將菌體 重懸于50yLl: 75稀釋的FITC標(biāo)記鼠抗兔IgG單抗，混勻，冰浴30min，使用pH為7.2的PBS-BSA (lmg/mL)洗2遍，10,000r/min，離心lmin，BD FACSAria Cel l-Sort ing System進(jìn)行無(wú)菌 篩選含有突變體菌株，以展示未突變EtMIC2蛋白質(zhì)與兔源抗EtMIC2多抗血清親和力的不同 為對(duì)照，圈定熒光信號(hào)較弱的門(mén)P2(占總細(xì)胞數(shù)的2.7 %，其熒光強(qiáng)度為：2757.18，代表與 EtMIC2多抗親和力較弱）（如圖3所示），經(jīng)過(guò)三次連續(xù)篩選后，涂布SD-CAA固體瓊脂平板，30 °C培養(yǎng)48h，收集酵母單菌落10株。
[0046]常規(guī)技術(shù)提取含有突變體基因的上述8株酵母菌pCTC0N2重組質(zhì)粒，以該質(zhì)粒為模 板，以表2所示的His-EtMIC2-F和His-EtMIC2-R為引物，使用PrimeSTAR DNA Polymerase (Takara)進(jìn)行PCR擴(kuò)增EtMIC2突變體基因，將上述PCR產(chǎn)物以及pET30a，使用BamH I和Hind ΙΠ 進(jìn)行雙酶切，連接后轉(zhuǎn)化BL21菌株獲得重組菌株BL21/EtMIC2-1130。陽(yáng)性克隆按1:100的 比例接種于含有卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，在37°C，220rpm的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)3h，至 0D600~0.6時(shí)，向各管中加入終濃度為ImM的IPTG溶液誘導(dǎo)表達(dá)4h，8，OOOrpm離心5min，收 集菌體，1 X結(jié)合緩沖液洗滌菌體2次，使用以每100mL培養(yǎng)基所得菌體加入4mL 1 X結(jié)合緩 沖液比例重懸菌體。經(jīng)超聲波破碎(功率300W，開(kāi)3sec，停6sec)后，16，000g離心20min收集 上清及沉淀，沉淀按每100mL培養(yǎng)物加5mL緩沖液比例，加入終濃度為8M尿素的1 X結(jié)合緩沖 液，徹底溶解包涵體，16，000g離心30分鐘再次收集上清，兩次收集上清混合，調(diào)pH為8.0，使 用0.45um濾膜過(guò)濾，用于His · Bind蛋白質(zhì)純化(根據(jù)His · Bind?Purificat ion Kit說(shuō)明 書(shū)進(jìn)行），獲得突變體蛋白，命名為EtMIC2_2119,其核苷酸序列如Seq ID N〇:l所示，其編碼 的氨基酸序列如Seq ID N〇:2所示，通過(guò)與未突變EtMIC2比較，該突變體蛋白質(zhì)有11個(gè)氨基 酸突變位點(diǎn)。
[0047] 根據(jù)Quick Start?Bradford lx Dye Reagent說(shuō)明書(shū)，使用0 · 125、0 · 25、0 · 5、 0.75、1.0、1.5和2. Omg/mL的BSA標(biāo)準(zhǔn)品各5yL加入到含有250yL染料試劑的EP管中，充分混 勻，室溫作用5min，每個(gè)梯度做三個(gè)重復(fù);取待測(cè)蛋白質(zhì)樣品各5yL加入到含有250yL染料試 劑的EP管中，充分混勻，室溫作用5min，每個(gè)梯度做三個(gè)重復(fù)，將混合液加入到酶標(biāo)板的孔 中，使用酶標(biāo)儀測(cè)定0D595;繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)得出的公式計(jì)算突變體蛋白濃度為1.36mg/ mL〇
[0048] 實(shí)施例3突變體EtMIC2-2119免疫保護(hù)效果判定
[0049] 1日齡雛雞稱(chēng)重，剔除體重差別較大的雞只。共將100只雛雞分為4組，分別為PBS-I (不免疫不感染組），PBS-II(不免疫感染組），天然蛋白EtMIC2,突變體EtMIC2免疫組，每組 25只，在隔離罩中飼養(yǎng)。在7日齡時(shí)，各組雞只分別進(jìn)行皮下多點(diǎn)免疫弗氏完全佐劑乳化的 終濃度為〇. 5mg/mL的蛋白質(zhì)或roS 100yL，在14日齡時(shí)進(jìn)行加強(qiáng)免疫弗氏不完全佐劑乳化 的對(duì)應(yīng)終濃度為0.5mg/mL的蛋白質(zhì)或PBS lOOyLdI日齡雛雞除roS-I組外均口服接種30， 000個(gè)孢子化卵囊。依據(jù)免疫雞只體重增長(zhǎng)情況、盲腸病變計(jì)分、克糞便卵囊數(shù)(0PG)、抗球 蟲(chóng)指數(shù)(ACI)等指標(biāo)判定突變體蛋白免疫保護(hù)效果：
[0050] -、體重增長(zhǎng)情況測(cè)定:具體方法如下：
[0051] 21日齡(攻蟲(chóng)前）以及31日齡(攻蟲(chóng)后）時(shí)進(jìn)行逐羽稱(chēng)重，記錄稱(chēng)重結(jié)果，并計(jì)算平 均增重(平均增重(g) =31日齡平均體重(g)-21日齡平均體重(g))與相對(duì)增重量(相對(duì)增重 率（％ )=(感染組的增重/不感染不免疫組的增重）X 100% )。結(jié)果表明：與PBS-II組相比， 免疫天然蛋白EtMIC2組與突變體EtMIC2-2119組體重增長(zhǎng)顯著，相比于未突變的EtMIC2蛋 白質(zhì)組，突變體EtMIC2-2119組體重增長(zhǎng)顯著。
[0052]二、盲腸病變計(jì)分測(cè)定:具體方法如下：
[0053] 根據(jù)Johnson和Reid(1970)5分制原則，在感染球蟲(chóng)后5d，每組剖殺6只雞，取盲腸 首先觀察外觀出血點(diǎn)，腫脹情況，然后縱向剖開(kāi)盲腸，觀察內(nèi)容物狀態(tài)，使用自來(lái)水清除掉 內(nèi)容物觀察盲腸內(nèi)壁的出血情況，綜合這些病變進(jìn)行評(píng)定記分。結(jié)果表明：與PBS-II組相比 EtMIC2，EtMIC2-2119免疫組盲腸平均病變計(jì)分顯著降低，且突變體EtMIC2-2119組的盲腸 平均病變計(jì)分要顯著低于未突變EtMIC2免疫組。
[0054]三、克糞便卵囊數(shù)(0PG):具體方法如下：
[0055] 攻蟲(chóng)后第5d至第lOd開(kāi)始每天分別收集各組糞便，混勻后4°C保存。每組各取lg，加 入10mL自來(lái)水進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)?jīng)充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，使?00目濾網(wǎng)研磨并過(guò)濾除去大的糞便 顆粒。取充分混勻的濾液l〇yL滴與載玻片上，在低倍鏡下記數(shù)10yL稀釋液中球蟲(chóng)卵囊總數(shù)， 根據(jù)公式(〇PG =球蟲(chóng)卵囊總數(shù)X104)計(jì)算0PG和保護(hù)率。結(jié)果表明：與PBS-II組相比，蛋白 質(zhì)EtMIC2，EtMIC2-2119免疫組卵囊排出量均顯著降低，但變異蛋白質(zhì)EtMIC2-2119組在克 糞便卵囊數(shù)方面與天然蛋白EtMIC2組相比，卵囊數(shù)降低差異不顯著。
[0056] 四、計(jì)算抗球蟲(chóng)指數(shù)(ACI):具體方法如下：
[0057] 按美國(guó)Merck公司公式:ACI = (存活率+相對(duì)增重率）X100 -（病變值+卵囊值）。根 據(jù)ACI來(lái)判定抗球蟲(chóng)的療效;ACI蘭120為無(wú)效，120〈ACI蘭160為中等有效，160〈ACI蘭180為 良好，ACI>I80為優(yōu)秀。結(jié)果顯示：未突變EtMIC2蛋白質(zhì)免疫組的ACI為137.92，具有中等的 抗球蟲(chóng)保護(hù)效果，突變體EtMIC2-2119蛋白質(zhì)免疫組的ACI為172.48，比未突變EtMIC2蛋白 免疫組高約25.06%，具有良好的抗球蟲(chóng)效果。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種雞柔嫩艾美爾球蟲(chóng)微線(xiàn)蛋-2突變體，其特征在于，該突變體命名為EtMIC2-2119,其核苷酸序列如Seq ID No:l所示，其編碼的氨基酸序列如Seq ID No:2所示。2. 權(quán)利要求1所述雞柔嫩艾美爾球蟲(chóng)微線(xiàn)蛋-2突變體作為疫苗在抵抗雞柔嫩艾美爾球 蟲(chóng)感染上的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K39/012GK106046136SQ201610390480
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月3日
【發(fā)明人】趙孝民, 陳正濤, 韓林臻, 李宏梅, 王方昆
【申請(qǐng)人】山東農(nóng)業(yè)大學(xué)