本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及基于熒光pcr檢測技術(shù)，具體涉及一種基于熒光pcr檢測esr1基因突變的引物及探針。

背景技術(shù)：

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占中國女性惡性腫瘤之首。隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活方式的改變，發(fā)病率也呈現(xiàn)快速上升的趨勢。由于民眾篩查意識的提高及診療水平的提高，乳腺癌患者的總體死亡率呈下降趨勢。然而，對于耐藥復(fù)發(fā)和有轉(zhuǎn)移病灶的晚期乳腺癌患者預(yù)后仍然很差，也是目前女性腫瘤的主要死亡原因之一。

人類雌激素受體α(estrogenreceptoralpha,esrα)由esr1(estrogenreceptor1)基因編碼。esrα與其配體雌激素結(jié)合后，可激活細(xì)胞內(nèi)一系列的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。esr1基因的突變和異常表達(dá)均與乳腺癌等疾病的發(fā)生有關(guān)。

esr1基因最為常見的突變類型為y537s,y537c,y537n以及y538g四種突變。這些突變將esr1轉(zhuǎn)換為了促癌基因，他們將er鎖定在一種永久激活的狀態(tài)，因此無需激素就可以趨勢腫瘤細(xì)胞生長。這就解釋了這些腫瘤會(huì)對芳香酶抑制劑產(chǎn)生耐藥的原因。

目前已報(bào)道的應(yīng)用于esr1檢測的方法主要為：直接測序法及二代測序技術(shù)。其中，直接測序技術(shù)成本低，準(zhǔn)確性高，但是操作復(fù)雜，需要pcr后處理等步驟，易污染導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性的結(jié)果,而且此方法的靈敏度不足，需要基因豐度達(dá)到10％時(shí)才能精確檢出，故很難在臨床中進(jìn)行推廣。二代測序技術(shù)靈敏度高，但是需要昂貴的儀器及分析設(shè)備，導(dǎo)致其檢測成本大大提高，難以作為普適技術(shù)。綜上所述，不論是：直接測序法還是二代測序技術(shù)在檢測成本和檢測精度上存在不足，需要進(jìn)一步改進(jìn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服傳統(tǒng)檢測技術(shù)的缺陷，本發(fā)提供了一種基于熒光pcr檢測esr1基因突變的引物及探針，通過設(shè)計(jì)等位基因特異性引物，在一個(gè)反應(yīng)中檢測esr1基因突變。本發(fā)明具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，操作簡單快速等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明具體如下：

一種基于熒光pcr檢測esr1基因突變的引物及探針，包含下列4組下游引物、1組通用上游引物和1組共用阻斷探針，具體為：

(1)針對esr1基因y537s突變的下游引物：y537s1、y537s2和/或y537s3，具體為：

y537s1：5’-tctccagcagcaggttag-3’

y537s2：5’-tctccagcagcaggtaag-3’

y537s3：5’-ctccagcagcaggtctg-3’；

(2)針對esr1基因y537c突變的下游引物：y537c1、y537c2、y537c3和/或y537c4，具體為：

y537c1：5’-ctccagcagcaggtctc-3’

y537c2：5’-tctccagcagcaggttac-3’

y537c3：5’-ctccagcagcaggtgac-3’

y537c4：5’-tctccagcagcaggtttc-3’；

(3)針對esr1基因y537n突變的下游引物：y537n1、y537n2、y537n3和/或y537n4，具體為：

y537n1：5’-tccagcagcaggtcaat-3’

y537n2：5’-tccagcagcaggtcact-3’

y537n3：5’-ctccagcagcaggtcttt-3’

y537n4：5’-ccagcagcaggtcgtt-3’

(4)針對esr1基因y538g突變的下游引物：y538g1、y538g2、y538g3和/或y538g4，具體為：

y538g1：5’-catctccagcagcagcc-3’

y538g2：5’-catctccagcagcacgc-3’

y538g3：5’-catctccagcagcaccc-3’

y538g4：5’-gcatctccagcagcagcc-3’；

(5)針對esr1基因y537s,y537c,y537n以及y538g突變的通用上游引物fp1、fp2、fp3、fp4和/或fp5，序列如下：

fp1：5’-tagtcctttctgtgtcttccca-3’

fp2：5’-ggctcgggttggctctaa-3’

fp3：5’-agtaacaaaggcatggagca-3’

fp4：5’-ttccccttctagggatttcagcact-3’

fp5：5’-actcctggggctcgggttggc-3’；

(6)針對esr1基因y537s,y537c,y537n以及y538g突變的共用阻斷探針，該阻斷探針的序列及修飾如下：

阻斷探針：5’-fam-aagtacgacatgtctacga-3’。

進(jìn)一步說，包括一對內(nèi)控引物及一條內(nèi)控引物探針；所述內(nèi)控引物由tbpfp和tbprp組成，其序列信息如下：

tbpfp(上游引物)：5’-actgcgggctctacttcatc-3’

tbprp(下游引物)：5’-agaccgtggcagggaaac-3’

內(nèi)控引物探針序列信息如下：

tbpprobe：5’-cattcatgccaactac-hbq1--3’。

進(jìn)一步說，針對esr1基因y537s,y537c,y537n以及y538g四種突變的下游引物為等位基因特異性引物。

本發(fā)明機(jī)理:

本發(fā)明結(jié)合等位特異性pcr技術(shù)(arms技術(shù))對現(xiàn)有引物及探針進(jìn)行改進(jìn)，采用本發(fā)明的產(chǎn)品能夠達(dá)到操作便捷、成本低的效果，而且本發(fā)明的靈敏度也大大提高了檢測，從而可以達(dá)到快速準(zhǔn)確檢測基因突變的目的。

等位基因特異性pcr(allele-specificpcr),也稱為arms(amplificationrefractorymutationsystem)技術(shù)，是一種利用序列特異性引物對模板進(jìn)行選擇性擴(kuò)增而達(dá)到檢測基因突變的方法。其核心原理是根據(jù)pcr過程中dna聚合酶引導(dǎo)的引物延伸從、引物的3’末端開始，而引物3’末端的堿基與模板的互補(bǔ)配對程度強(qiáng)烈影響聚合酶的識別作用和pcr反應(yīng)的進(jìn)行：若這個(gè)堿基與模板正?；パa(bǔ)配對(a-t，g-c)，則引物可以不間斷延伸，pcr得以高效進(jìn)行，得到完整的產(chǎn)物；反之，若這個(gè)堿基與模板非正常配對，則引物的延伸受到阻滯，pcr效率大大降低。

故將與突變位點(diǎn)對應(yīng)的堿基放置在引物的3'末端，同時(shí)在必要時(shí)人為引入其他堿基的錯(cuò)位配對，便可以達(dá)到選擇性擴(kuò)增某種等位基因的作用。從而達(dá)到快速準(zhǔn)確檢測基因突變的目的。

本發(fā)明技術(shù)方案帶來的有益效果

(1)靈敏度高：在本發(fā)明中，esr1突變基因在25ng背景基因下的最低檢出限為0.1％，相較于傳統(tǒng)的技術(shù)的1.0％檢出限，大大提高了檢測的靈敏度(提高了一個(gè)數(shù)量級)。

(2)適用范圍廣：基于設(shè)計(jì)中pcr反應(yīng)的特點(diǎn)，本發(fā)明可以適用于石蠟包埋組織樣本，血漿樣本等。

(3)特異性強(qiáng)：在本發(fā)明中，針對esr1基因y537s,y537c,y537n以及y538g四種突變設(shè)計(jì)的特異性引物具有很高的位點(diǎn)特異性，保證了檢測的準(zhǔn)確性，避免了假陽性的產(chǎn)生。

(4)操作簡單，實(shí)驗(yàn)時(shí)間短。閉管反應(yīng)，減少了污染的機(jī)率。

綜上所述，本發(fā)明在產(chǎn)品價(jià)格比現(xiàn)有的測序方法低的同時(shí)，檢出限靈敏度比現(xiàn)有產(chǎn)品高出一個(gè)數(shù)量級，且適用范圍寬。

附圖說明

圖1本發(fā)明試劑盒對血液樣本突變檢測結(jié)果，樣本中有突變(fam通道有信號)。

圖2本發(fā)明試劑盒對血液樣本內(nèi)控檢測結(jié)果。

圖3是采用本發(fā)明的實(shí)施例1的試驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)通過實(shí)施例詳細(xì)闡述本發(fā)明的技術(shù)特點(diǎn)。

實(shí)施例1

1.esr1引物序列：

針對于esr1基因y537s,y537c,y537n以及y538g四種突變采用如下8組等位基因特異性引物，作為下游引物，序列如下：

y537s1：5’-tctccagcagcaggttag-3’

y537s2：5’-tctccagcagcaggtaag-3’

y537c1：5’-ctccagcagcaggtctc-3’

y537c2：5’-tctccagcagcaggttac-3’

y537n1：5’-tccagcagcaggtcaat-3’

y537n2：5’-tccagcagcaggtcact-3’

y538g1：5’-catctccagcagcagcc-3’

y538g2：5’-catctccagcagcacgc-3’

針對四種突變采用如下2組上游引物，序列如下：

fp1：5’-tagtcctttctgtgtcttccca-3’

fp5：5’-actcctggggctcgggttggc-3’

針對四種突變設(shè)計(jì)一條共用的阻斷探針，其序列及修飾如下：阻斷探

針：5’-fam-aagtacgacatgtctacga-3’

同時(shí)設(shè)計(jì)一對內(nèi)控引物，及一條探針，其序列信息如下：

tbpfp(上游引物)：5’-actgcgggctctacttcatc-3’

tbprp(下游引物)：5’-agaccgtggcagggaaac-3’

tbpprobe：5’-cattcatgccaactac-hbq1--3’。

將實(shí)施例1獲得的發(fā)明產(chǎn)物的運(yùn)用，具體如下：

臨床樣本基因組dna提取：本實(shí)例是從乳腺癌患者的血漿中提取dna，作為pcr檢測的模板。才用的是tiangen的血液基因組dna提取試劑盒。

1)向15ml離心管加入200ulproteinasek(20mg/ml)溶液。

2)加入0.5-3ml血液樣本，混勻。

3)向裝有血液樣本的離心管中加入2.4ml緩沖液ge，振蕩30sec混勻。

4)65℃放置10min，每隔3min振蕩一次，以助裂解。

5)向樣本中加入2ml的無水乙醇，混勻。

6)將所得溶液和絮狀沉淀的一半轉(zhuǎn)移至一個(gè)吸附柱cb5中，3000rpm離心3min，倒掉廢液，將吸附柱cb5放回收集管中。

7)將步驟6剩余的溶液再轉(zhuǎn)入同一吸附柱中，重復(fù)6的操作。

8)向吸附柱cb5中加入2ml緩沖液gd，5000rpm離心1min，倒掉廢液，將吸附柱cb5放回收集管中。

9)向吸附柱cb5中加入2ml緩沖液pw，5000rpm離心1min，倒掉廢液，將吸附柱cb5放回收集管中。

10)向吸附柱cb5中加入2ml緩沖液pw，5000rpm離心15min，丟棄收集管，將吸附柱cb5放到一個(gè)新的15ml離心管中。

11)向吸附膜的中間部位懸空滴加300ul洗脫緩沖液tb，室溫靜置5min，5000rpm離心2min，將溶液收集到離心管中。

紫外分光光度計(jì)測定樣本提取量及濃度，稀釋至10ng/ul待用。

儀器：

適用機(jī)型abi7500、宏石96p。

pcr反應(yīng)體系：

25ulpcr反應(yīng)體系中包含：y537s等位基因特異性下游引物200nm-500nm，y537c等位基因特異性下游引物200nm-450nm，y537n等位基因特異性下游引物200nm-450nm，d538g等位基因特異性下游引物200nm-450nm，通用上游引物(fp)200nm-450nm，阻斷探針100nm-300nm，以及內(nèi)控上游引物200nm-450nm，內(nèi)控下游引物200nm-450nm，tbp探針100nm-300nm，2×sybrgreenmix10-15ul，待測樣本10-50ng，ddh2o補(bǔ)足25ul。

pcr反應(yīng)程序：

95℃，2～10min，不循環(huán)；

95℃，5～16sec，60℃，40～60sec，采集熒光；共計(jì)45個(gè)循環(huán)；

結(jié)果判定：

將配置好的各反應(yīng)體系在熒光實(shí)時(shí)定量pcr儀器上進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)esr1基因與內(nèi)控基因的擴(kuò)增結(jié)果(ct值)，即fam通道和hex通道的擴(kuò)增情況來進(jìn)行結(jié)果的判定。對結(jié)果的判定有以下三種情況：

(1)樣本在fam通道和hex通道均有正常擴(kuò)增，則該樣本攜帶有esr1基因y537s,y537c,y537n或y538g四種突變中的一種或者幾種。

(2)樣本在fam通道沒有擴(kuò)增，在hex通道有正常擴(kuò)增，則該樣本未攜帶有esr1基因y537s,y537c,y537n以及y538g四種突變。

(3)樣本在fam通道和hex通道均沒有正常擴(kuò)增，則表明該樣本中dna量過差或者加入的dna量不足，需要重新檢測。圖1為采用本發(fā)明產(chǎn)品的試劑盒對血液樣本突變檢測結(jié)果，樣本中有突變(fam通道有信號)。圖2本發(fā)明試劑盒對血液樣本內(nèi)控檢測結(jié)果。

下面再以100例復(fù)發(fā)性乳腺癌樣本作為檢測對象，采用如實(shí)施例1的檢測方法，進(jìn)行試驗(yàn)：

1)按照上述反應(yīng)體系參數(shù)配置反應(yīng)溶液，分別加入各乳腺癌dna樣本50ng進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。

2)根據(jù)圖3所示，本發(fā)明對100例復(fù)發(fā)乳腺癌樣本dna進(jìn)行檢測，按樣本結(jié)果判定可以得出，共有5例樣本攜帶esr1突變，其余為esr1野生型。

實(shí)施例2

1.esr1引物序列：

針對于esr1基因y537s,y537c,y537n以及y538g四種突變采用如下的等位基因特異性引物作為下游引物，序列如下：

y537s1：5’-tctccagcagcaggttag-3’

y537s3：5’-ctccagcagcaggtctg-3’

y537c3：5’-ctccagcagcaggtgac-3’

y537c4：5’-tctccagcagcaggtttc-3’

y537n3：5’-ctccagcagcaggtcttt-3’

y537n4：5’-ccagcagcaggtcgtt-3’

y538g3：5’-catctccagcagcaccc-3’

y538g4：5’-gcatctccagcagcagcc-3’。

針對四種突變?nèi)缦碌?組公用的上游引物，序列如下：

fp2：5’-ggctcgggttggctctaa-3’

fp3：5’-agtaacaaaggcatggagca-3’

fp4：5’-ttccccttctagggatttcagcact-3’。

針對四種突變設(shè)計(jì)一條共用的阻斷探針，其序列及修飾如下：阻斷探針：5’-fam-aagtacgacatgtctacga-3’

同時(shí)設(shè)計(jì)一對內(nèi)控引物，及一條探針，其序列信息如下：

tbpfp(上游引物)：5’-actgcgggctctacttcatc-3’

tbprp(下游引物)：5’-agaccgtggcagggaaac-3’

tbpprobe：5’-cattcatgccaactac-hbq1--3’。

分別從100例病人的石蠟切片樣本、新鮮組織中提取dna用于檢測，其他檢測條件同實(shí)例1中的實(shí)驗(yàn)條件。結(jié)果顯示，石蠟切片樣本、新鮮組織中提取的dna均可用于檢測，結(jié)果與實(shí)例1相同，且差異不大。