紅木中降香黃檀的分子鑒定方法及其引物和探針的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及木材材種鑒定的分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，具體地說涉及對降香黃檀的分子鑒定方法及其所使用的引物和探針。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，由于紅木家具受到越來越多消費者的喜愛，促進了紅木家具制造業(yè)的繁榮，因此紅木木材的進口量也隨之逐年增加。但是，長期以來由于受利益驅(qū)使，紅木市場良莠不齊，摻假造假情況突出:一方面用較次的紅木冒充較好的紅木，另一方面用非紅木冒充紅木等。
[0003]降香黃墻XDalbergia odorifera T.Chen)是紅木國家標(biāo)準(zhǔn)(紅木GB/T18107-2000)規(guī)定的33種木材品種之一，屬豆科蝶形花亞科黃檀屬，是海南特有瀕危樹種，為國家二級保護植物。降香黃檀以樹干、根的干燥心材入藥，具行氣活血、止痢、止血功效，為國家藥典收載的名貴南藥之一。降香黃檀心材極耐腐，切面光，且香氣經(jīng)久不滅，被廣泛用于尚檔家具、工藝品等。
[0004]正是由于降香黃檀的珍惜名貴，它與普通木材在價格上存在巨大的差額，導(dǎo)致不法分子將一些容易混淆和不易區(qū)分的樹種和木材制品冒充降香黃檀進行銷售，極大地擾亂了市場秩序，給消費者帶來了巨大的經(jīng)濟損失。降香黃檀也常冒充普通木材進行運輸和走私，對正常進出口貿(mào)易照成很大影響。
[0005]傳統(tǒng)的紅木鑒定識別方法是利用人工經(jīng)驗進行識別，主要通過對木材截面進行人工觀察的方式完成。一般情況下依賴肉眼和放大鏡進行宏觀識別，而微觀識別則需要使用光學(xué)顯微鏡觀察其內(nèi)部的解剖結(jié)構(gòu)特征，也就是觀察構(gòu)成木材的各類細(xì)胞與組織的形態(tài)及排列特征，該方法涉及的識別特征較多，鑒定相對準(zhǔn)確，但對于鑒定工作者的要求很高，要對此做出準(zhǔn)確的鑒定，必須具有豐富的實踐經(jīng)驗。近年來研究工作者開發(fā)了基于數(shù)字圖像處理的木材圖像識別技術(shù)，大大提高了木材識別的準(zhǔn)確性，推動了木材識別技術(shù)的發(fā)展。但是，無論是基于識別者經(jīng)驗的傳統(tǒng)識別技術(shù)還是基于計算機圖像檢索的識別技術(shù)，都沒有脫離木材本身的形態(tài)結(jié)構(gòu)及特征，鑒定識別工作都必須建立在所檢木材有完整易辨識的形態(tài)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，這就為木材識別工作帶來了一定的局限性，同時，相近種屬木材易出現(xiàn)材質(zhì)結(jié)構(gòu)的相似，為木材識別的準(zhǔn)確性帶來困難。
[0006]目前對降香黃檀的鑒定依然采用傳統(tǒng)的木材鑒定手段，即解剖切片觀察木材的構(gòu)造以及形態(tài)特征從而得出判定結(jié)果。因此建立起以DNA基因信息為基礎(chǔ)的分子鑒定方法，實現(xiàn)降香黃檀的簡單、快速、準(zhǔn)確、客觀的鑒定是目前急需解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供一種用于降香黃檀的分子鑒定方法的引物和探針，所述引物和探針序列包括:
JXHT Primer-F:5’-ACGGTGGTTGAGCGTGTT-3’JXHT Primer-R:5’-CTAGGGGAATCCTCGTTAGTTT-3’
JXHT Primer Probe:5’-VIC-TCATGAGGGCGGCCT-MGB-3’ 。
[0008]進一步地，所述引物和探針的PCR反應(yīng)條件為:95°C，2min ;95°C 15s，55°C 34s，共40個循環(huán)。
[0009]進一步地，所述引物和探針的使用濃度比為:JXHT Primer-F: JXHTPrimer-R:JXHT Primer Probe=1:1:2。
[0010]本發(fā)明還提供了一種用于降香黃檀的分子鑒定的方法，包括如下步驟:
(1)木材樣本的預(yù)處理；
(2)提取經(jīng)(I)處理后的木材樣本中的DNA;
(3)利用引物JXHT Primer-F 和 JXHT Primer-R，以及探針 JXHT Primer Probe 對(2)中提取的DNA進行熒光PCR擴增；
(4)木材種類的確定；
所述引物和探針序列包括:
JXHT Primer-F:5’-ACGGTGGTTGAGCGTGTT-3’
JXHT Primer-R:5’-CTAGGGGAATCCTCGTTAGTTT-3'
JXHT Primer Probe:5’-VIC-TCATGAGGGCGGCCT-MGB-3’ 。
[0011]進一步地，所述的熒光PCR擴增條件為:95°C，2min ;95°C 15s，55°C 34s，共40個循環(huán)。
[0012]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點和效果:本發(fā)明通過一對特異性擴增引物及MGB探針對目的基因進行擴增，條件依賴少，一般的PCR實驗室設(shè)備即可滿足，對結(jié)果的分析非常直觀，不用比對復(fù)雜的測序圖譜，直接根據(jù)擴增曲線即可做出分析該位點基因型。本發(fā)明所采用的熒光定量PCR法檢測周期短，在三個小時內(nèi)即可得出結(jié)果，而且相對于DNA測序法來說檢測靈敏度大大提高，使用MGB探針還能極大地降低本底信號的干擾，還可以大大穩(wěn)定探針與模板的雜交，升高探針Tm值，使較短的探針同樣能達到較高的Tm值，允許采用更短的探針也簡化了探針的設(shè)計和成本，與此同時MGB探針對于等位基因的區(qū)分比較理想，具有非常好的準(zhǔn)確性和特異性。
[0013]本發(fā)明在對降香黃檀大量基因信息進行分析比較的基礎(chǔ)上，采用實時熒光PCR技術(shù)實現(xiàn)對降香黃檀分子水平上的鑒定。本發(fā)明并不需要木材有完整的形態(tài)結(jié)構(gòu)，只需從木料上取極少量木材樣本，即可滿足檢測要求，操作簡單。并且通過木材特有的DNA信息做出判斷，鑒定過程客觀、準(zhǔn)確?？朔藗鹘y(tǒng)鑒定方法主要依賴于形態(tài)鑒定方法，并必須建立在木材有完整易辨識的形態(tài)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上的技術(shù)局限性。本發(fā)明很好地滿足各相關(guān)部門對降香黃檀快速篩查和鑒定的要求，能有效杜絕降香黃檀制品的摻假造假行為，對于保護消費者權(quán)益，提高品牌價值，規(guī)范市場，促進物種資源的保護和利用具有重要的意義。
【附圖說明】
[0014]圖1是降香黃檀和15個對照組樹種DNA提取效果實驗。
[0015]圖2是本發(fā)明方法特異性實驗結(jié)果圖。
[0016]圖3是本發(fā)明方法靈敏度實驗結(jié)果圖。
[0017]圖4是針對經(jīng)不同處理方式得到的木材樣本的檢測結(jié)果圖。
[0018]圖5是木材不同部位樣本的檢測結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。但并不因此將本發(fā)明限制在所述的具體實施例中。實施例中未說明的條件和方法，按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒炄藛T常規(guī)采用方法:譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學(xué)實驗指南》第四版，或者按照商品說明書建議的步驟和條件。
實施例1檢測降香黃檀的引物、探針和檢測試劑盒
利用NCBI等資源信息，找出降香黃檀與其他木材的基因差異位點，篩選出一對特異性擴增引物對(JXHT Primer-F和JXHT Primer-R),并在該引物對的擴增區(qū)域設(shè)定了一條特異性的探針(JXHT Primer Probe)。所述擴增引物對和探針序列分別是:
JXHT Primer-F:5’-ACGGTGGTTGAGCGTGTT-3’
JXHT Primer-R:5’-CTAGGGGAATCCTCGTTAGTTT-3'
JXHT Primer Probe:5’-VIC-TCATGAGGGCGGCCT-MGB-3’
一種檢測降香黃檀的試劑盒，所述試劑盒包括樣品DNA抽提試劑、qPCR擴增反應(yīng)液、陽性對照品、陰性對照品和空白對照品。
[0020]其中所述qPCR擴增反應(yīng)體系為:20μ1的體系包括:
SYBR Prmix Taq II (2Χ )10μ1
ROX Referance Dye II (50Χ ) 0.4μ1 JXHT Primer Probe0.4μ1
JXHT Primer-F (20μΜ)0.2μ1
JXHT Primer-R (20μΜ)0.2μ1
DNA樣品模板8.8μ1
其中所述引物和探針序列分別為:
JXHT Primer-F:5’-ACGGTGGTTGAGCGTGTT-3’
JXHT Primer-R:5’-CTAGGGGAATCCTCGTTAGTTT-3'
JXHT Primer Probe:5’-VIC-TCATGAGGGCGGCCT-MGB-3’
陽性對照品:含有本發(fā)明所述的特異性擴增片段的質(zhì)粒溶液。
[0021]陰性對照品:不含本發(fā)明所述的特異性擴增片段的質(zhì)粒溶液。
[0022]空白對照品:2 μ I生理鹽水或不加任何物質(zhì)的ddH20。
實施例2:實時熒光PCR的鑒定方法
(I)木材樣本的預(yù)處理:
用75%的乙醇對木材表面進行徹底的消毒，經(jīng)無菌水沖洗并用擦干木材。切除待測木材表面部分以避免其他職務(wù)組織的污染。取一定量的木材樣本，在預(yù)冷的研缽中加入液氮和石英砂研磨成粉末備用。若不立即使用，樣品DN