一種煙草根黑腐病菌分子檢測引物及其快速檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及對煙草根黑腐病菌快速靈敏的分子檢 測，同時(shí)可用于煙草根黑腐病的早期診斷及病菌的檢測鑒定。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙草根黑腐病是由根串珠霉[Thielaviopsisbasicola(Berk.etBr.)]引起的煙 草生產(chǎn)上的一種重要土傳病害，它遍布世界主要產(chǎn)煙區(qū)，使煙草生產(chǎn)遭受重大損失。該病原 菌可侵染為害多種植物，如煙草、棉花、豆類、花生、柑桔及多種觀賞植物。煙草根黑腐病是 世界性的病害，在我國云南、貴州、湖北等省發(fā)生較重，嚴(yán)重地塊發(fā)病率可達(dá)30%以上。山 東、河南、安徽、吉林、福建等省也有發(fā)生，近年來該病在我國有加重為害的趨勢。煙草根黑 腐病主要發(fā)生于煙株根系上，使根呈特異性的黑色腐爛，從幼苗至成株期均可發(fā)病。苗染病 引起"猝倒"，但根部發(fā)黑，別于猝倒病。病菌從根莖部侵入，病斑環(huán)繞莖部一周，向上侵至于 葉，下侵至側(cè)根，使整株幼苗枯死。較大煙株染病側(cè)根、根尖變黑，病株生長遲緩，植株矮小， 葉色黃褐。重病株拔起可見整株根系變黑褐、壞死，病株葉片變黃、變薄，嚴(yán)重影響煙草產(chǎn)量 和質(zhì)量。病殘?bào)w和帶菌土壤是該病的初侵染源。條件適宜時(shí)分生孢子或厚垣孢子萌發(fā)產(chǎn)生 侵入絲由傷口侵入寄主表皮細(xì)胞，侵入后，菌絲在煙草表皮細(xì)胞間分枝蔓延，產(chǎn)生大量分生 孢子和厚垣孢子，進(jìn)行再侵染。該病發(fā)病適溫17~23°C，15°C以下或26°C以上發(fā)較輕。相 對濕度在80%以上時(shí)發(fā)病重。低溫多雨或連陰雨天容易造成流行。該病菌可侵染豆科、萌 蘆科等30科120多種植物，與這些科植物連作發(fā)病重。低洼下濕地、瘠薄鹽堿地易發(fā)病。
[0003] 由于根黑腐病為土傳病害，通常與其它煙草根莖部的病害混合發(fā)生，給病害的正 確診斷造成困難。根黑腐病菌危害煙草在肉眼能夠觀察到病癥之前稱為危害早期階段，在 根黑腐病病害發(fā)生的早期階段，不能顯現(xiàn)出根部發(fā)黑，病斑環(huán)繞莖部、側(cè)根、根尖變黑等煙 草根黑腐病病癥。通常根黑腐病菌危害煙草5-6天才能觀察到病癥，因此，在煙草根黑腐病 害發(fā)生的早期難以針對性地進(jìn)行有效防治，造成根黑腐病菌危害嚴(yán)重，引起較大的經(jīng)濟(jì)損 失。因此，建立煙草根黑腐病菌特異性的快速分子檢測體系，及早對發(fā)病植株或土壤中帶菌 病原菌快速準(zhǔn)確地進(jìn)行檢測，對于及時(shí)采取科學(xué)合理的防治措施控制病害的發(fā)生、流行，減 少病害造成的經(jīng)濟(jì)損失具有重要的指導(dǎo)意義。
[0004] 傳統(tǒng)用于對植物病原菌的檢測鑒定方法是首先利用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行病原菌的 分離培養(yǎng)，獲得純培養(yǎng)菌株以后，根據(jù)菌落特征、孢子形態(tài)大小等形態(tài)學(xué)特征、致病性測定、 生理生化特性等進(jìn)行鑒定。這些方法耗時(shí)費(fèi)力，程序繁瑣，且病原菌的分離鑒定經(jīng)驗(yàn)性很 強(qiáng)。已有研究表明，煙草根黑腐病菌不同菌株間的形態(tài)差異明顯，有些菌株可產(chǎn)生大量的扇 形白化菌株，有些白化菌株的單孢菌落可回復(fù)到野生型，鑒定時(shí)易受人為環(huán)境等諸多因素 的干擾。此外，由于不能直接從植物帶病組織中檢測出病原菌，難以滿足病害防治所需的快 速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測要求，很容易錯(cuò)過病害防治的最佳時(shí)期。
[0005] 近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)技術(shù)為代表 的分子檢測方法得到了迅速的發(fā)展和應(yīng)用?；诨蚪MDNA的PCR技術(shù)的快速發(fā)展有效地 彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分類鑒定方法的不足，其具有的特異性、靈敏性和快速性等特點(diǎn)成為植物病原 菌分類和鑒定應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一。由于PCR技術(shù)不需要對病原菌進(jìn)行分離純化即可對 植物病組織進(jìn)行快速檢測和診斷，因此可用于煙草根黑腐病顯癥前的早期診斷，為病害的 準(zhǔn)確鑒定和及時(shí)防治提供科學(xué)依據(jù)。
[0006]目前針對植物病原菌的PCR檢測技術(shù)絕大部分是基于核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (rDNA-ITS)序列開發(fā)的特異性引物。國內(nèi)外研究人員也對煙草根黑腐病菌的rDNA-ITS序 列開發(fā)了用于PCR技術(shù)的特異性擴(kuò)增引物。但是越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，在一些近緣種的病 原菌中，rDNA-ITS序列差異很小，以ITS為靶標(biāo)設(shè)計(jì)的引物難以將它們區(qū)分開，因此需要開 發(fā)一些新的基因進(jìn)行檢測。微管蛋白（Tubulin)是一類含有多個(gè)成員的蛋白質(zhì)家族。真核 生物微管蛋白家族最常見的成員是α-微管蛋白和β-微管蛋白，它們是組成微管的主要 成分。β-tubulin基因包含有多個(gè)外顯子和內(nèi)含子，多個(gè)外顯子具有保守性，而這些內(nèi)含子 在不同物種之間有較大的變異，適合于設(shè)計(jì)引物進(jìn)行分子檢測區(qū)分不同的物種。目前基于 β-tubulin基因開發(fā)對煙草根黑腐病菌的檢測技術(shù)在國內(nèi)外均未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為解決現(xiàn)有對煙草根黑腐病菌的早期診斷困難、靈敏度低，致使難以提出及時(shí)、準(zhǔn) 確防治科學(xué)依據(jù)，以及現(xiàn)有分子檢測中rDNA-ITS序列差異很小，以ITS為靶標(biāo)設(shè)計(jì)的引物 難以將一些近緣種的病原菌區(qū)分開的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種靈敏度高、能早期診斷出 煙草根黑腐病菌，特異性強(qiáng)的分子檢測引物及結(jié)果準(zhǔn)確、易于操作的煙草根黑腐病菌快速 分子檢測方法。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0009] 1. -種煙草根黑腐病菌分子檢測引物，其特征在于：所述煙草根黑腐病菌分子檢 測引物由上游引物Tbas-tubF和下游引物Tbas-tubR組成，所述上游引物Tbas-tubF的堿 基序列如SEQIDN0:1所示，所述下游引物Tbas-tubR的堿基序列如SEQIDN0:2所示，目 標(biāo)產(chǎn)物片段長度為254bp。
[0010] 2. -種煙草根黑腐病菌的快速檢測方法，其特征在于包括以下步驟：
[0011] (1)從待檢煙草植物組織中提取基因組DNA;
[0012] (2)以步驟（1)提取的基因組DNA為模板，用技術(shù)方案1所述的煙草根黑腐病菌分 子檢測引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0013] (3)取5~8μ1步驟（2)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)核酸生物染料 染色后在凝膠成像系統(tǒng)下拍照觀察，如果能特異性地?cái)U(kuò)增出一條254bp的片段，則待檢煙 草植物組織中存在煙草根黑腐病菌。
[0014] 3.根據(jù)技術(shù)方案2所述煙草根黑腐病菌的快速檢測方法，其特征在于：步驟（2) 所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：PCR反應(yīng)體系總體積20μ1，其中10XreactionBuffer 2yl，100mmol/LMgCl2bufTer1.2yl，2.5mmol/LdNTP]\^叉1：11代1.6卩1，10卩1]1〇1/1^上游 引物11^8-1:油？0.4以1，10以1]1〇1凡下游引物113&8-1:油1?0.4以1，51]/以11^&9?〇15〇116抑86 〇. 1μ1，模板DNA1μ1，滅菌超純水補(bǔ)足總體積；PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性4min，94°C變 性40s，60°C退火30s，72°C延伸40s，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：
[0016] 1、特異性強(qiáng)：本發(fā)明是根據(jù)煙草根黑腐病菌β-tubulin基因序列與其他物種進(jìn) 行多重比對分析后，設(shè)計(jì)出對煙草根黑腐病菌具有特異擴(kuò)增作用的PCR檢測引物。本發(fā)明 通過對煙草根黑腐病菌、帶根黑腐病煙草組織、常見18種植物病原菌：煙草疫霉、致病疫 霉、辣椒疫霉、大?疫霉、棉疫霉、隱地疫霉、標(biāo)桐疫霉、終極腐霉、瓜果腐霉、林棲腐霉、稻痕 病菌、尖孢鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、花生黑腐病菌、立枯絲核菌、灰綠青霉、黑根霉、哈茨木霉、 隨機(jī)從土壤分離的真菌進(jìn)行了檢測驗(yàn)證，充分證明本發(fā)明引物的特異性強(qiáng)、檢測結(jié)果的可 靠性。
[0017] 2、靈敏度高、能夠?qū)ξ⒘康臒煵莞诟【M(jìn)行檢測：本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物 對煙草根黑腐病菌的檢測靈敏度在DNA水平上可達(dá)到10pg，能夠?qū)ξ⒘康臒煵莞诟【?進(jìn)行檢測。
[0018] 3、能夠早期檢測出煙草根黑腐病菌：本發(fā)明特異性引物及其檢測方法能夠?qū)υ诟?黑腐病菌侵染煙草24h以及4天前即植株尚未顯病癥的早期階段均能檢測到根黑腐病原 菌，對根黑腐病菌進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷和鑒定。
[0019] 4.實(shí)用性好：本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物可用于煙草根黑腐病菌帶病組織的早期 診斷和高靈敏度的微量快速檢測，因此，本方法的實(shí)用性強(qiáng)，可以滿足對帶菌組織中存在的 煙草根黑腐病菌進(jìn)行及早、快速可靠的檢測和鑒定。
[0020] 5.操作簡便快捷：應(yīng)用本發(fā)明檢測方法，從煙草黑腐病病樣組織清洗、病原菌DNA 提取、PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳到獲得檢測結(jié)果，整個(gè)過程僅需要3~4小時(shí)，與常規(guī)生物 檢測方法相比，操作簡便快捷，大大縮短了鑒定所需的時(shí)間。
[0021] 綜上所述，本發(fā)明方法操作簡便、快捷、能夠?qū)煵莞诟∵M(jìn)行早期診斷、檢測 靈敏度高達(dá)到l〇pg，對于煙草根黑腐病害的鑒定及早期監(jiān)測，指導(dǎo)生產(chǎn)上對該病害進(jìn)行及 時(shí)防治提供了及時(shí)準(zhǔn)確的方法和科學(xué)依據(jù)。
[0022] 序列表中SEQIDN0 :1所示的是上游引物Tbas-tubF的堿基序列。
[0023] 序列表中SEQIDN0 :2所示的是下游引物Tbas-tubR的堿基序列。
【附圖說明】
[0024] 圖1為本發(fā)明對煙草根黑腐病菌的特異性PCR擴(kuò)增圖。圖中：M為DL2000DNA marker;泳道1~4為煙草根黑腐病菌；泳道5為煙草疫霉；泳道6為致病疫霉；泳道7為 辣椒疫霉；泳道8為大豆疫霉；泳道9為棉疫霉；泳道10為隱地疫霉；泳道11為棕櫚疫霉； 泳道12為終極腐霉；泳道13為瓜果腐霉；泳道14為林棲腐霉；泳道15為稻痕病菌；泳道 16為尖孢鐮刀菌；泳道17為禾谷鐮刀菌；泳道18為花生黑腐病菌；泳道19為立枯絲核菌； 泳道20為灰綠青霉；泳道21為黑根霉；泳道22為哈茨木霉；泳道23為土壤分離真菌；泳 道24為陰性對照。
[0025] 圖2本發(fā)明對煙草根黑腐病菌檢測的靈敏度擴(kuò)增圖。圖中：M為DL2000DNA marker;泳道1為100ng;泳道2為10ng;泳道3為lng;泳道4為100pg;泳道5為10pg; 泳道6為lpg;泳道7為100fg;泳道8為10fg;泳道9為陰性對照。
[0026] 圖3本發(fā)明對煙草根黑腐病菌早期侵染組織檢測的結(jié)果圖。圖中：M為DL2000DNA marker;泳道1為健康煙草組織（陰性對照）；泳道2為根黑腐病菌侵染6小時(shí)的煙草組織； 泳道3為根黑腐病菌侵染12小時(shí)的煙草組織；泳道4為根黑腐病菌侵染24小時(shí)的煙草組 織；泳道5為根黑腐病菌侵染48小時(shí)的煙草組織；泳道6為根黑腐病菌侵染72小時(shí)的煙草 組織；泳道7為根黑腐病菌侵染5天的煙草組織；泳道8為根黑腐病菌DNA(陽性對照）。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面通過【具體實(shí)施方式】的詳細(xì)描述來進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但并不是對本發(fā)明的限 制，僅僅作示例說明。以下各實(shí)施例中使用的試劑、煙草品種紅花大金元均能從商業(yè)渠道購 買。以下各實(shí)施例中無特殊說明的為常規(guī)方法。
[0028] 實(shí)施例1本發(fā)明PCR引物設(shè)計(jì)及引物對煙草根黑腐病菌的特異性擴(kuò)增
[0029] 一、引物設(shè)計(jì)及合成
[0030] 從GenBank下載煙草根黑腐病菌和其它物種的β-tubulin基因序列，用ClustalW 軟件進(jìn)行多重多序列比對、分析，找到煙草根黑腐病菌β-tubulin基因的特異性序列； 利用Primers軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，所設(shè)計(jì)的煙草根黑腐病菌分子檢測引物由上游引物 Tbas-tubF和下游引物Tbas-tubR組成，所述上游引物Tbas-tubF的堿基序列如SEQIDN0 : 1所示，所述下游引物Tbas-tubR的堿基序列如SEQIDNO:2所示，對煙草根黑腐病菌特異 性擴(kuò)增的預(yù)期片段大小為254bp。設(shè)計(jì)好的引物由上海invitrogen公司進(jìn)行合成。
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