一種人骨髓間充質(zhì)干細胞的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種人骨髓間充質(zhì)干細胞的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 脊柱關(guān)節(jié)?。⊿pondyloarthritis，SpA)是一種常見的自身免疫性疾病，其分為中 軸型和外周型兩類，共同疾病特點主要累及中軸關(guān)節(jié)及肌腱附著點，以炎性背痛和不對稱 外周關(guān)節(jié)炎為主要癥狀，好發(fā)于青年，大多數(shù)23~30歲發(fā)病，男女比例約為2 :1。來自歐 洲的報道稱脊柱關(guān)節(jié)病患病率為0. 15% -1. 8%，我國對12個省、市的120,451漢族人的流 行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示脊柱關(guān)節(jié)病的患病率為〇. 2% -0. 54%。脊柱關(guān)節(jié)病主要病理特征為 自身免疫性炎癥和病理性成骨，屬高致殘性疾病，隨著疾病的發(fā)展可導(dǎo)致嚴重的功能障礙， 給患者帶來了沉重的心理和經(jīng)濟負擔(dān)，但至今仍無治愈性治療手段?，F(xiàn)有的治療手段主要 包括：1.癥狀緩解藥物（包括非留體抗炎藥（NSAIDs)、糖皮質(zhì)激素（GC))、2.改善病情抗風(fēng) 濕藥物（DMARD)(包括2. 1甲氨喋呤（MTX)、2. 2柳氮磺胺吡啶（SASP))、3.生物制劑（包括 TNF-a拮抗劑）。
[0003] 但它們均為非治愈性藥物，且可造成胃腸道反映、感染，甚至骨髓抑制，肝腎功能 異常等嚴重副作用。正因為現(xiàn)存治療方法存在以上諸多不足。因此找到一種安全、有效且 可改變疾病進程的治療方法顯得尤為重要。
[0004] 1976年Friedenstein等首次描述骨髓中存在間充質(zhì)干細胞（mesenchymalstem cells，MSC)并證實其對造血干細胞的增殖和分化具有支持作用。MSC主要存在于全身的結(jié) 締組織中，以骨髓的含量最豐富，其具有向中胚層多種組織如骨組織、軟骨組織、脂肪組織、 肌肉組織甚至神經(jīng)外胚層的神經(jīng)組織等分化的潛能。
[0005] 目前尚未篩選到MSC特有的標(biāo)記分子，但一致的觀點認為SH2、SH3、⑶29、⑶44、 ⑶71、⑶90、⑶102等呈陽性，而⑶14、⑶34和⑶45等造血譜系分子表達陰性。由于MSC不 表達主要組織相容性復(fù)合體（MHC)II分子、⑶40、⑶80、⑶86等共刺激分子，不表達或極低 水平表達MHCI，MSC不易被宿主T細胞識別，并能逃脫宿主免疫系統(tǒng)的排斥，因此認為MSC 具有低免疫原性，并將其廣泛應(yīng)用于心肌病、肝臟疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病中。Strauer等選擇 18例陳舊性心肌梗死患者，病程5個月~8. 5年，經(jīng)冠狀動脈注射自體MSC(間充質(zhì)干細 胞），3個月后復(fù)查時發(fā)現(xiàn)梗死區(qū)面積減少30%，左心室射血分數(shù)升高15%，梗死壁運動速 率升高57 %，而對照組的以上三個指標(biāo)與治療前相比無明顯變化。Mohamadnejad等利用 MSC治療4例晚期肝硬化患者，患者平均年齡47歲，且都具有慢性肝衰竭，門脈高壓癥狀， 彩超顯示患者肝硬化，血清白蛋白、膽紅素明顯異常，晚期肝病模型（modelforendstage liverdisease，MELD)評分大于16。抽取患者自體骨髓，并培養(yǎng)至細胞量為10. 2X106~ 6. 0X106后，用20ml生理鹽水混懸細胞，經(jīng)肘靜脈緩慢注射。隨訪1年發(fā)現(xiàn)所有患者均存 活，且所有患者均未出現(xiàn)急性腎衰竭、肝臟失代償加重及肝臟腫塊等并發(fā)癥。其中3例患者 的肝功能明顯改善，MELD評分下降，并以術(shù)后6個月時效果最顯著。Mazzini等治療一組肌 萎縮側(cè)索硬化患者，取骨髓培養(yǎng)MSC，溶于2ml自體腦脊液后注射入脊髓，隨訪3年，無死亡、 腦脊髓的容積、結(jié)構(gòu)改變和異常細胞增殖現(xiàn)象發(fā)生。
[0006] 與此同時越來越多的證據(jù)表明MSCs具有強大的免疫調(diào)節(jié)及抑制炎癥反應(yīng)的能 力，早在2002年人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MSCs可通過抑制T細胞的增殖發(fā)揮其免疫抑制作用，近期的 研究已證明MSCs還可通過調(diào)節(jié)B淋巴細胞、NK細胞及樹突狀細胞來發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用， 其免疫調(diào)節(jié)及炎癥抑制功能的發(fā)揮有賴于其分泌的各種因子和/或細胞間接觸。MSCs被廣 泛用于輸注治療自身免疫相關(guān)疾病，國內(nèi)外眾多科研院所不僅證明了MSCs輸注的安全性， 同時證明了其對自身免疫性疾病的可靠療效。2005年Garcia-Olmod等對5例合并痿管的 克羅恩病（Cronhdisease)患者進行了自體MSC治療的I期臨床試驗，除1例患者由于MSC 體外培養(yǎng)受到細菌污染而退出試驗，其余4例共8處痿管接受了自體MSC痿管局部注射，隨 訪12~30個月（平均22個月）后，6處痿管完全閉合，另2處部分閉合。LeBlancK等 人在歐洲進行的一項多中心的II期臨床試驗證明：對55例對激素耐藥的急性GVHD患者使 用了MSC，盡管使用的MSC來源不同，包括HLA全相合、半相合或HLA完全不相合的第三方供 者，而且有的患者接受了多名供者的MSC，但經(jīng)治療后30例患者獲得了完全反應(yīng)，2年后，獲 得完全反應(yīng)的患者中有53%仍存活，而對MSC治療無反應(yīng)的2年生存率僅有16%，結(jié)果還 顯示，MSC供者的不同來源并不影響治療結(jié)果。
[0007] 同樣，脊柱關(guān)節(jié)病患者也存在著免疫紊亂的情況：Yang等人的實驗證明，與正常 人相比，SpA患者體內(nèi)的IL-23及IL-17水平明顯上升，而這可能是HLA-B27陽性等遺傳因 素及各種環(huán)境因素綜合作用產(chǎn)生。WendlingD等人也發(fā)現(xiàn)IL-17在SpA患者的關(guān)節(jié)滑液中 有著較高的表達。而且在SpA患者外周血的研究中也發(fā)現(xiàn)了Thl7細胞的增多。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種人骨髓間充質(zhì)干細胞的 制備方法及其應(yīng)用。
[0009] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種人骨髓間充質(zhì)干細胞的制備方 法，包括以下步驟：
[0010] (1)人血液采集：對行髂后上棘骨髓進行穿刺，采集血液；
[0011] (2)于20°C、以445Xg的速度離心步驟（1)采集的血液30min，分離骨髓中的有核 細胞，對人骨髓間充質(zhì)干細胞進行篩選、培養(yǎng)及純化，其中，培養(yǎng)液中含有DMEM培養(yǎng)基，培 養(yǎng)液中還含體積分數(shù)為10 %的胎牛血清、2U/L青霉素和2U/L鏈霉素；在37°C、5 %C02的條 件下培養(yǎng)48h后，更換培養(yǎng)液并去除懸浮細胞，并在以后每3~4天進行一次相似操作； [0012] (3)細胞融合度達到80%時，進行細胞傳代：用PBS洗滌細胞，再用胰酶消化，當(dāng) 貼壁細胞變?yōu)橛坞x時，終止消化，離心后棄去上清；用PBS洗滌一次后，將細胞接種于培養(yǎng) 液中，在37°C，5% 0)2的條件下進行傳代培養(yǎng)，當(dāng)細胞擴增進入第3代時，使用質(zhì)量分數(shù)為 0. 25 %的胰蛋白酶和lmmol/LEDTA進行消化，最后混懸于含有DMEM培養(yǎng)基并含有體積分 數(shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，得到人骨髓間充質(zhì)干細胞。
[0013] 作為本發(fā)明所述人骨髓間充質(zhì)干細胞的制備方法的優(yōu)選實施方式，所述步驟（2) 中，采用Ficoll密度梯度離心法離心步驟（1)采集的血液。
[0014] 作為本發(fā)明所述人骨髓間充質(zhì)干細胞的制備方法的優(yōu)選實施方式，所述步驟（2) 和所述步驟（3)中，DMEM培養(yǎng)基均為低糖型。
[0015] 本發(fā)明還提供了上述方法制得的人骨髓間充質(zhì)干細胞在用于制備治療脊柱關(guān)節(jié) 病的藥物中的應(yīng)用。
[0016] 作為人骨髓間充質(zhì)干細胞在用于制備治療脊柱關(guān)節(jié)病的藥物中的應(yīng)用的優(yōu)選實 施方式，所述脊柱關(guān)節(jié)病包括銀肩病關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病性關(guān)節(jié)炎和青少年特 發(fā)性關(guān)節(jié)炎。
[0017] 本發(fā)明的有益效果為：脊柱關(guān)節(jié)病患者的外周血及壞死股骨頭局部IL-17和 IL-23等炎性因子的含量明顯高于正常人；同時，脊柱關(guān)節(jié)病患者外周血Thl7細胞增多， Treg細胞降低，Thl7/Treg比例升高，全身處于炎性狀態(tài)。另外，經(jīng)實驗證實雖然脊柱關(guān) 節(jié)病患者MSC在增殖、分化及迀移能力等方面與正常人MSC沒有任何差異，但是脊柱關(guān)節(jié) 病患者MSC存在明顯的免疫調(diào)節(jié)能力異常，表現(xiàn)為混合淋巴細胞反應(yīng)（mixedlymphocyte reaction，MLR)中脊柱關(guān)節(jié)病患者MSC較正常人MSC抑制淋巴細胞增殖的能力明顯下降。 因此，經(jīng)體內(nèi)試驗和體外試驗研究，脊柱關(guān)節(jié)病患者體內(nèi)確實存在免疫紊亂，并且患者自身 體內(nèi)MSC也發(fā)生了免疫調(diào)節(jié)的異常，導(dǎo)致脊柱關(guān)節(jié)病患者體內(nèi)免疫紊亂不能得到干預(yù)和糾 正，體內(nèi)炎性情況得以持續(xù)和加劇，反過來又進一步惡化和加重病情。
[0018] 人骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs)具有調(diào)節(jié)紊亂的免疫功能，并通過抑制MSC的病理 性成骨，減緩或改變疾病進程。人骨髓間充質(zhì)干細胞對脊柱關(guān)節(jié)病患者效果十分明顯，病人 病情改善情況令人滿意，可幫助患者減少甚至停用NSAID等藥物，并且安全有效、無任何不 良副作用。此外，人骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs)來源廣，治療費用較為合理。因此，將人骨 髓間充質(zhì)干細胞BMSCs應(yīng)用在制備治療脊柱關(guān)節(jié)病藥物中具有巨大的社會和經(jīng)濟效益。
【具體實施方式】
[0019] 為更好地說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點，下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明 作進一步說明。
[0020] 下述BMSCs表示人骨髓間充質(zhì)干細胞，SpA表示脊柱關(guān)節(jié)病。
[0021] 實施例中，為了評價人骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs)治療脊柱關(guān)節(jié)病（SpA)的效果， 采用了下述評價指標(biāo)：
[0022] 1、主觀評價：Pain-VAS(疼痛視覺模擬評分）、BAS_G(Bath脊柱關(guān)