本申請(qǐng)屬于生物醫(yī)學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化領(lǐng)域，具體涉及一種大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的優(yōu)化方法。
背景技術(shù)：
：帕金森病(Parkinson’sdisease，簡(jiǎn)稱PD)是常見于老年人的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其發(fā)病率僅次于阿爾茲海默病，位于第二位。一直是臨床治療的難點(diǎn)。目前認(rèn)為其主要病因?yàn)槟X中多巴胺能神經(jīng)元的退行性變，大腦的特定部位缺少多巴胺所致。目前可用的藥物和手術(shù)療法能緩解疾病的早期臨床癥狀，但無法阻止或逆轉(zhuǎn)多巴胺能神經(jīng)元退行性變，而且長(zhǎng)期使用有明顯的副作用。干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)以及體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的成功使得細(xì)胞移植替代治療成為可能。干細(xì)胞治療需要合適的種子細(xì)胞，并把種子細(xì)胞培養(yǎng)獲得適合移植使用的目標(biāo)細(xì)胞，即多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞。目前認(rèn)為可能用于PD治療的干細(xì)胞來源包括胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcells，簡(jiǎn)稱ESCs)，神經(jīng)干細(xì)胞(Neuralstemcells，簡(jiǎn)稱NSCs)，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，簡(jiǎn)稱MSCs)等。胚胎干細(xì)胞體外向多巴胺能神經(jīng)元分化已有報(bào)道(Buytaert-HoefenKA,AlvarezE,andFreedCR.GenerationoftyrosinehydroxylasepositiveneuronsfromhumanembryonicstemcellsaftercoculturewithcellularsubstratesandexposuretoGDNF.StemCells,2004.22(5):p.669-74.)。但是胚胎干細(xì)胞一般是來自于異源性組織的細(xì)胞，有免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)，并且倫理學(xué)爭(zhēng)議較多。神經(jīng)干細(xì)胞，一般是來自于胚腦神經(jīng)組織得到的，體外也可分化為大腦中幾乎所有類型的神經(jīng)元，包括多巴胺能神經(jīng)元(LieDC,etal.Theadultsubstantianigracontainsprogenitorcellswithneurogenicpotential.JNeurosci,2002.22(15):p.6639-49.)。但是神經(jīng)干細(xì)胞相比胚胎干細(xì)胞分化潛能低，單一譜系方向分化效率也較低，同時(shí)來源有限，且有倫理學(xué)爭(zhēng)議。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能，在體外一定條件下可向神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行分化。并且骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有來源豐富、取材簡(jiǎn)便、易分離純化、又可進(jìn)行自體移植等特點(diǎn)，被認(rèn)為是帕金森病等神經(jīng)退行性疾病細(xì)胞替代療法的理想來源。目前體外誘導(dǎo)的方法主要分為3種：①神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞因子，如維甲酸、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等誘導(dǎo)分化。②化學(xué)試劑，二甲基亞砜、2-巰基乙醇、丁羥茴醚等誘導(dǎo)分化。③基因轉(zhuǎn)染或修飾的誘導(dǎo)分化。全骨髓培養(yǎng)得到的MSCs在體外合適條件和誘導(dǎo)因子作用12天可分化為表達(dá)多巴胺神經(jīng)元標(biāo)記物酪氨酸羥化酶(tyrosinehydroxylase，簡(jiǎn)稱TH)的神經(jīng)元樣細(xì)胞，并具有一定的電生理活性，分化效率可達(dá)67％，是目前骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能達(dá)到的最大分化率以及最短的誘導(dǎo)時(shí)間(TrzaskaKA,KuzhikandathilEV,RameshwarP,Specificationofadopaminergicphenotypefromadulthumanmesenchymalstemcells.StemCells,2007.25(11):p.2797-808.)。然而，目前技術(shù)難以通過體外誘導(dǎo)分化得到足夠數(shù)量的成熟多巴胺能神經(jīng)元，而且移植后的細(xì)胞存活數(shù)量有限、移植細(xì)胞不易與原有神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)融合都在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用。因此，在細(xì)胞替代治療帕金森病，提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元的分化效率是解決這些問題的關(guān)鍵。肝X受體(LiverXreceptor，LXR)是核受體家族中重要的一員，有α和β兩種亞型，LXRα除在肝臟高表達(dá)外，也在脂肪組織、腎、小腸、肺、腎上腺及巨噬細(xì)胞表達(dá)；LXRβ幾乎在所有的組織和器官內(nèi)表達(dá)，尤其在腦。近年研究發(fā)現(xiàn)LXR在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有重要功能，包括參與皮質(zhì)板層神經(jīng)元發(fā)育、維持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活、調(diào)節(jié)脂代謝、調(diào)節(jié)神經(jīng)免疫以及參與突觸可塑性和軸突形成等多種生理功能。LXRα/β基因雙敲除小鼠顯示脂質(zhì)在腦內(nèi)逐漸累積，以及脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和腹側(cè)中腦多巴胺能神經(jīng)元的丟失(SacchettiP,etal.LiverXreceptorsandoxysterolspromoteventralmidbrainneurogenesisinvivoandinhumanembryonicstemcells.cellStemCell,2009.5(4):p.409-19.)然而，迄今未見有關(guān)LXR激動(dòng)劑對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元方向分化影響的報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本申請(qǐng)針對(duì)上述存在的問題，提供了一種大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的優(yōu)化方法。為了解決上述技術(shù)問題，本申請(qǐng)公開了一種大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的優(yōu)化方法，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)按20000個(gè)/ml密度接種，用Neurobasalmedium和B27supplement為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入細(xì)胞因子SHH(250ng/ml)，F(xiàn)GF-8(100ng/ml)，bFGF(50ng/ml)聯(lián)合0.5μMLXR激動(dòng)劑(T0901317)共同誘導(dǎo)6天。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本申請(qǐng)可以獲得包括以下技術(shù)效果：1)肝X受體作為靶點(diǎn)參與多巴胺能神經(jīng)元的誘導(dǎo)分化及其機(jī)制。2)肝X受體激動(dòng)劑聯(lián)合細(xì)胞因子SHH、FGF-8、bFGF可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)向多巴胺能神經(jīng)元分化，提高了誘導(dǎo)分化率，并縮短了誘導(dǎo)時(shí)間，產(chǎn)生協(xié)同作用。3)肝X受體激動(dòng)劑與其他誘導(dǎo)方法(如：化學(xué)試劑誘導(dǎo)，基因轉(zhuǎn)染，其他細(xì)胞因子等)聯(lián)用,可能促進(jìn)誘導(dǎo)干細(xì)胞(如：胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞等)向多巴胺能神經(jīng)元的誘導(dǎo)，分化與成熟。當(dāng)然，實(shí)施本申請(qǐng)的任一產(chǎn)品必不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。附圖說明此處所說明的附圖用來提供對(duì)本申請(qǐng)的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分，本申請(qǐng)的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本申請(qǐng)，并不構(gòu)成對(duì)本申請(qǐng)的不當(dāng)限定。在附圖中：圖1為倒置相差顯微鏡觀察原代和傳代培養(yǎng)后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(10×20)；其中(a)：原代培養(yǎng)；(b)：傳代培養(yǎng)后細(xì)胞呈典型的長(zhǎng)梭形，漩渦狀生長(zhǎng)；圖2為流式細(xì)胞儀檢測(cè)克隆化培養(yǎng)后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物的流式圖；圖3為倒置相差顯微鏡觀察誘導(dǎo)后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(10×20)；其中(a)：對(duì)照組細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形；(b)：處理組細(xì)胞胞體聚攏，并有突起；(c)：LXR組細(xì)胞胞體聚攏，并有突起；圖4為免疫熒光檢測(cè)誘導(dǎo)后多巴胺能神經(jīng)元相關(guān)標(biāo)記物Nestin的表達(dá)(×400)；其中(a)：對(duì)照組無神經(jīng)標(biāo)記物Nestin陽性表達(dá)；(b)與(c)：處理組和LXR組均有神經(jīng)標(biāo)記物Nestin陽性表達(dá)(紅色)；圖5為免疫熒光檢測(cè)誘導(dǎo)后多巴胺能神經(jīng)元相關(guān)標(biāo)記物Tuj1/TH的表達(dá)(×200)；其中(a)：對(duì)照組無多巴胺能神經(jīng)元相關(guān)標(biāo)記物Tuj1/TH陽性表達(dá)；(b)與(c)：處理組和LXR組均有多巴胺能神經(jīng)元相關(guān)標(biāo)記物Tuj1/TH陽性表達(dá)(紅色)；(d)：三組多巴胺能神經(jīng)元相關(guān)標(biāo)記物Tuj1/TH表達(dá)量比較；圖6為L(zhǎng)XR激動(dòng)劑對(duì)MSCs向TH陽性神經(jīng)元分化方向分化的影響；圖7為熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)誘導(dǎo)后相關(guān)基因TH、Nurr1、Pitx3的相對(duì)表達(dá)量。具體實(shí)施方式以下將配合附圖及實(shí)施例來詳細(xì)說明本申請(qǐng)的實(shí)施方式，藉此對(duì)本申請(qǐng)如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達(dá)成技術(shù)功效的實(shí)現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。一、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)和鑒定1、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)和傳代提取SD大鼠股骨和脛骨骨髓，移入20％FBS(v/v)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。CO2培養(yǎng)箱(飽和濕度；95％air-5％CO2；37℃)中培養(yǎng)2天后全量換液，PBS洗2-3次去除懸浮未貼壁細(xì)胞。每2天換液一次，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)70％-80％時(shí)，0.25％Trypsin-EDTA消化成單細(xì)胞懸液，1:2進(jìn)行傳代，改用10％FBS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。原代培養(yǎng)和傳代后培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)見圖1所示。傳代培養(yǎng)方法：細(xì)胞長(zhǎng)至70-80％匯合時(shí)傳代，用吸管吸去培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，PBS清洗3次，0.25％Trypsin-EDTA消化至大部分細(xì)胞從底壁脫落，加入2ml10％FBS培養(yǎng)基中和胰酶，將細(xì)胞移至無菌離心管內(nèi)，常溫下1500轉(zhuǎn)，離心5min，去上清，10％FBS培養(yǎng)基輕柔地將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，1:2接種至新的無菌培養(yǎng)瓶中，置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。擴(kuò)增培養(yǎng)基成分如下：成分來源100ml含量DMEM/F-12Hyclone80ml,90mlFBSGibco20ml,10ml2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記物檢測(cè)用流式細(xì)胞術(shù)鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。取第3代大鼠BMSCs對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞3次，0.25％Trypsin-EDTA消化細(xì)胞，培養(yǎng)基終止消化并吹打至獲得單細(xì)胞懸液。取約106個(gè)細(xì)胞，按抗體說明書分別加入相應(yīng)檢測(cè)量的熒光標(biāo)記抗體(CD44-PE，CD29-FITC，CD90-PE，CD11b-PE，CD45-FITC)和相應(yīng)的同型對(duì)照抗體，混勻，室溫避光放置30min。加入600μlPBS，1000g離心5min，棄上清，加入200μlPBS重懸細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)。圖2為流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物結(jié)果?？梢姡旱?代大鼠BMSCs表達(dá)CD29，CD90，CD44，表達(dá)率分別為99.96％，98.47％，99.92％，不表達(dá)CD11b，CD45，表達(dá)率分別為0.71％，0.90％。二、定向誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化向多巴胺能神經(jīng)元向分化1.定向誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化向多巴胺能神經(jīng)元向分化將(一)中1步驟后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)按20000個(gè)/ml密度接種，分3組，即對(duì)照組、處理組和LXR組。處理組改用Neurobasalmedium和B27supplement為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入細(xì)胞因子SHH(250ng/ml)，F(xiàn)GF-8(100ng/ml)，bFGF(50ng/ml)作用12天不換液；LXR組在處理組的基礎(chǔ)上聯(lián)合0.5μMLXR激動(dòng)劑(T0901317)同時(shí)加入并作用6天不換液；對(duì)照組不加誘導(dǎo)劑與LXR激動(dòng)劑，采用10％FBS培養(yǎng)。均置于CO2培養(yǎng)箱(飽和濕度；95％air-5％CO2；37℃)中培養(yǎng)。鏡下觀察到一些MSCs在誘導(dǎo)劑作用下轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元樣形態(tài)，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)無明顯變化。見圖3。2.免疫熒光和定量PCR檢測(cè)誘導(dǎo)分化后細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)。誘導(dǎo)分化后取出細(xì)胞爬片，4％多聚甲醛室溫固定10min，PBS洗滌5mins*3次；非免疫性動(dòng)物血清封閉，37℃30mins后PBS洗滌；按照抗體說明書所推薦濃度加入不同一抗(Nestin1:200；TH1:200與Tuj11:200共同孵育)，4℃孵育過夜，37℃復(fù)溫30mins后PBS洗滌5mins*3次；加入相應(yīng)種屬及推薦濃度熒光標(biāo)記的二抗(Abbcine)，37℃孵育30mins，PBS洗滌5mins*3次；室溫孵育DAIP5-7mins(碧云天)，PBS洗滌5mins*3次；50％甘油封片。分別置于NikonA1+R共聚焦顯微鏡相應(yīng)激發(fā)光下觀察熒光。用NIS-ElementsAR4.2軟件計(jì)算TH與Tuj1熒光強(qiáng)度。誘導(dǎo)分化率＝TH陽性細(xì)胞/Tuj1陽性細(xì)胞。經(jīng)過誘導(dǎo)后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞，DAPI襯染細(xì)胞核(藍(lán)色),處理組和LXR組神經(jīng)標(biāo)記物Nestin均有陽性表達(dá)(紅色)；對(duì)照組則無陽性結(jié)果。見圖4。經(jīng)過誘導(dǎo)后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞，DAPI襯染細(xì)胞核(藍(lán)色),多巴胺能神經(jīng)元相關(guān)標(biāo)記物Tuj1(綠色)和TH(紅色)免疫熒光顯示，處理組和LXR組均有Tuj1(綠色)和TH(紅色)陽性表達(dá)；對(duì)照組則無陽性結(jié)果。與對(duì)照組比較，處理組Tuj1、TH熒光強(qiáng)度均顯著升高(**P<0.01)；與處理組比較，LXR組Tuj1、TH熒光強(qiáng)度均顯著升高(##P<0.01)。見圖5。免疫熒光結(jié)果顯示，對(duì)照組、處理組和LXR組TH染色陽性細(xì)胞數(shù)平均值分別為14.02％、62.61％和87.42％，與對(duì)照組比較，處理組TH染色陽性細(xì)胞數(shù)顯著升高(**P<0.01)；與處理組比較，LXR組TH染色陽性細(xì)胞數(shù)顯著升高(##P<0.01)。見圖6。3.定量PCR檢測(cè)誘導(dǎo)分化后細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)q-PCR檢測(cè)：細(xì)胞總RNA的提取：使用TRIzol總RNA抽取試劑盒(日本TaKaRa公司)分別抽取細(xì)胞3組后的總RNA，分光光度計(jì)測(cè)抽提的RNA純度與濃度，保存于-80℃。cDNA的合成：逆轉(zhuǎn)錄體系：根據(jù)TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明將逆轉(zhuǎn)錄體系配制如下：A去除gDNA的10ul體系：配好后室溫下放置5min。B20ul逆轉(zhuǎn)錄體系：冰上進(jìn)行，反應(yīng)液配好后輕柔混勻，立即開始逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件，37℃，15min；85℃，5sec；4℃冷卻。合成的cDNA置于-20℃保存。RT-PCR反應(yīng)體系：根據(jù)TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明將擴(kuò)增體系配制擴(kuò)增條件：95℃30sec+95℃5sec+60℃30-60sec收集熒光(40個(gè)循環(huán))所用引物如下表所示：(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)結(jié)果的計(jì)算方法：采用相對(duì)定量ΔΔCt計(jì)算3組細(xì)胞基因的相對(duì)表達(dá)量。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)均用表示，設(shè)置差異顯著水平為雙側(cè)α＝0.05。采用軟件SPSS17.0做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Dunnett’st檢驗(yàn)做組間比較。誘導(dǎo)后檢測(cè)分化細(xì)胞中多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育相關(guān)基因TH、Nurr1、Pitx3的表達(dá)。GADPH作為內(nèi)參。與對(duì)照組比較，處理組TH、Nurr1、Pitx3基因相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(*P<0.05與**P<0.01)；與處理組比較，LXR組TH、Nurr1、Pitx3基因相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(#P<0.05與##P<0.01)。見圖7。上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3