定向誘導(dǎo)絨山羊毛囊干細(xì)胞向表皮細(xì)胞分化的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及絨山羊毛囊干細(xì)胞，尤其涉及定向誘導(dǎo)絨山羊毛囊干細(xì)胞向表皮細(xì)胞 分化的方法，屬于絨山羊毛囊干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 毛囊來源干細(xì)胞(hair follicle stem cells，F(xiàn)SC)是指存在于毛囊里的原始細(xì) 胞，目前多數(shù)研究將定位于毛囊隆突部和外根鞘的角質(zhì)形成干細(xì)胞稱為毛囊干細(xì)胞 (Yasuyuki et xl., Implanted hair follicle stem cells form Schwann cells that support repair of severed peripheral nerves[J].PNAS,2005,102(49):17734-17738.)，這些干細(xì)胞具有增殖分化為表皮、汗腺和皮脂腺等多種上皮組織的潛能。近年來， 毛囊干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域備受關(guān)注，毛囊干細(xì)胞在體內(nèi)多處于靜止?fàn)顟B(tài)，而在體外 培養(yǎng)或內(nèi)環(huán)境作用下則表現(xiàn)出驚人的增殖與分化能力，通過不斷的分裂分化來維持組織在 細(xì)胞數(shù)量和功能上的平衡。許多研究人員己經(jīng)采用不同的方法分離得到了毛囊干細(xì)胞，其 方法主要有:流式細(xì)胞儀分選法、應(yīng)用酶消化法、組織塊法、差速貼壁法、顯微分離法和免疫 磁珠法等。
[0003] 褪黑素(melatonin, MLT)，學(xué)名為N-乙酸-5-甲氧基色胺，分子式C13H16N2〇2,相對分 子質(zhì)量為232.27,熔點(diǎn)116-118°C，主要由哺乳動物及人類的松果體產(chǎn)生，是一種吲哚類化 合物/胺類激素，其分泌量晝夜不同，白天分泌量減少，夜晚分泌量增加。研究表明，不論在 山羊生絨期還是非生絨期，皮下埋置褪黑激素都可以促進(jìn)絨毛的生長。另外，褪黑素可以刺 激體外培養(yǎng)的毛囊纖維生長。
[0004] 目前，關(guān)于褪黑素對毛囊來源干細(xì)胞分化的影響尚未見報道。因此，建立一種外源 褪黑素定向誘導(dǎo)絨山羊毛囊干細(xì)胞向表皮細(xì)胞高效分化的方法，對于毛囊干細(xì)胞體外高效 定向誘導(dǎo)的命運(yùn)決定等相關(guān)研究將具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種定向誘導(dǎo)絨山羊毛囊干細(xì)胞向表皮細(xì)胞 分化的方法，該方法利用褪黑素定向誘導(dǎo)絨山羊毛囊干細(xì)胞向表皮細(xì)胞高效分化，操作簡 便，可重復(fù)性好，為毛囊干細(xì)胞體外培養(yǎng)及研究應(yīng)用的開展奠定了基礎(chǔ)。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明首先公開了一種定向誘導(dǎo)絨山羊毛囊干細(xì)胞向表皮細(xì)胞分化的方法，包 括：向絨山羊毛囊干細(xì)胞中加入褪黑素進(jìn)行誘導(dǎo)，然后對誘導(dǎo)分化的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，即得； 其中，所述褪黑素的使用濃度為100_700pg/ml;優(yōu)選的，所述褪黑素的使用濃度為100-300pg/ml，最優(yōu)選為300pg/ml。本發(fā)明所述誘導(dǎo)的時間為1-21天，優(yōu)選為3-14天，最優(yōu)選為7 天。本發(fā)明所述絨山羊毛囊干細(xì)胞為內(nèi)蒙古白絨山羊毛囊干細(xì)胞。
[0008] 絨山羊毛囊干細(xì)胞的制備方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，其方法主要包括:流式 細(xì)胞儀分選法、應(yīng)用酶消化法、組織塊法、差速貼壁法、顯微分離法和免疫磁珠法等，具體的 絨山羊毛囊干細(xì)胞的制備方法可以參考文獻(xiàn)"內(nèi)蒙古白絨山羊毛囊來源干細(xì)胞的分離鑒定 及其褪黑素受體基因 cDNA的克隆，王宏，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2014"，該方法操作 簡單，按照流程可以重復(fù)再現(xiàn)。本發(fā)明分離純化獲得了大量的內(nèi)蒙古白絨山羊毛囊來源干 細(xì)胞，且經(jīng)過成脂誘導(dǎo)、成骨誘導(dǎo)、成神經(jīng)誘導(dǎo)以及毛囊來源干細(xì)胞標(biāo)記基因檢測，鑒定為 毛囊干細(xì)胞。
[0009] 絨山羊毛囊干細(xì)胞可以在體內(nèi)外分化為不同類型的細(xì)胞。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)褪黑素對毛 囊干細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，l〇〇pg/ml~700pg/ml濃度的褪黑素對毛囊干細(xì)胞增殖均具有 促進(jìn)作用。通過檢測誘導(dǎo)分化過程中的毛囊干細(xì)胞標(biāo)記基因（β?整合素和S0X9)的表達(dá)量證 明，其中500pg/ml褪黑素為毛囊干細(xì)胞的最適增殖濃度，β?整合素和S0X9基因的相對表達(dá) 水平均顯著高于其它濃度的褪黑素刺激組。
[0010] 本發(fā)明通過檢測褪黑素對毛囊干細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中的表皮細(xì)胞標(biāo)記基因(K1和 K10)的表達(dá)量變化發(fā)現(xiàn)，100pg/ml~300pg/ml濃度的褪黑素可以促進(jìn)毛囊干細(xì)胞向表皮細(xì) 胞分化，最適的濃度為300pg/ml，表皮細(xì)胞標(biāo)記基因 K1和K10基因的表達(dá)量均顯著高于其它 濃度的褪黑素刺激組。而且，300pg/ml褪黑素誘導(dǎo)定向誘導(dǎo)毛囊干細(xì)胞3-14天主要得到分 化的表皮細(xì)胞，而且誘導(dǎo)7d的效率最佳，表皮細(xì)胞標(biāo)記基因 K1和K10基因的表達(dá)量均顯著高 于其它誘導(dǎo)時間。
[0011] 本發(fā)明定向誘導(dǎo)絨山羊毛囊干細(xì)胞向表皮細(xì)胞分化的方法中，所述向絨山羊毛囊 干細(xì)胞中加入褪黑素進(jìn)行誘導(dǎo)，包括以下步驟：（1)將絨山羊毛囊干細(xì)胞以IX 1〇4個細(xì)胞/ 孔的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，補(bǔ)足干細(xì)胞培養(yǎng)液至500μ1/孔，培養(yǎng)過夜；（2)次日，更換含有 所述濃度褪黑素的干細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)細(xì)胞，即得。其中，所述培養(yǎng)細(xì)胞為37°C，5%C0 2,飽 和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3-4天換液一次。所述干細(xì)胞培養(yǎng)液為:DMEM/F12+10 % FBS+ 1%PS+EGF 20ng/mL+ITS 10yl/mL〇
[0012] 本發(fā)明方法中，對誘導(dǎo)分化的細(xì)胞進(jìn)行鑒定包括:提取誘導(dǎo)分化的細(xì)胞的總RNA， 反轉(zhuǎn)錄為cDNA;然后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，例如采用實(shí)時定量PCR擴(kuò)增，檢測表皮細(xì)胞 標(biāo)記基因的表達(dá)情況；如果檢測到表皮細(xì)胞標(biāo)記基因呈陽性表達(dá)，則鑒定誘導(dǎo)分化的細(xì)胞 為表皮細(xì)胞。其中，所述表皮細(xì)胞標(biāo)記基因?yàn)镵1基因或K10基因中的任意一種或兩種。研究 表明，表皮干細(xì)胞表達(dá)K19，短暫增殖細(xì)胞表達(dá)K5和K14，終末分化細(xì)胞表達(dá)K1和K10，因此K1 和K10基因可以作為干細(xì)胞分化到表皮細(xì)胞的標(biāo)記物。本發(fā)明為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)穩(wěn)定，用 β-actin或GADPH基因中的任意一種或兩種作為內(nèi)參基因。
[0013] 本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：
[0014] 本發(fā)明建立了一種外源褪黑素定向誘導(dǎo)絨山羊毛囊干細(xì)胞向表皮細(xì)胞高效分化 的方法，該方法不僅操作簡便，可重復(fù)性好，而且為真正意義上毛囊干細(xì)胞體外培養(yǎng)及相關(guān) 研究應(yīng)用的開展提供了技術(shù)基礎(chǔ)，對于毛囊干細(xì)胞體外高效定向誘導(dǎo)的命運(yùn)決定等相關(guān)研 究具有重要的意義。
【附圖說明】
[0015] 圖1為毛囊來源干細(xì)胞的分離培養(yǎng)(100X);其中，A:分離的毛囊;B:分離的毛囊;C: 毛囊來源干細(xì)胞原代培養(yǎng)lh; D:毛囊來源干細(xì)胞原代培養(yǎng)3d;
[0016] 圖2為毛囊來源干細(xì)胞的純化培養(yǎng)（100X);其中，A:毛囊來源干細(xì)胞P1代6d(純化 前）；B，毛囊來源干細(xì)胞P2代6d(純化后）；
[0017] 圖3為毛囊來源干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)（100X);其中，A:毛囊來源干細(xì)胞P3代6d;B:毛 囊來源干細(xì)胞P5代6d;
[0018] 圖4為毛囊來源干細(xì)胞形成的單克?。?00X);其中，A:P3(傳代培養(yǎng)的3代)毛囊來 源干細(xì)胞單克隆;B:P5(傳代培養(yǎng)的5代)毛囊來源干細(xì)胞單克隆;C:P8(傳代培養(yǎng)的8代)毛 囊來源干細(xì)胞單克??；
[0019] 圖5為毛囊來源干細(xì)胞的形態(tài)觀察;其中，A:毛囊來源干細(xì)胞do(即第0天）（100X); B:毛囊來源干細(xì)胞d0(即第0天）（400X); C:毛囊來源干細(xì)胞d2(即第2天）（100X); D:毛囊來 源干細(xì)胞d2(即第2天）（400X);
[0020] 圖6為毛囊來源干細(xì)胞的染色觀察（100X);其中，A:毛囊來源干細(xì)胞羅丹明染色； B:毛囊來源干細(xì)胞吉姆薩染色;C和D:為毛囊來源干細(xì)胞單克隆羅丹明染色;E:毛囊來源干 細(xì)胞克隆簇羅丹明染色;F:毛囊來源干細(xì)胞克隆簇吉姆薩染色；
[0021] 圖7為毛囊來源干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)（200X);其中，A為FSCs未誘導(dǎo)d8，未染色；A'為 FSCs未誘導(dǎo)d8，油紅0染色陰性;B為FSCs成脂誘導(dǎo)d8，未染色;B'為FSCs成脂誘導(dǎo)d8，油紅0 染色陽性;C為FSCs未誘導(dǎo)dl 2，未染色;C '為FSCs未誘導(dǎo)dl 2，油紅0染色陰性;D為FSCs成脂 誘導(dǎo)dl2，未染色;D '為FSCs成脂誘導(dǎo)dl2，油紅0染色陽性；
[0022]圖8為毛囊來源干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)（200X);其中，A為FSCs未誘導(dǎo)dl6,未染色;A'為 FSCs未誘導(dǎo)dl6，茜素紅染色陰性;B為FSCs成骨誘導(dǎo)dl6，未染色;B'為FSCs成骨誘導(dǎo)dl6，茜 素紅染色陽性;C為FSCs未誘導(dǎo)d21，未染色;C '為FSCs未誘導(dǎo)d21，茜素紅染色陰性;D為FSCs 成骨誘導(dǎo)d21，未染色;D '為FSCs成骨誘導(dǎo)d21，茜素紅染色陽性；
[0023]圖9為毛囊來源干細(xì)胞成神經(jīng)誘導(dǎo)（200X);其中，A為誘導(dǎo)前的FSCs，未染色;A'為 誘導(dǎo)前的FSCs，尼氏染色陽性;B為FSCs成神經(jīng)誘導(dǎo)48h，未染色(200 X );B'為FSCs成神經(jīng)誘 導(dǎo)48h，尼氏染色陽性;C為FSCs成神經(jīng)誘導(dǎo)72h，未染色;C '為FSCs成神經(jīng)誘導(dǎo)72h，尼氏染色 陽性；
[0024] 圖10為毛囊來源干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)(基因檢測）；其中，F(xiàn)AS和PPARy-2為脂肪細(xì)胞發(fā) 育特異表達(dá)基因;β-actin為內(nèi)參基因；