一種特異識別大鼠成骨細(xì)胞的寡核苷酸配基的序列和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及特異識別大鼠成骨細(xì)胞的寡核巧酸 配基L54的序列和修飾，W及修飾后的L54在識別大鼠成骨細(xì)胞方面的應(yīng)用。本發(fā)明涉及 L54在生物醫(yī)藥方面的應(yīng)用。L54作為試劑盒的組成部分或者檢測指標(biāo)，用于骨質(zhì)疏松、骨 關(guān)節(jié)炎等骨代謝相關(guān)疾病的輔助診斷，治療骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎等骨代謝相關(guān)疾病，W及用 于關(guān)于骨代謝疾病發(fā)生、發(fā)展、進(jìn)程相關(guān)的基礎(chǔ)研究等。L54作為載體遞送藥物祀向骨代謝 相關(guān)疾病祀向治療方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)，簡稱沈LEX(SystematicEvolutionofLigands byExponentialEnrichment)技術(shù)，是一種新型的高通量生物文庫篩選技術(shù)。送種技術(shù)運(yùn) 用大容量的隨機(jī)寡核巧酸文庫（ssDNA文庫和RNA文庫），同時(shí)結(jié)合體外PCR擴(kuò)增技術(shù)，W 指數(shù)形式富集與祀分子特異性結(jié)合的寡核巧酸，經(jīng)過反復(fù)的體外篩選、擴(kuò)增，最終獲得基于 空間結(jié)構(gòu)與祀分子呈高特異性和高親和力的結(jié)合寡核巧酸配基-適配體（aptamer)。由于 aptamer具有精確識別、無免疫原性、易體外合成與修飾等優(yōu)點(diǎn)，又稱為"人工替代抗體"，在 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床診斷與新藥研發(fā)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。隨機(jī)文庫中的寡核巧酸序列 能形成多樣的空間結(jié)構(gòu)，因此SELEX技術(shù)可選擇的祀分子范圍十分廣泛，包括金屬離子、蛋 白多膚、有機(jī)染料等，其中蛋白多膚類祀分子最多，包括酶、生長因子、抗體、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞 粘附分子和選擇素等。完整的病毒顆粒、細(xì)菌病原體，甚至完整的哺乳動物細(xì)胞也可W通過 完整細(xì)胞消減SELEX技術(shù)篩選出其高親和力的寡核巧酸配基。SELEX技術(shù)作為一種極其有 用的分子生物學(xué)工具而越來越受到重視，并在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床診斷和疾病治療中都顯示了 廣闊的應(yīng)用前景。
[0003] 本發(fā)明是通過完整細(xì)胞消減SELEX技術(shù)獲得了一個(gè)寡核巧酸配基L54。經(jīng)鑒定L54 能夠特異識別大鼠成骨細(xì)胞，而不結(jié)合其它細(xì)胞，對照核酸序列與上述細(xì)胞均無結(jié)合，目前 尚未見能特異結(jié)合大鼠成骨細(xì)胞的核酸適配體的相關(guān)研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明目的在于提出特異識別鼠成骨細(xì)胞的寡核巧酸配基L54的序列及其應(yīng)用 領(lǐng)域，包括L54作為試劑盒的組成部分或者檢測指標(biāo)，用于骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎等骨代謝相 關(guān)疾病的輔助診斷，治療骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎等骨代謝相關(guān)疾病，W及用于關(guān)于骨代謝疾病 發(fā)生、發(fā)展、進(jìn)程相關(guān)的基礎(chǔ)研究等。L54作為載體遞送藥物祀向骨代謝相關(guān)疾病祀向治療 方面的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明通過W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0006] 首先由Invitrogen公司合成L54序歹(J，并在5'端或3'端修飾、標(biāo)記（如FAM、生 物素或者同位素），然后進(jìn)行應(yīng)用研究：組織化學(xué)或英光方法檢測L54識別大鼠成骨細(xì)胞。
[0007] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)：
[000引 I)與蛋白類的抗體相比，單鏈的寡核巧酸更加穩(wěn)定；aptamer可直接體外合成、標(biāo) 記，因此不需要標(biāo)記的二抗，使得操作更為簡單、迅速；aptamer的合成成本較抗體制備成 本低，周期短。
[0009] 2)本發(fā)明證實(shí)L54能夠特異識別大鼠成骨細(xì)胞。因此，L54序列在臨床醫(yī)學(xué)與基 礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的腫瘤研究相關(guān)領(lǐng)域中均具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場前景。
【附圖說明】：
[0010] 圖1流式細(xì)胞儀測定L54與大鼠成骨細(xì)胞的結(jié)合情況。
[0011] 圖2流式細(xì)胞儀測定L54與大鼠骨肉瘤細(xì)胞的結(jié)合情況。
[0012] 圖3流式細(xì)胞儀測定L54與大鼠腸上皮細(xì)胞的結(jié)合情況。
[0013] 圖化54與大鼠成骨細(xì)胞結(jié)合的平衡解離常數(shù)（KD值）的測定。
【具體實(shí)施方式】：
[0014] 下面通過FAM標(biāo)記的L54對大鼠成骨細(xì)胞的識別來進(jìn)一步描述本發(fā)明。
[0015] 1、合成L54序列（序列表中沈Q ID No. 1)和GP30序列（序列表中沈Q ID No. 2)， 均在5'端標(biāo)記FAMdnvitrogen公司完成）。
[0020] 注；N代表A、T、G、C任意一種。
[0021] 2、流式細(xì)胞儀分別測定FAM-L54與大鼠成骨細(xì)胞、大鼠骨肉瘤細(xì)胞、大鼠腸上皮 細(xì)胞的結(jié)合
[0022] 2. 1將一定濃度的FAM-L54或FAM-GP30溶于50U1賠育緩沖液 (1 XPBS-1. 25mmol/LCaCl廠0. 25mmol/LMgCl廠0. 1 U g/ U 1 5rtRNA-0. 1 U g/ U 1娃魚精DNA) 中，95°C加熱5min后迅速置于冰上冷卻IOmin ;
[0023]2. 2分別收集大鼠成骨細(xì)胞、大鼠骨肉瘤細(xì)胞和大鼠腸上皮細(xì)胞，無菌IXPBS 洗一次，調(diào)整細(xì)胞濃度為5X l(f/管單細(xì)胞懸液，加入封閉液（1 XPBS-1. 25mmol/ LCaClz-O. 25mmol/LMgCl2-〇. 1Ug/U1 }^tRNA-〇. 1Ug/U1娃魚精DM)于室溫封閉30min ;
[0024] 2. 3離必去除封閉液，將等量變性處理好的FAM-L54或FAM-GP30與大鼠成骨細(xì)胞、 大鼠骨肉瘤細(xì)胞和大鼠腸上皮細(xì)胞37°C賠育Ih;
[00巧]2.4離必去除上清，每管加入500U11XPBS-ImmolMgCl廠1. 25mmol/LCaCl2溶液重 懸細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)測定FAM英光強(qiáng)度。
[002引 3、L54與大鼠成骨細(xì)胞結(jié)合的平衡解離常數(shù)腳值）的測定
[0027] 將不同濃度的FAM-ssDNA與篩選祀細(xì)胞在封閉液中混勻，于37C避光共賠育 30min，洗涂、離必，棄去上清 350yl(lXPBS，1.25mmol/LCaC12,0.25mmol/LMgC12)緩沖 液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測英光強(qiáng)度值的大小，采用GraphpadPrism4軟件繪制結(jié)合曲 線，選用函數(shù)Y=BmaxxAKcWO計(jì)算適配體與祀細(xì)胞的平衡解離常數(shù)KD值
[0028] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0029] 通過英光顯微鏡和流式細(xì)胞儀的檢測均可表明L54能特異結(jié)合大鼠成骨細(xì)胞。
[0030] 由圖1、2、3可W得到結(jié)論；流式細(xì)胞儀測定結(jié)果表明FAM-L54能夠特異結(jié)合大鼠 成骨細(xì)胞，而與大鼠骨肉瘤細(xì)胞和大鼠腸上皮細(xì)胞均不發(fā)生結(jié)合，對照序列FAM-GP30與上 述幾種細(xì)胞均無結(jié)合。
[0031] 由圖4可W得到結(jié)論；L54與大鼠成骨細(xì)胞結(jié)合的平衡解離常數(shù)KD值，約為 494. 4+133. 3nmol/L
[0032] 總之，L54能夠特異識別大鼠成骨細(xì)胞，具有廣泛臨床應(yīng)用價(jià)值。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種特異識別大鼠成骨細(xì)胞的寡核苷酸配基L54的序列，其特征在于，所述的核苷 酸序列如序列表中SEQIDNo. 1所示。2. 據(jù)權(quán)利要求1中所述方法，寡核苷酸適配體L54可以是體外化學(xué)合成的，也可以是通 過PCR或其他分子生物學(xué)方法制備的。3. 據(jù)權(quán)利要求1中所述方法，寡核苷酸適配體L54的5'端或3'端可以經(jīng)FITC、生物 素、地高辛等標(biāo)記。4. 據(jù)權(quán)利要求1中所述方法，寡核苷酸適配體L54在腫瘤研究領(lǐng)域、臨床腫瘤組織切片 標(biāo)本的鑒別、腫瘤生物導(dǎo)向治療領(lǐng)域中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了屬于分子生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域的一種特異識別大鼠成骨細(xì)胞的寡核苷酸配基L54的序列和應(yīng)用。本發(fā)明設(shè)計(jì)L54特異性的序列，采用5’端或3’端修飾、標(biāo)記(如FITC、生物素或者地高辛)的方法檢測L54能夠特異識別大鼠成骨細(xì)胞。L54作為試劑盒的組成部分或者檢測指標(biāo)，用于骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎等骨代謝相關(guān)疾病的輔助診斷，骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎等骨代謝相關(guān)疾病的治療，以及用于骨代謝疾病發(fā)生、發(fā)展、進(jìn)程相關(guān)的基礎(chǔ)研究等。L54作為載體遞送藥物靶向骨代謝相關(guān)疾病靶向治療方面的應(yīng)用。本發(fā)明的方法簡單，迅速，靈敏，適用于臨床輔助診斷、骨代謝相關(guān)疾病靶向治療，具有廣泛臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12Q1/04, C12N15/115
【公開號】CN105296490
【申請?zhí)枴緾N201410347341
【發(fā)明人】邵寧生, 李慧, 李少華, 丁紅梅, 李潔, 黃皚雪, 蘇雪婷, 趙強(qiáng)
【申請人】中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2014年7月22日