采用光致穿孔的方式制備負(fù)載有外源分子細(xì)胞的方法及制備該細(xì)胞用的基材及該細(xì)胞的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)療器械改性領(lǐng)域以及納米材料領(lǐng)域，具體涉及一種在細(xì)胞培養(yǎng)基材(包括細(xì)胞培養(yǎng)板和其他可用于細(xì)胞培養(yǎng)的基材)表面修飾金納米材料(包括金納米粒子聚集體、金納米棒、金納米錐等)的試劑盒，利用近紅外波段激光輔助，實(shí)現(xiàn)對其上培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行外源大分子傳輸?shù)哪康?。該試劑盒具有簡單直接、快速、高效的特點(diǎn)，并且可應(yīng)用于不同細(xì)胞系進(jìn)行外源大分子的傳輸。
【背景技術(shù)】
[0002]基因治療和藥物傳輸可以應(yīng)用于對許多重大疾病的治療中，包括癌癥、神經(jīng)退行性疾病、血液疾病和遺傳疾病等?；蛑委熀退幬飩鬏?shù)年P(guān)鍵在于能否有效地將外源治療性分子(比如DNA、RNA、蛋白質(zhì)、藥物分子等)導(dǎo)入到目的細(xì)胞中。病毒載體雖然具有很高的傳遞效率，但安全性制約了其進(jìn)一步的應(yīng)用。目前，通常采用的手段是用陽離子脂質(zhì)體或聚合物包裹治療性大分子，通過胞吞將其傳遞到細(xì)胞中。然而，這種方法傳遞效率低，同時(shí)面臨細(xì)胞毒性的問題，并且負(fù)載的大分子進(jìn)入細(xì)胞后不能完全被載體釋放進(jìn)一步降低了其最終效率。
[0003]光致穿孔近年來受到廣泛關(guān)注，其最簡單的形式是用高強(qiáng)度的飛秒級激光脈沖照射單個(gè)細(xì)胞以提高細(xì)胞膜的通透性，但這種形式的效率很低。然而研究者發(fā)現(xiàn)，通過在細(xì)胞膜上吸附金納米粒子不僅可以大大提高效率，并且可以減低所需的激光強(qiáng)度。這主要是因?yàn)槲皆诩?xì)胞膜上的金納米粒子在激光照射下可以產(chǎn)生很大的能量，這種能量可以用來提高細(xì)胞膜的通透性。此外，金納米粒子具有優(yōu)異的生物相容性和化學(xué)反應(yīng)活性，這都為金納米粒子在光致穿孔中的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
[0004]在此專利中，我們研發(fā)了一種新型的基于金納米材料的光致穿孔試劑盒，該試劑盒能夠利用激光能量提高細(xì)胞膜通透性以實(shí)現(xiàn)外源分子的高效細(xì)胞傳輸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種新型的基于金納米材料的光致穿孔體系，該體系可以實(shí)現(xiàn)外源大分子簡單直接、快速、高效的細(xì)胞運(yùn)輸。
[0006]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的第一種技術(shù)方案為:一種采用光致穿孔的方式制備負(fù)載有外源分子的細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟:
1)采用納米金結(jié)構(gòu)修飾細(xì)胞培養(yǎng)基材；
2)在修飾過的細(xì)胞培養(yǎng)基材中培養(yǎng)細(xì)胞；
3)用近紅外波段的激光光源照射細(xì)胞適當(dāng)時(shí)間；
4)向細(xì)胞中添加需要傳遞的外源分子，然后培養(yǎng)一段時(shí)間。
[0007]本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，在步驟1)中，在細(xì)胞培養(yǎng)基材上修飾的所述納米金結(jié)構(gòu)是采用向所述細(xì)胞培養(yǎng)基材中加入鍍金液靜置的方法實(shí)現(xiàn)的。
[0008]本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述鍍金液為先配制成的含有弱堿溶質(zhì)、還原劑，氯金酸的溶液，然后用堿溶液將所述溶液pH值調(diào)節(jié)至弱堿性，即得所述鍍金液。
[0009]本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，在步驟1)中，所述鍍金液的配制是在0_10°C條件下進(jìn)行的，所述鍍金液在所述細(xì)胞培養(yǎng)基材內(nèi)的靜置是在20-60°C條件下進(jìn)行的。
[0010]本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述弱堿溶質(zhì)為碳酸氫鉀，所述還原劑為葡萄糖。
[0011]本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述鍍金液中的碳酸氫鉀、葡萄糖、氯金酸的濃度依次為:0.1-1 M，10-30 mM，5-20 mM。
[0012]本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，步驟2)中的細(xì)胞培養(yǎng)基材為培養(yǎng)板，在48孔培養(yǎng)板中，每個(gè)所述培養(yǎng)孔內(nèi)的種植細(xì)胞的密度為4-5X 104/培養(yǎng)孔。
[0013]本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，在步驟2)和步驟4)中，細(xì)胞培養(yǎng)均采用向所述培養(yǎng)孔中注入含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基的方式進(jìn)行。
[0014]本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，在步驟2 )進(jìn)行前還需要對細(xì)胞培養(yǎng)基材進(jìn)行清洗和消毒。
[0015]本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，在步驟3 )中，清洗細(xì)胞采用無菌PBS溶液。
[0016]本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，步驟4)中添加的外源分子是混合在無血清的細(xì)胞培養(yǎng)基試劑內(nèi)后添加的。
[0017]本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，步驟3)和步驟4)中的激光照射與添加外源分子的順序可以是:
先進(jìn)行激光照射，再進(jìn)行添加外源分子；或先進(jìn)行添加外源分子，再進(jìn)行激光照射。
[0018]本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，還包括使用胰蛋白酶溶液消化收獲載有外源分子的細(xì)胞的步驟。
[0019]本發(fā)明采用的第二種技術(shù)方案為:一種用于制備納米金結(jié)構(gòu)的鍍金液，其特征在于:所述鍍金液是由將弱堿溶質(zhì)、還原劑，氯金酸三種溶質(zhì)配制成的。
[0020]本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述弱堿溶質(zhì)為碳酸氫鉀，所述還原劑為葡萄糖，所述鍍金液中的碳酸氫鉀、葡萄糖、氯金酸的濃度依次為:0.1-1 M，10-30 mM，5-20 mM。
[0021]本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述鍍金液穩(wěn)定的溶液狀態(tài)條件為保持0_10°C的溫度，所述鍍金液容易形成金納米粒子聚集體的條件為保持20-60°C的溫度。
[0022]本發(fā)明采用的第三種技術(shù)方案為:一種使用金納米粒子聚集體修飾的細(xì)胞培養(yǎng)基材:所述基材為帶有若干個(gè)培養(yǎng)孔的培養(yǎng)板，其特征在于，所述培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔內(nèi)表面沉降有一層穩(wěn)定的金納米粒子聚集體。
[0023]本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述金納米粒子聚集體是由存放在所述培養(yǎng)孔內(nèi)的鍍金液在20-60°C的條件下自然沉降形成的。
[0024]本發(fā)明采用的第四種技術(shù)方案為:一種載有外源分子的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞包括:細(xì)胞本體和進(jìn)入細(xì)胞本體內(nèi)部的外源分子，所述細(xì)胞可以是外源分子直接透過細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞本體內(nèi)形成的細(xì)胞，也可以是通過內(nèi)部存在有外源分子細(xì)胞的裂變產(chǎn)生的細(xì)胞。
[0025]本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述外源分子可以是糖分子或/和蛋白質(zhì)或/和RNA或/和DNAo
[0026]本發(fā)明采用的第五種技術(shù)方案為:一種載有外源分子細(xì)胞的細(xì)胞檢測篩選方法，其特征在于，包括以下步驟:
a)在第一種技術(shù)方案的步驟4)中，將標(biāo)記試劑與所述外源分子充分混合后再向細(xì)胞添加，然后繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間，即得載有外源分子的細(xì)胞；
b)通過倒置熒光顯微鏡觀察標(biāo)記試劑進(jìn)入細(xì)胞的情況。
[0027]本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述標(biāo)記試劑為熒光素四甲基異硫氰酸羅丹明標(biāo)記的右旋糖酐分子，可以簡稱為羅丹明-右旋糖酐。
[0028]一種采用光致穿孔的方式制備負(fù)載有外源分子的細(xì)胞的方法，包括以下步驟:
(1)在o-1o°c條件下，配制含有碳酸氫鉀、葡萄糖，氯金酸的水溶液，然后用堿溶液將溶液pH調(diào)節(jié)至弱堿性；最終所得溶液中，碳酸氫鉀、葡萄糖、氯金酸的終濃度依次為:0.1-1M，10-30 mM, 5-20 mM ;以每孔300 μ L的量，將所得溶液加入到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中，然后于20-60°C下靜置3-6 h，棄去孔中溶液，再用去離子水沖洗至少2次后，即制得穩(wěn)定的金納米粒子聚集體修飾的多孔板。
[0029](2)通過試劑1 (主要成分為乙醇)浸泡對細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行消毒，之后將目的細(xì)胞以4-5X 104個(gè)/孔的密度種植到48孔板的孔中，利用試劑2 (主要成分為含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基)培養(yǎng)6-12 h使細(xì)胞在板中充分鋪展。
[0030](3)用試劑3 (主要成分為無菌PBS)清洗細(xì)胞，加入試劑4 (主要成分為無血清培養(yǎng)基)。用近紅外波段的激光光源在1-10 W/cm2功率密度范圍內(nèi)對孔中細(xì)胞照射0.5-10min0
[0031](4)激光照射完畢后，在培養(yǎng)基中迅速加入試劑4 (主要成分為含一定濃度的待傳遞外源分子的無血清培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)20 min，加入試劑5 (主要成分為血清)和試劑4至
1mL體積，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24-48 h。(當(dāng)然此步驟中，也可以是先在培養(yǎng)基中加入試劑4，然后在進(jìn)行激光照射)
(5)利用試劑6 (主要成分為0.25%的胰蛋白酶溶液)消化收獲細(xì)胞。
[0032]上述技術(shù)方案中，碳酸氫鉀、葡萄糖，氯金酸粉末均為分析純，所用溶劑水為去離子水。所述堿溶液為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的中強(qiáng)堿，不與反應(yīng)體系中物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)且能將最終溶液的pH值調(diào)節(jié)到弱堿性即可，如氫氧化鈉、氫氧化鉀或碳酸鈉。
[0033]上述技術(shù)方案中，激光的功率密度和照射時(shí)間可根據(jù)不用細(xì)胞系和待傳遞分子進(jìn)行優(yōu)化篩選。
[0034]上述技術(shù)方案中，細(xì)胞經(jīng)激光照射、外源大分子添加、血清補(bǔ)加后的繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)不同外源分子發(fā)揮功能所需的時(shí)間而定。
[0035]本發(fā)明的原理是:采用化學(xué)還原的方法生成金納米粒子并通過物理沉降作用吸附在多孔板表面形成穩(wěn)定、形貌均一的金納米粒子聚集體，這種納米金聚集層保留了金納米粒子對近紅外波段激光能量大量吸收的性質(zhì)，吸收的激光能量可用于對提高其上培養(yǎng)細(xì)胞的膜通透性，實(shí)現(xiàn)外源分子簡單直接、快速、高效的細(xì)胞運(yùn)輸；并且阻止了游離金納米粒子進(jìn)入細(xì)胞可能引發(fā)的潛在危害。
[0036]由于上述技術(shù)方案的應(yīng)用，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出特點(diǎn):
1.外源大分子不進(jìn)行陽離子脂質(zhì)體或聚合物包裹，進(jìn)入細(xì)胞后可快速發(fā)揮功能，避免了傳統(tǒng)方法中外源分子進(jìn)入細(xì)胞后不能完全被載體釋放的缺點(diǎn)，具有簡單直接的特點(diǎn)。
[0037]2.金納米粒子聚集體由大量的金納米粒子組成，具有巨大的比表面積和獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)，可大量吸收近紅外波段的激光能量，用以快速提高其上細(xì)胞膜的通透性，實(shí)