專利名稱：人類新蛋白Hunsp18及其編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、基因工程等領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一個(gè)預(yù)測的新蛋白Hunsp18及其編碼序列。
背景技術(shù)：
人類基因組計(jì)劃(human genome project HGP)是由美國科學(xué)家在1985年首先提出的。它是一項(xiàng)希望解開人類生老病死的奧秘，并徹底破解控制各種疾病基因密碼的國際科學(xué)研究工程，是人類生命科學(xué)史上最偉大的工程。
1988年，美國全國衛(wèi)生協(xié)會(huì)和能源部開始組織和實(shí)施這項(xiàng)計(jì)劃，1990年10月正式啟動(dòng)，耗資30億美元。人類只有一個(gè)基因組，大約有5萬～10萬個(gè)基因，30億個(gè)堿基對。
人類基因組工程的目標(biāo)是(1)建立一高分辨力的人體基因組圖譜。(2)建立某些選擇性模型機(jī)體(如大腸桿菌、線蟲等)的DNA和人體染色體的基因物質(zhì)圖譜。(3)測定這些人體和選擇性機(jī)體的DNA序列，以便更好了解正?；蛘{(diào)控、基因遺傳性疾病及其演化過程。(4)建立軟件和數(shù)據(jù)庫以提高應(yīng)用和判斷這些基因信息的效能。(5)發(fā)明有關(guān)的創(chuàng)新技術(shù)。(6)建立HGP的倫理學(xué)、法律和社會(huì)參與的程序。
通過國際合作，用15年時(shí)間構(gòu)建詳細(xì)的人類基因組遺傳圖和物理圖，并期望通過分析每個(gè)人類基因的功能和基因在染色體上的位置，使醫(yī)學(xué)專家們了解所有疾病的分子結(jié)構(gòu)，從而在根本上獲得治療的方法，進(jìn)而破譯人類全部遺傳信息，使人類第一次在分子水平上全面地認(rèn)識(shí)自我，最終解開人類生命的奧秘。
現(xiàn)代遺傳學(xué)家認(rèn)為，基因是DNA(脫氧核糖核酸)分子上具有遺傳效應(yīng)的特定核苷酸序列的總稱，是具有遺傳效應(yīng)的DNA分子片段?；蛭挥谌旧w上，呈線性排列?；虿粌H可以通過復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代，還可以使遺傳信息得到表達(dá)，也就是使遺傳信息以一定的方式反映到蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)上，從而使后代表現(xiàn)出與親代相似的性狀。
研究結(jié)果表明，每一條染色體都含有一個(gè)DNA分子，每個(gè)DNA分子又含有很多個(gè)基因，一個(gè)基因就是DNA分子的一部分。一個(gè)基因要有正常的生理機(jī)能，它的幾個(gè)正常組成部分一定要位于相繼鄰近的位置上，也就是說核苷酸要排成一定的次序，才能決定一種蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)。假使一個(gè)基因的幾個(gè)正常組成部分分處于兩條染色體上，理論上就是核苷酸的種類和排列改變了，這樣就會(huì)失去正常的生理機(jī)能。所以，基因不僅是一個(gè)遺傳物質(zhì)在上下代之間傳遞的基本單位，也是一個(gè)功能上獨(dú)立的單位。
幾乎每個(gè)人一生下來就帶著各種病，這可能就是人體內(nèi)的有缺陷基因造成的。這些基因在人生長的特定時(shí)期才會(huì)反應(yīng)，接下來就會(huì)表現(xiàn)出各種癥狀?？茖W(xué)家估計(jì)，在人體內(nèi)5萬～10萬個(gè)基因中，大約有30％～40％與人類疾患有關(guān)，其中有上千個(gè)基因又與腫瘤有關(guān)。因此，能破解這些基因就成為現(xiàn)代生物學(xué)的重要任務(wù)。人類基因組工程正由此產(chǎn)生。
所謂基因組是指一個(gè)細(xì)胞或病毒所攜帶的全部遺傳信息或整套基因，也就是說是細(xì)胞內(nèi)全部DNA分子的總和。人類基因組由23條染色體(人類染色體的總數(shù)是23對)上，約含30億對核苷酸的DNA分子構(gòu)成。它包括大量的重復(fù)序列、以及非編碼序列和可以編碼序列。而基因的概念是DNA分子中可以當(dāng)作模板轉(zhuǎn)錄為成熟的mRNA(也包括其它RNA)并可翻譯為具有生理功能分子的序列。我們可以這樣理解人體細(xì)胞內(nèi)的遺傳信息是基本一致的，都包含有相同的基因組DNA，其中約含有4萬個(gè)基因。但是人體每一組織、每一細(xì)胞，在不同的發(fā)育、分化階段，不同的生理?xiàng)l件和病理狀態(tài)下，其表達(dá)的基因種類以及每一基因的表達(dá)豐度都是各不相同的。這種基因表達(dá)的差別受到精密調(diào)控。生物體在不同的時(shí)空條件下，隨時(shí)調(diào)整不同的基因表達(dá)狀態(tài)，以便更好地適應(yīng)環(huán)境、維持生長和發(fā)育的需要。
在本發(fā)明公布之前，未有人對Hunsp18做公開的報(bào)道；更未有人對該蛋白的功能進(jìn)行闡述。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種新的人類蛋白多肽Hunsp18、該蛋白多肽的編碼序列、含有該編碼序列的載體及宿主細(xì)胞，以及該蛋白的抗體。
本發(fā)明的再一目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)上述的新的人Hunsp18蛋白和核酸序列的方法。
本發(fā)明的上述目的是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的在本發(fā)明的一方面，提供了一種分離的人Hunsp18蛋白多肽，所述多肽具有與SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列。優(yōu)選的，所述多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種分離的多核苷酸，它包括編碼具有人Hunsp18蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述多核苷酸具有與SEQ ID NO.1中從核苷酸397-870位的核苷酸序列有至少70％同源性的序列；或者所述的多核苷酸具有能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ IDNO.1中從核苷酸397-870位的核苷酸序列雜交的序列。優(yōu)選的，所述的多核苷酸編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。更優(yōu)的，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO.1中從核苷酸397-870位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的再一方面，還提供了一種載體，所述載體含有上述分離的多核苷酸。
在本發(fā)明的又一方面，還提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞是用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，該宿主細(xì)胞是大腸桿菌；在另一個(gè)實(shí)施例中，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
在本發(fā)明的又一方面，還提供了一種產(chǎn)生具有Hunsp18蛋白活性的多肽的方法，該方法包括如下步驟(a)將編碼具有Hunsp18蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成Hunsp18蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸397-870位的核苷酸序列有至少70％同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成Hunsp18蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)Hunsp18蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有Hunsp18蛋白活性的多肽。
優(yōu)選的，步驟(a)中所述的核苷酸序列為SEQ ID NO.1中從核苷酸397-870位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的又一方面，還提供了一種抗體，所述抗體能與上述Hunsp18蛋白的部分肽段特異性結(jié)合。
本發(fā)明還提供了一種探針分子，所述的探針分子含有上述多核苷酸中約8-100個(gè)連續(xù)的核苷酸。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA，或人工化學(xué)合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。單鏈的DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
在本發(fā)明中，“分離的”多核苷酸是指，該多核苷酸或片斷已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該多核苷酸或片斷已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
本發(fā)明中，術(shù)語“Hunsp18蛋白(或多肽)編碼序列”是指編碼具有Hunsp18蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中397-870位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的編碼框397-870位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.1中397-870位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.2所述的序列。該術(shù)語還包括在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與SEQ ID NO.1中從核苷酸397-870位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.1中從核苷酸397-870位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人Hunsp18相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常位1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常位60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語“Hunsp18蛋白多肽”是指具有HUNSP18蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人Hunsp18蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括Hunsp18蛋白的活性片斷和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與Hunsp18 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗Hunsp18多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含Hunsp18多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還提供了Hunsp18多肽的可溶性片段。通常，該片段具有Hunsp18多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供Hunsp18蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然Hunsp18多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還可以包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明還包括對Hunsp18 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的抗體，尤其是單克隆抗體。這里“特異性”是指抗體能結(jié)合于Hunsp18基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與Hunsp18基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制Hunsp18蛋白的分子，也包括那些并不影響Hunsp18蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的Hunsp18基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利NO.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的Hunsp18基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)Hunsp18或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hvbridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷Hunsp18功能的抗體以及不影響Hunsp18功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用Hunsp18基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過免疫技術(shù)獲得，這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與Hunsp18基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
本發(fā)明的Hunsp18核苷酸序列全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按已知方法制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列，這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。當(dāng)然，也可通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接而獲得序列很長的片段。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的Hunsp18編碼序列電泳圖譜；圖2是本發(fā)明實(shí)施例2的Hunsp18信號(hào)肽軟件預(yù)測結(jié)果圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例3的Hunsp18 Western blot結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件。
實(shí)施例1獲得Hunsp18蛋白的全長編碼序列根據(jù)NCBI公共數(shù)據(jù)庫的序列信息設(shè)計(jì)5’和3’端引物，以包括成人脾、心臟、腦、小腸、胸腺、肌肉、肺、睪丸、腎、肝十種cDNA的混合cDNA庫為模板，采用RT-PCR的方法獲得Hunsp18蛋白的全長編碼序列。
1.引物設(shè)計(jì)F-5’GTGAATTCATTAAGGGTAACACCA(SEQ ID NO.3)R-5’CTGGATCCAGTCTACAGTTGATCA(SEQ ID NO.4)2.RT-PCR

PCR條件94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min；35 cycles；電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得大小為637bp的DNA片段(見圖1)。
3. BamH I與EcoR I雙酶切Hunsp18的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pcDNA3.1A

37℃酶切2hr4.連接

16℃連接16hr5.轉(zhuǎn)化取5ul連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，置于冰上1h，42℃熱激90s后立即放在冰上，加入1ml不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)1h，將轉(zhuǎn)化的菌液涂于LB(Amp)板上，37℃培養(yǎng)過夜。在平板上分別挑取多個(gè)菌落作PCR鑒定。
6.質(zhì)粒提取用VIOGENE公司的質(zhì)粒抽提試劑盒提取PCR鑒定為陽性的克隆質(zhì)粒，經(jīng)核酸測序獲得Hunsp18蛋白編碼基因的核酸序列。
實(shí)施例2Hunsp18蛋白的生物信息學(xué)分析1. Hunsp18的mRNA的長度為2218bp，其中預(yù)測蛋白編碼區(qū)域位于397-870位核苷酸，它編碼157個(gè)氨基酸殘基，分子量為17883Da。核酸及蛋白序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
2.根據(jù)SOURCEhttp//genome-www5.stanford.edu/cgi-bin/source/source Search預(yù)測，Hunsp18組織分布較特異，大部分表達(dá)在骨髓中。

3.根據(jù)SignalP2.0 http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/和SMARThttp//smart.embl-heidelberg.de/預(yù)測，Hunsp18為一分泌蛋白(見圖2)。
4.根據(jù)SOSUI分析，Hunsp18蛋白含有一個(gè)轉(zhuǎn)膜螺旋區(qū)域。

實(shí)施例3Western bloting1)鋪細(xì)胞CHO細(xì)胞接種密度是1-1.5×105/35mm培養(yǎng)皿；37℃，5％CO2培養(yǎng)5-24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁；2)轉(zhuǎn)染A質(zhì)粒用量12ug，+100ul DMEM(無血清，無抗生素)，混勻；B脂質(zhì)體Lipofectamine(GibcoBRL公司)3ul-5ul，+100ul DMEM(無血清，無抗生素)，混勻；A+B，混勻，室溫靜置15-45min，一般30min；培養(yǎng)細(xì)胞去上清，用DMEM(無血清，無抗生素)洗一次，加800ul DMEM(無血清，無抗生素)，滴入轉(zhuǎn)染混合液，搖勻；37℃，5％CO2培養(yǎng)5-24小時(shí)，換液為DMEM(10％FCS)，繼續(xù)培養(yǎng)至總轉(zhuǎn)染時(shí)間為48-72小時(shí)。
3)樣品處理上清收集細(xì)胞培養(yǎng)盤中的上清，13000rpm，8min。收集離心上清，取200ul純化。
細(xì)胞用PBS(pH7.4)2ml洗盤中細(xì)胞兩次，加200ul裂解緩沖液，冰上20分鐘裂解。然后刮下細(xì)胞，將裂解液于4℃離心12000rpm，8min，回收上清，進(jìn)行純化。
TALON樹脂預(yù)處理將1體積的TALON樹脂貯存液于5000rpm離心5分鐘，去上清，用1×E/W緩沖液洗兩次，然后加等體積的1×E/W緩沖液得到50％的樹脂混合液。
樣品純化在樣品中加入適量的預(yù)處理過的50％Slurry，加入800ul1×E/W緩沖液，4℃結(jié)合2小時(shí)。8000rpm離心5分鐘去上清，用1×E/W緩沖液洗3-4次，去除非特異結(jié)合的蛋白。
4)蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜常規(guī)蛋白電泳分離樣品；15％分離膠，60V 30min，160V 1hr20min。
濕法轉(zhuǎn)膜1hr，電壓110V。
5)膜的封閉3％脫脂牛奶/2％BSA/PBST 50ml，水平搖床，室溫封閉4小時(shí)6)一抗(鼠抗人C-Myc 9E10)用封閉液稀釋一抗，鼠抗人C-myc 9E10(200ng/ul)稀釋倍數(shù)1000倍；將膜完全沒于一抗稀釋液中。
水平搖床，室溫2小時(shí)，也可過夜。
PBST室溫洗3*10分鐘7)二抗(HRP-羊抗鼠IgG)用封閉液稀釋二抗，10000倍稀釋；水平搖床，室溫2小時(shí)；PBST室溫洗3*10分鐘8)檢測將檢測試劑(ECL plus)A液與B液以40∶1的比例混合，用量為0.1ml/cm2；膜置于吸水紙上干燥，蛋白面朝上，檢測試劑加在膜上，覆蓋整個(gè)膜表面，室溫放置2分鐘；用鑷子夾起PVDF膜，使膜的下邊角搭在紙巾上，吸干多余的檢測試劑；膜用保鮮膜封起，暗室曝光(見圖3)。
由Western bloting圖可以看到Hunsp18-pcDNA3.1質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)宿主CHO細(xì)胞，其蛋白僅表達(dá)細(xì)胞裂解液中，在培養(yǎng)基中卻不表達(dá)。至于該蛋白是否為分泌蛋白，有待于穩(wěn)定柱建立后進(jìn)一步驗(yàn)證。
實(shí)施例4Hunsp18蛋白CHO穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建1.2μg真核表達(dá)質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞(35mm培養(yǎng)皿)，培養(yǎng)12小時(shí)；2.消化至100mm培養(yǎng)皿，加G418至終濃度1000μg/ml(CHO)，培養(yǎng)2-3星期直至有克隆形成；3.吸去培養(yǎng)皿內(nèi)的培液，PBS洗兩次，胰酶浸泡過的無菌濾紙片覆蓋于克隆上，消化數(shù)分鐘后轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)獲得穩(wěn)定細(xì)胞株。
實(shí)施例5Hunsp18蛋白肽段的表達(dá)1.原核表達(dá)載體的構(gòu)建1)引物設(shè)計(jì)F-5’GTGAATTCATGTCGAAAAGCTGTG(SEQ ID NO.5)R-5’TTCTCGAGCTAATATGAATCTGGA(SEQ ID NO.6)2)如常規(guī)方法酶切，連接，轉(zhuǎn)化，抽質(zhì)粒，酶切鑒定。
2. Hunsp18蛋白的原核表達(dá)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了大腸桿菌BL21菌株；挑單克隆接種于5mlLB(Amp)培養(yǎng)基中，37℃搖床300rpm過夜；取500ul菌液接種于50mlLB(Amp)中，37℃搖床300rpm培養(yǎng)2hr；加入0.5mMIPTG誘導(dǎo)，28℃搖床200rpm培養(yǎng)2hr，4hr，6hr；8000rpm，4℃離心10min，去上清，加入預(yù)冷的PBS重懸；冰浴超聲裂解細(xì)胞成勻漿；SDS-PAGE電泳檢測。
序列表<110>上海人類基因組研究中心<120>人類新蛋白Hunsp18及其編碼序列<130>NP-1414<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>2218<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(397)..(870)<400>1gtaaaagaac aaaagagaga gcttgacaca ccaatcttga ggtgttgtgc cattctctgg 60gaacatacag atgaaatgac ctgaaccctg cccaccattt aaccaaaaaa ggaagtggaa120tggaataaaa tcccccaata cagtacaatt atacattaat ggctgtaatg tgaagagcat180cacacacgaa gagagccatc ttccagaaat aagtttatac actctctcct ctaattgcat240caggacttta ccagataatg ttcttccaga tctgaaaagg aaaatgctta aaagagcttc300caaactcatt tttgaataat actaggctac aaagaattac actgtgaatt cattaagggt360aacaccaaac cactaaacag cactgtttgt acagaa atg tcg aaa agc tgt gga 414Met Ser Lys Ser Cys Gly1 5aat aat tta gcg gcc att tct gta gga att tcg ctt ctt tta ctc tta 462Asn Asn Leu Ala Ala Ile Ser Val Gly Ile Ser Leu Leu Leu Leu Leu10 15 20gtg gtt tgt gga att ggg tgt gtt tgg cac tgg aaa cac cgt gtt gcc 510Val Val Cys Gly Ile Gly Cys Val Trp His Trp Lys His Arg Val Ala25 30 35
aca cga ttt acc tta ccg agg ttt tta caa agg aga agc agc agg aga 558Thr Arg Phe Thr Leu Pro Arg Phe Leu Gln Arg Arg Ser Ser Arg Arg40 45 50aaa gtc tgt act aaa aca ttc ttg ggc ccc cgc atc att ggc tta agg 606Lys Val Cys Thr Lys Thr Phe Leu Gly Pro Arg Ile Ile Gly Leu Arg55 60 65 70cat gaa atc tca gtt gaa acc caa gac cac aaa tct gct gtc agg gga 654His Glu Ile Ser Val Glu Thr Gln Asp His Lys Ser Ala Val Arg Gly75 80 85aat aac aca cac gac aac tat gaa aat gtg gaa gca ggt cct ccc aaa 702Asn Asn Thr His Asp Asn Tyr Glu Asn Val Glu Ala Gly Pro Pro Lys90 95 100gct aaa gga aaa acc gat aag gaa cta tat gaa aac aca ggg cag tct 750Ala Lys Gly Lys Thr Asp Lys Glu Leu Tyr Glu Asn Thr Gly Gln Ser105 110 115aat ttc gag gag cat atc tat gga aat gag aca tct tct gac tat tat 798Asn Phe Glu Glu His Ile Tyr Gly Asn Glu Thr Ser Ser Asp Tyr Tyr120 125 130aac ttc cag aag cct cgt cct tct gaa gtt cct caa gat gaa gat ata 846Asn Phe Gln Lys Pro Arg Pro Ser Glu Val Pro Gln Asp Glu Asp Ile135 140 145 150tac att ctt cca gat tca tat tag cttttcaaaa tattgacttt tgttattggg 900Tyr Ile Leu Pro Asp Ser Tyr155tgataaatat tcactgtaat ttttcaacag caaagacaag gaatcaaact aaatgttgat960caactgtaga ctggataaag aaaatgtggt acacatacac catagaatat tatgcagccg 1020taaaaaaaga acaaaactaa catgggaaca gaaaatcaaa taccacatat tctcacttaa 1080aagtgggagc taaataataa gaacacatgg agagaaggag aggaacaaca gacactgggg 1140cctacttgag ggaggacagt ggaaggaggg agaggttcag ggaaaaaaaa aatatcaggt 1200actatgctta gtacacacat gatgaaataa tctgtacacc aaacccccaa gtcacaagtg 1260ttcctacata acaaacctga acatgtaccc ctgaacataa aattataatt aaaatattaa 1320
aaataattca ctgtgatttt tatggtactg atgccattct taatcaagtt ctgataagtg1380gatggtctct gcctatctcc acctttctga atcctatgtg tatcactgtg gattaattct1440agatatcttc tccaccctcc ttgcaccaga ctaaatctgt attatgtgat attgattctt1500ccttctaaat attacccgtt atctctttcc tttatttcta ccattatctt tatctggctc1560agaattattg tcataggctc ctaactgttc ctcctgcttc tagtttctac ccactcaatc1620aattaccgat ggtgttgcca gatttatctt cagaaaatat tcctaacagc cacattattt1680ctttcactta aaatgtttta atgccccctc tttgcaaaag acataatacc cataatttga1740actccaaaat ttatggtttt ccacaattgg ttccaattca cttttccagt gacttctctt1800actatctctc atttctttgc cttcagcaga atcatcttaa aacctgccaa acttatcctt1860ccttcacagc tttgcttttc tgcctcttct ctcaagcctg cttcagatca taagttcttc1920cacacatctc ctgaatcact ccaaacccgc atttaccttt ttattttctg atataagctt1980tgatgcctct tcaattctta ggacatttaa acatatgaat gttgccacag cattttatta2040cctagcttca tatgaaaatg tcttaaattc ccacctaaat gaaaagaaac tgcccaaatg2100cctagaacat cacataaggc actaaatgcc tcatgtttta ctgacgggaa ttgaattgta2160cattttgctg agtagttttg agaaaaaaat ctaataaatt catctgttat tcatccat 2218<210>2<211>157<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Ser Lys Ser Cys Gly Asn Asn Leu Ala Ala Ile Ser Val Gly Ile1 5 10 15Ser Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Cys Gly Ile Gly Cys Val Trp His20 25 30
Trp Lys His Arg Val Ala Thr Arg Phe Thr Leu Pro Arg Phe Leu Gln35 40 45Arg Arg Ser Ser Arg Arg Lys Val Cys Thr Lys Thr Phe Leu Gly Pro50 55 60Arg Ile Ile Gly Leu Arg His Glu Ile Ser Val Glu Thr Gln Asp His65 70 75 80Lys Ser Ala Val Arg Gly Asn Asn Thr His Asp Asn Tyr Glu Asn Val85 90 95Glu Ala Gly Pro Pro Lys Ala Lys Gly Lys Thr Asp Lys Glu Leu Tyr100 105 110Glu Asn Thr Gly Gln Ser Asn Phe Glu Glu His Ile Tyr Gly Asn Glu115 120 125Thr Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Phe Gln Lys Pro Arg Pro Ser Glu Val130 135 140Pro Gln Asp Glu Asp Ile Tyr Ile Leu Pro Asp Ser Tyr145 150 155<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3gtgaattcat taagggtaac acca 24
<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4ctggatccag tctacagttg atca 24<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5gtgaattcat gtcgaaaagc tgtg 24<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6ttctcgagct aatatgaatc tgga 2權(quán)利要求
1.一種分離的人Hunspl8蛋白多肽，其特征在于，所述多肽具有與SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列。
2.如權(quán)利要求1所述的一種分離的人Hunspl8蛋白多肽，其特征在于，所述多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包括編碼具有人Hunspl8蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述多核苷酸具有與SEQ ID NO.1中從核苷酸397-870位的核苷酸序列有至少70％同源性的序列；或者所述的多核苷酸具有能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸397-870位的核苷酸序列雜交的序列。
4.如權(quán)利要求3所述的一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。
5.如權(quán)利要求3所述的一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸具有SEQ IDNO.1中從核苷酸397-870位的核苷酸序列。
6.一種載體，其特征在于，所述載體含有權(quán)利要求3所述的分離的多核苷酸。
7.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.一種產(chǎn)生具有Hunspl8蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(a)將編碼具有Hunspl8蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成Hunspl8蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸397-870位的核苷酸序列有至少70％同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成Hunspl8蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)Hunspl8蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有Hunspl8蛋白活性的多肽。
9.一種抗體，其特征在于，所述抗體是能與權(quán)利要求1所述的Hunspl8蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
10.一種探針分子，其特征在于，所述的探針分子含有權(quán)利要求1所述的多核苷酸中約8-100個(gè)連續(xù)的核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的人類蛋白多肽Hunsp18、該蛋白多肽的編碼序列、含有該編碼序列的載體及宿主細(xì)胞。本發(fā)明還公開了一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)上述的新的人Hunsp18蛋白和核酸序列的方法。
文檔編號(hào)C07K14/47GK1749271SQ20041006639
公開日2006年3月22日 申請日期2004年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月15日
發(fā)明者祁佳, 張海擴(kuò), 趙斌, 黃健, 韓澤廣 申請人:上海人類基因組研究中心