專利名稱：新的人的類谷氧化蛋白及其編碼序列的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領域，具體地說，本發(fā)明描述了一種新的多肽一人的類谷氧化蛋白(human glutaredoxin-Bio36，簡稱為“hGRX-Bio36”)，以及編碼此多肽的多核苷酸序列。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的制備方法和應用。
谷氧化蛋白(glutaredoxin，GRX)又稱為硫基轉(zhuǎn)移酶(thioltransferase)，是氧化還原蛋白大家族的成員之一，它是一種小分子量的蛋白質(zhì)，廣泛存在于原核生物和真核生物體內(nèi)。編碼谷氧化蛋白(GRX)的基因中都含有下述一段保守的活性序列“-Cys-Pro-Try-Cys-”。
通過電泳遷移率變動分析，已知道野生型谷氧化蛋白(非重組后獲得的GRX)，可通過二酰胺的被氧化而修復一種轉(zhuǎn)錄因子PEBP2的DNA結(jié)合活性，并與硫氧化蛋共同對PEBP2的DNA結(jié)合活性進行氧化還原調(diào)節(jié)(Nakamura T，et al，F(xiàn)ree Radic Res1999 Oct；31(4)357-65)。通過對鼠體內(nèi)的谷氧化蛋白(GRX)進行表達研究發(fā)現(xiàn)，谷氧化蛋白(GRX)還具有細胞防范氧化應激的重要功能。編碼谷氧化蛋白GRX的基因能在鼠的大腦神經(jīng)元細胞、內(nèi)皮細胞、伸長細胞和室管膜細胞內(nèi)表達而獲得GRXmRNA和谷氧化蛋白(GRX)，其中在海馬CA3區(qū)域的錐形神經(jīng)細胞內(nèi)表達最高，當中腦的動脈阻塞時，GRX mRNA的表達即下降。通過對谷氧化蛋白(GRX)進行免疫組織化學分析，發(fā)現(xiàn)大腦半球的局部缺血和神經(jīng)細胞的損傷都可導致GRX的表達即下降(Takagi Y，et al，Biochem Biophys Res Commun 1999 May 10；258(2)390-4)。
此外，谷氧化蛋白(GRX)作為一種細胞抗氧化劑，在人體卵巢的黃體細胞排卵循環(huán)過程扮演著重要的角色(Garcia-Pardo L，et al.Mol Hum Reprod 1999Oct；5(10)914-919)。
因此，以治療為目的的研究和開發(fā)谷氧化蛋白(GRX)多肽及其抗體、興奮劑、抑制劑，在生理學、藥理學上有著重要意義。
本發(fā)明的一個目的是提供分離的新的多肽——人的類谷氧化蛋白(簡稱為“hGRX-Bio36”)以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一個目的是提供編碼該多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一個目的是提供含有編碼人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的多核苷酸的重組載體。
本發(fā)明的另一個目的是提供含有編碼人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的多核苷酸的基因工程化宿主細胞。
本發(fā)明的另一個目的是提供生產(chǎn)人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供針對本發(fā)明的多肽——人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的抗體。
本發(fā)明的另一個目的是提供了針對本發(fā)明多肽——人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的模擬化合物、拮抗劑、激動劑、抑制劑。
本發(fā)明的另一個目的是提供診斷和治療與人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)異常相關的疾病的方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)，該多肽是人源的，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物、類似物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供分離的編碼這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中16-999位的序列；和(b)具有SEQ ID NO1中1-2265位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的宿主細胞。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
如本發(fā)明所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)”是指人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領域的技術(shù)人員能用標準的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)多肽的純度能用氨基酸序列分析。
本發(fā)明提供了一種新的多肽——人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)，其基本上是由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列組成的。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的片段、衍生物和類似物。如本發(fā)明所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明多肽的片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列)。根據(jù)本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術(shù)人員公知的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明還提供了分離的編碼本發(fā)明hGRX-Bio36的核酸(多核苷酸)。在一個實例中，該核酸基本由編碼具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽的多核苷酸組成。較佳地，本發(fā)明的多核苷酸序列包括SEQ ID NO1的核苷酸序列，該多核苷酸是從人胎腦組織的cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)的。它包含的多核苷酸序列全長為2265個堿基，其開放讀框(16-999位)編碼327個氨基酸的hGRX-Bio36。根據(jù)氨基酸序列同源比較發(fā)現(xiàn)，此多肽與線蟲C.Elegans染色體III上的Z46787有51％的同源性，且編碼該多肽的cDNA序列含有GRX基因家族的保守堿基，可推斷出該新的人谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)具有GRX家族相似的結(jié)構(gòu)和功能。本發(fā)明hGRX-Bio36的cDNA序列同時還含有C3HC4型鋅指蛋白(環(huán)指結(jié)構(gòu))基因的保守堿基，因此可能含有鋅指蛋白的部分功能。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本發(fā)明所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ IDNO2的蛋白質(zhì)或多肽，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只有成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”是指包括編碼此多肽的多核苷酸和包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一種多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的多核苷酸(兩個序列之間具有至少50％，優(yōu)選具有70％的相同性)。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時添加變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好是97％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的核酸片段。如本發(fā)明所用，”核酸片段”的長度至少含10個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段也可用于核酸的擴增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的多核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的編碼人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的特異的多核苷酸序列能用多種方法獲得。例如，用本領域熟知的雜交技術(shù)分離多核苷酸。這些技術(shù)包括但不局限于1)用探針與基因組或cDNA文庫雜交以檢出同源的多核苷酸序列，和2)表達文庫的抗體篩選以檢出具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆的多核苷酸片段。
本發(fā)明的DNA片段序列也能用下列方法獲得1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；2)化學合成DNA序列以獲得所述多肽的雙鏈DNA。
上述提到的方法中，分離基因組DNA最不常用。DNA序列的直接化學合成是經(jīng)常選用的方法。更經(jīng)常選用的方法是cDNA序列的分離。分離感興趣的cDNA的標準方法是從高表達該基因的供體細胞分離mRNA并進行逆轉(zhuǎn)錄，形成質(zhì)?；蚴删wcDNA文庫。提取mRNA的方法已有多種成熟的技術(shù)，試劑盒也可從商業(yè)途徑獲得(Qiagene)。而構(gòu)建cDNA文庫也是通常的方法(Sambrook，et al.，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。還可得到商業(yè)供應的cDNA文庫，如Clontech公司的不同cDNA文庫。當結(jié)合使用聚合酶鏈反應技術(shù)時，即使極少的表達產(chǎn)物也能克隆。
可用常規(guī)方法從這些cDNA文庫中篩選本發(fā)明的基因。這些方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(2)標志基因功能的出現(xiàn)或喪失；(3)測定人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)轉(zhuǎn)錄本的水平；(4)通過免疫學技術(shù)或測定生物學活性，來檢測基因表達的蛋白產(chǎn)物。上述方法可單用，也可多種方法聯(lián)合應用。
在第(1)種方法中，雜交所用的探針是與本發(fā)明的多核苷酸的任何一部分同源，其長度至少10個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸。此外，探針的長度通常在2000個核苷酸之內(nèi)，較佳的為1000個核苷酸之內(nèi)。此處所用的探針通常是在本發(fā)明的基因序列信息的基礎上化學合成的DNA序列。本發(fā)明的基因本身或者片段當然可以用作探針。DNA探針可用放射性同位素、熒光素或酶(如堿性磷酸酶)等進行標記。
在第(4)種方法中，檢測人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)基因表達的蛋白產(chǎn)物可用免疫學技術(shù)如Western印跡法，放射免疫沉淀法，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。
應用PCR技術(shù)擴增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)。用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的多核苷酸序列信息適當?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本發(fā)明的基因或其各種DNA片段的核苷酸序列，可用常規(guī)方法如雙脫氧鏈終止法(Sanger et al.PNAS，1977，745463-5467)測定。這類多核苷酸序列測定也可用商業(yè)測序試劑盒。為了獲得全長的cDNA序列，測序需反復進行。有時需要測定多個克隆的cDNA序列，才能拼接成全長的cDNA序列。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或直接用人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
本發(fā)明中，編碼人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的多核苷酸序列可插入到載體中，以構(gòu)成含有本發(fā)明所述多核苷酸的重組載體。術(shù)語“載體”指本領域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7啟動子的表達載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體?？傊灰茉谒拗黧w內(nèi)復制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用于構(gòu)建重組表達載體。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起始點、啟動子、標記基因和翻譯調(diào)控元件。
本領域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含編碼人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控元件的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.MolecularCloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體的PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細胞或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子等。在載體中插入增強子序列將會使其在高等真核細胞中的轉(zhuǎn)錄得到增強。增強子是DNA表達的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉(zhuǎn)錄?？膳e的例子包括在復制起始點晚期一側(cè)的100到270個堿基對的SV40增強子、在復制起始點晚期一側(cè)的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性等。
本領域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體/轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(如啟動子、增強子等)和選擇性標記基因。
本發(fā)明中，編碼人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的多核苷酸或含有該多核苷酸的重組載體可轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導入宿主細胞，以構(gòu)成含有該多核苷酸或重組載體的基因工程化宿主細胞。術(shù)語“宿主細胞”指原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；細菌細胞如鼠傷寒沙門氏菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞如果蠅S2或Sf9；動物細胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤細胞等。
用本發(fā)明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是用MgCl2進行處理。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，或者常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組的人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
在步驟(2)中，根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在步驟(3)中，重組多肽可包被于細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術(shù)人員所熟知的。這些方法包括但并不限于常規(guī)的復性處理、蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲波處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
本發(fā)明的多肽以及該多肽的拮抗劑、激動劑和抑制劑可直接用于疾病治療，例如，可治療生殖系統(tǒng)疾病、心血管疾病、神經(jīng)細胞損傷和免疫系統(tǒng)紊亂所引起的疾病等。
谷氧化蛋白hGRX-Bio36GRX特別優(yōu)選于治療大腦神經(jīng)細胞對抗氧化應激和調(diào)節(jié)治療卵巢黃體代謝紊亂引起疾病。
本發(fā)明也提供了篩選化合物以鑒定提高(激動劑)或阻遏(拮抗劑)人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的藥劑的方法。激動劑提高人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)刺激細胞增殖等生物功能，而拮抗劑阻止和治療與細胞過度增殖有關的紊亂如各種癌癥。例如，能在藥物的存在下，將哺乳動物細胞與標記的本發(fā)明蛋白一起培養(yǎng)。然后測定藥物提高或阻遏本發(fā)明蛋白的能力。
人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的拮抗劑包括篩選出的抗體、化合物、受體缺失物和類似物等。人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的拮抗劑可以與人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)多肽結(jié)合并消除其功能，或是抑制該多肽的產(chǎn)生，或是與該多肽的活性位點結(jié)合使該多肽不能發(fā)揮生物學功能。
在篩選作為拮抗劑的化合物時，可以將人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)加入生物分析測定中，通過測定化合物對人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)和其受體之間相互作用的影響來確定化合物是否是拮抗劑。用上述篩選化合物的同樣方法，可以篩選出起拮抗劑作用的受體缺失物和類似物。能與人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，一般應對人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)分子進行標記。
本發(fā)明提供了用多肽，及其片段、衍生物、類似物或它們的細胞作為抗原以生產(chǎn)抗體的方法。這些抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā)明還提供了針對人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)抗原決定簇的抗體。這些抗體包括(但不限于)多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達文庫產(chǎn)生的片段。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)直接注射免疫動物(如家兔，小鼠，大鼠等)的方法得到。有多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。制備人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的單克隆抗體的技術(shù)包括但不限于雜交瘤技術(shù)(Kohler and Milstein.Nature，1975，256495-497)，三瘤技術(shù)，人B-細胞雜交瘤技術(shù)，EBV-雜交瘤技術(shù)等。將人恒定區(qū)和非人源的可變區(qū)結(jié)合的嵌合抗體可用已有的技術(shù)生產(chǎn)(Morrison et al，PNAS，1985，816851)。而已有的生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(U.S.Pat No.4946778)也可用于生產(chǎn)抗人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的單鏈抗體。
抗人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的抗體可用于免疫組織化學技術(shù)中，檢測活檢標本中的人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)。
與人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)結(jié)合的單克隆抗體也可用放射性同位素標記，注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。這種放射性標記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于腫瘤細胞的定位和判斷是否有轉(zhuǎn)移。
抗體還可用于設計針對體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)陽性的細胞。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預防與人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)相關的疾病。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的產(chǎn)生或活性。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)水平，可以用作解釋人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)在各種疾病中的重要性和用于診斷人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)起作用的疾病。
本發(fā)明的多肽還可用作肽譜分析，例如，多肽可用物理的、化學或酶進行特異性切割，并進行一維或二維或三維的凝膠電泳分析，更好的是進行質(zhì)譜分析。
編碼人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的多核苷酸也可用于多種治療目的。基因治療技術(shù)可用于治療由于人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的無表達或異常/無活性表達所致的細胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設計用于表達變異的人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)，以抑制內(nèi)源性的人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)活性。例如，一種變異的人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)可以是縮短的、缺失了信號傳導功能域的人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)，雖可與下游的底物結(jié)合，但缺乏信號傳導活性。因此重組的基因治療載體可用于治療人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)表達或活性異常所致的疾病。來源于病毒的表達載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用于將編碼人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的多核苷酸轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)。構(gòu)建攜帶編碼人谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的多核苷酸的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook，etal.)。另外重組編碼人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的多核苷酸可包裝到脂質(zhì)體中然后再轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)。
多核苷酸導入組織或細胞內(nèi)的方法包括將多核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內(nèi)等。
抑制人的類谷氧化蛋白hGRX-Bio36 mRNA的寡核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交后進行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術(shù)獲得，如固相磷酸酰胺化學合成法合成寡核苷酸的技術(shù)已廣泛應用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側(cè)的序列長度，核糖核苷之間的連接應用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
編碼人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的多核苷酸可用于診斷與人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)相關的疾病。編碼人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的多核苷酸可用于檢測人谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的表達與否或在疾病狀態(tài)下人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的異常表達。如編碼人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的DNA序列可用于對活檢標本進行雜交以判斷人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的表達狀況。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(Microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)基因的突變也可用于診斷人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)相關的疾病。人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)突變的形式包括與正常野生型人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發(fā)明的序列對染色體鑒定也是有價值的。該序列會特異性地針對某條人染色體具體位置且并可以與其雜交。目前，需要鑒定染色體上的各基因的具體位點。然而，現(xiàn)在只有很少的基于實際序列數(shù)據(jù)(重復多態(tài)性)的染色體標記物可用于標記染色體位置。根據(jù)本發(fā)明，為了將這些序列與疾病相關基因相關聯(lián)，其重要的第一步就是將這些DNA序列定位于染色體上。
簡而言之，根據(jù)cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細胞雜合細胞。只有那些含有相應于引物的人基因的雜合細胞會產(chǎn)生擴增的片段。
體細胞雜合細胞的PCR定位法，是將DNA定位到具體染色體的快捷方法。使用本發(fā)明的寡核苷酸引物，通過類似方法，可利用一組來自特定染色體的片段或大量基因組克隆而實現(xiàn)亞定位?？捎糜谌旧w定位的其它類似策略包括原位雜交、用標記的流式分選的染色體預篩選和雜交預選，從而構(gòu)建染色體特異的cDNA庫。
將cDNA克隆與中期染色體進行熒光原位雜交(FISH)，可以在一個步驟中精確地進行染色體定位。此技術(shù)的綜述，參見Verma等，Human Chromosomesa Manualof Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦序列被定位到準確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritancein Man(可通過與Johns Hopkins University Welch Medical Library聯(lián)機獲得)。然后可通過連鎖分析，確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關系。
接著，需要測定患病和未患病個體間的cDNA或基因組序列差異。如果在一些或所有的患病個體中觀察到某突變，而該突變在任何正常個體中未觀察到，則該突變可能是疾病的病因。比較患病和未患病個體，通常涉及首先尋找染色體中結(jié)構(gòu)的變化，如從染色體水平可見的或用基于cDNA序列的PCR可檢測的缺失或易位。根據(jù)目前的物理作圖和基因定位技術(shù)的分辨能力，被精確定位至與疾病有關的染色體區(qū)域的cDNA，可以是50至500個潛在致病基因間之一種(假定1兆堿基作圖分辨能力和每20kb對應于一個基因)。
可以將本發(fā)明的多肽、多核苷酸及其模擬物、激動劑、拮抗劑和抑制劑與合適的藥物載體組合后使用。這些載體可以是水、葡萄糖、乙醇、鹽類、緩沖液、甘油以及它們的組合。組合物包含安全有效量的多肽或拮抗劑以及不影響藥物效果的載體和賦形劑。這些組合物可以作為藥物用于疾病治療。
本發(fā)明還提供含有一種或多種容器的藥盒或試劑盒，容器中裝有一種或多種本發(fā)明的藥用組合物成分。與這些容器一起，可以有由制造、使用或銷售藥品或生物制品的政府管理機構(gòu)所給出的指示性提示，該提示反映出生產(chǎn)、使用或銷售的政府管理機構(gòu)許可其在人體上施用。此外，本發(fā)明的多肽可以與其它的治療化合物結(jié)合使用。
藥物組合物可以以方便的方式給藥，如通過局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或皮內(nèi)的給藥途徑。人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)以有效地治療和/或預防具體的適應癥的量來給藥。施用于患者的人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的量和劑量范圍將取決于許多因素，如給藥方式、待治療者的健康條件和診斷醫(yī)生的判斷。
下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。


圖1是本發(fā)明人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)和線蟲C.elegans染色體上的Z46787的氨基酸序列同源性比較圖。上方序列是本發(fā)明的人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)，下方序列是Z46787。相同氨基酸在兩個序列間用單字符氨基酸表示，相似氨基酸用“+”表示。
圖2為分離的人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖(SDS-PAGE)。36kDa為蛋白質(zhì)的分子量。箭頭所指為分離出的蛋白條帶。
實施例下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的克隆用異硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎腦總RNA。用Quick mRNA分離試劑盒(Qiegene公司產(chǎn)品)從總RNA中分離poly(A)mRNA。2ug poly(A)mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA。用Smart cDNA克隆試劑盒(購自Clontech)將cDNA片段定向插入到pBSK(+)載體(Clontech公司產(chǎn)品)的多克隆位點上，轉(zhuǎn)化DH5α，細菌形成cDNA文庫。用DyeTerminate Cycle Reaction測序試劑盒(Perkin-Elmer公司產(chǎn)品)和ABI 377自動測序儀(Perkin-Elmer公司)測定所有克隆的5’和3’末端的序列。將測定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數(shù)據(jù)庫(Genbank)進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中一個克隆0945c09的cDNA序列為新的DNA。通過合成一系列引物對該克隆所含的插入cDNA片段進行雙向測定。結(jié)果表明，0945c09克隆所含的全長cDNA為2265bp(如SEQ ID NO1所示)，從第16bp至999bp有一個983bp的開放閱讀框架(ORF)，編碼一個新的蛋白質(zhì)(如SEQ ID NO2所示)。此克隆被命名為pBS-0945c09，編碼的蛋白質(zhì)命名為人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)。
實施例2cDNA克隆的同源檢索將本發(fā)明的人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的序列及其編碼的蛋白序列，用Blast程序(Basiclocal Alignment search tool)[Altschul，SF et al.J.Mol.Biol.1990；215403-10]，在Genbank、Swissport等數(shù)據(jù)庫進行同源檢索。與本發(fā)明的人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)同源性最高的基因是一種已知的線蟲染色體III上的一段基因，其編碼的蛋白在Genbank的準入號為Z46787，該線蟲蛋白類似于谷氧化蛋白，并且具有C3H4型鋅指。兩者的蛋白質(zhì)同源結(jié)果示于圖1，兩者高度同源，其相同性為51％；相似性為69％。
實施例3用RT-PCR方法克隆編碼人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的基因用胎腦細胞總RNA為模板，以oligo-dT為引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA，用Qiagene的試劑盒純化后，用下列引物進行PCR擴增引物15’-GGGCGAGCCG TGAAGATGGC-3’(SEQ ID NO3)引物25’-CCATCTTCAC GGCTCGCCC-3’(SEQ ID NO4)引物1對應于位于SEQ ID NO1的5’端的第lbp開始的正向序列；引物2對應于SEQ ID NO1的3’端反向序列。
擴增反應的條件在50μl的反應體積中含有50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司產(chǎn)品)。在PE9600型DNA熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer公司)上按下列條件反應25個周期94℃ 30sec；55℃ 30sec；72℃ 2min。在RT-PCR時同時設β-肌動蛋白為陽性對照和模板空白為陰性對照。擴增產(chǎn)物用QIAGEN公司的試劑盒純化，用TA克隆試劑盒連接到pCR載體上(Invitrogen公司產(chǎn)品)。DNA序列分析結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的DNA序列與SEQ ID NO1所示的1-2265bp完全相同。
實施例4Northern印跡法分析人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)基因的表達用一步法提取總RNA[Anal.Biochem 1987，162，156-159]。該法包括酸性硫氰酸胍苯酚-氯仿抽提。即用4M異硫氰酸胍-25mM檸檬酸鈉，0.2M乙酸鈉(pH4.0)對組織進行勻漿，加入1倍體積的苯酚和1/5體積的氯仿-異戊醇(49∶1)，混合后離心。吸出水相層，加入異丙醇(0.8體積)并將混合物離心得到RNA沉淀。將得到的RNA沉淀用70％乙醇洗滌，干燥并溶于水中。用20μg RNA，在含20mM 3-(N-嗎啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸鈉-1mM EDTA-2.2M甲醛的1.2％瓊脂糖凝膠上進行電泳。然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用α-32P dATP通過隨機引物法制備32P-標記的DNA探針。所用的DNA探針為圖1所示的PCR擴增的人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)編碼區(qū)序列(16bp至999bp)。將32p-標記的探針(約2×106cpm/ml)與轉(zhuǎn)移了RNA的硝酸纖維素膜在一溶液中于42℃雜交過夜，該溶液包含50％甲酰胺-25mM KH2PO4(pH7.4)-5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鮭精DNA。雜交之后，將濾膜在1×SSC-0.1％SDS中于55℃洗30min。然后，用Phosphor Imager進行分析和定量。
實例5重組人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的體外表達、分離和純化根據(jù)SEQ ID NO1和圖1所示的編碼區(qū)序列，設計出一對特異性擴增引物，序列如下引物35-GGGCCCATGGCGGCAGTGGTGGAG-3(SEQ ID No5)引物45-CATATGCCAGGATGTAGTTGATGCC-3(SEQ ID No6)此兩段引物的5’端分別含有ApaI和NdeI酶切位點，其后分別為目的基因5’端和3’端的編碼序列，ApaI和NdeI酶切位點相應于表達載體質(zhì)粒pET-28b(+)(Novagen公司產(chǎn)品，Cat.No.69865.3)上的選擇性內(nèi)切酶位點。以含有全長目的基因的pBS-0945c09質(zhì)粒為模板，進行PCR反應。PCR反應條件為總體積50μl中含pBS-0945c09質(zhì)粒10pg、引物-3和引物-4分別為10pmol、Advantagepolymerase Mix(Clontech公司產(chǎn)品)1μl。循環(huán)參數(shù)94℃20s，60℃30s，68℃2min，共25個循環(huán)。用NcoI和BamHI分別對擴增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-28(+)進行雙酶切，分別回收大片段，并用T4連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化用氯化鈣法大腸桿細菌DH5α，在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB平板培養(yǎng)過夜后，用菌落PCR方法篩選陽性克隆，并進行測序。挑選序列正確的陽性克隆(pET-0945c09)用氯化鈣法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plySs(Novagen公司產(chǎn)品)。在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，宿主菌BL21(pET-0945c09)在37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入IPTG至終濃度1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)5小時。離心收集菌體，經(jīng)超聲波破菌，離心收集上清，用能與6個組氨酸(6His-Tag)結(jié)合的親和層析柱His.Bind QuickCartridge(Novagen公司產(chǎn)品)進行層析，得到了純化的目的蛋白一人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)。經(jīng)SDS-PAGE電泳，在36kDa處得到一單一的條帶(圖2)。
將該條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上用Edams水解法進行N-端氨基酸序列分析，結(jié)果N-端15個氨基酸與SEQ ID NO2所示的N-端15個氨基酸殘基完全相同。
實施例6抗人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)抗體的產(chǎn)生用多肽合成儀(PE公司產(chǎn)品)合成下述人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)特異性的多肽NH2-Cys Pro Tyr Cys Lys Glu Lys Val Asp Leu-COOH(SEQ ID NO7)。將該多肽分別與血藍蛋白和牛血清白蛋白耦合形成復合，方法參見Avrameas，etal.Immunochemistry，1969；643。用4mg上述血藍蛋白多肽復合物加上完全弗氏佐劑免疫家兔，15天后再用血藍蛋白多肽復合物加不完全弗氏佐劑加強免疫一次。采用經(jīng)15μg/ml牛血清白蛋白多肽復合物包被的滴定板做ELISA測定兔血清中抗體的滴度。用蛋白A-Sepharose從抗體陽性的家兔血清中分離總IgG。將多肽結(jié)合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上，用親和層析法從總IgG中分離抗多肽抗體。免疫沉淀法證明純化的抗體可特異性地與人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)結(jié)合。
實施例7人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的反義寡核苷酸抑制HL-60細胞的增殖采用392型DNA合成儀自動合成人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)的反義寡核苷酸(AS-ODN)和正義寡核苷酸(S-ODN)，并以二硫化四乙基秋蘭姆(Tetraethylthiuram disulfide，TETD)進行化學修飾而成為AS-PS-ODN和S-PS-ODN，其堿基序列為AS-PS-ODN5-CTCCACCACTGCCGCCAT-3(SEQ ID NO.8)S-PS-ODN 5-ATGGCGGCAGTGGTGGAG-3(SEQ ID NO.9)將濃度為5x105的HL-60細胞分為3組在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(1)對照組為單純HL-60細胞；(2)HL-60細胞+AS-PS-ODN；(3)HL-60細胞+S-PS-ODN。AS-PS-ODN或S-PS-ODN的終濃度為20μg/ml。細胞培養(yǎng)24小時后用溴酚藍染色檢測細胞的死亡率。結(jié)果表明，將AS-PS-ODN組細胞死亡率為91.8％，而對照組和S-PS-ODN組死亡率為4.5％。表明人的類谷氧化蛋白(hGRX-Bio36)基因的反義寡核苷酸能有效地抑制HL-60細胞的增殖。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)姓名上海生元基因開發(fā)有限公司(B)街道北京東路668號610室(C)城市上海(E)國家中國(F)郵政編碼200001(ii)發(fā)明名稱新的人的類谷氧化蛋白及其編碼序列(iii)序列數(shù)目9(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度2265bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1GGGCGAGCCG TGAAGATGGC GGCAGTGGTG GAGGTGGAGG TTGGAGGTGG TGCTGCTGGG 60GAACGGGAGC TGGATGAGGT TGATATGTCA GATCTCTCTC CAGAAGAGCA ATGGAGGGTC 120GAGCACGCAC GCATGCATGC CAAGCACCGT GGCCATGAAG CTATGCATGC TGAAATGGTC 180CTCATCCTCA TCGCAACCTT GGTGGTGGCC CAGCTGCTCC TGGTGCAGTG GAAGCAGAGG 240CACCCACGCT CCTACAATAT GGTGACCCTC TTTCAGATGT GGGTTGTTCC CCTCTATTTC 300ACAGTGAAGC TGCACTGGTG GAGGTTCCTA GTGATCTGGA TCTTGTTCTC TGCTGTCACA 360GCCTTTGTTA CCTTCCGAGC CACCCGAAAA CCTCTAGTAC AGACAACCCC AAGGTTGGTT 420TATAAGTGGT TCCTGCTAAT CTATAAAATC AGCTATGCCA CTGGCATTGT TGGCTACATG 480GCTGTCATGT TTACCCTCTT TGGTCTTAAC TTATTATTCA AGATCAAACC AGAAGATGCC 540ATGGACTTTG GCATCTCCCT TCTCTTCTAT GGCCTCTACT ATGGAGTTCT GGAACGGGAC 600TTTGCAGAAA TGTGTGCAGA CTACATGGCA TCTACCATAG GGTTCTACAG CGAGTCGGGC 660ATGCCTACCA AACATCTTTC AGACAGTGTG TGTGCTGTGT GTGGGCAGCA GATCTTTGTG 720GACGTCAGTG AAGAGGGGAT CATTGAGAAC ACGTATAGGC TGTCCTGCAA TCATGTCTTC 780CACGAGTTCT GCATCCGTGG CTGGTGCATC GTGGGAAAGA AGCAAACGTG TCCCTACTGC 840AAAGAGAAGG TAGACCTCAA GAGGATGTTC AGCAATCCCT GGGAGAGGCC TCACGTCATG 900TATGGGCAAC TGCTGGACTG GCTTCGATAC TTGGTAGCCT GGCAGCCTGT CATCATTGGT 960GTAGTCCAAG GCATCAACTA CATCCTGGGC CTGGAATAGT GATGAAGAGC ATCAGTGGAA 1020AACCCACCCC ACACGCCATG GACCTCAGGG CACTCTCCTC CCTGCCCACA AAGACCTCCT 1080GGGTGGGAAA GACTCAAAGG GGCGCTTGGG CCACTCAGGA CCCCTCCGGC TGTGTCGGAC 1140TGGGGAGGGA TATGATGGAG AGCCAGCCAG TGGGGCTGTC AGCAGTGGGG GGCTTTTTAA 1200AAGAAAACTA TTTTGATGAA TATATTTAAA AAACCTTTTT TTATTGTGGA GCATAGGAAT 1260TGCCCCCCTC CAGGCTTCAC CCTCCCTGCC TAAGCAGGGT GGGGGCAGAG CCATGACATT 1320TTTGGTTTAA AGGAGCCTTC TCATCTCTGG CCGAGAACAC TGCTGGGCTC CCAGGTAGCT 1380GAAGGCCTCA GCCCACCCAC TCCCTTCTTC CCTGTGTGGG GCTCAAGCCT GGTGCACTTA 1440GTATAGAAGA GCTAACGTAC TCAGGCTTGT GCCACGGGTG AGCACTGAGG CCCCAGGTGT 1500CCTCCCTCCC CCACTGTCTG GGACACAGGA CAGGTGTTGC GTCTGACTCT GTCTCCCCCT 1560GTCCAAGAGC TATAGGCTGG TTGAGGCAAG TGGAACCTTA TCAGTGACTT GGCCAACGAG 1620GGAAGCCTTG GGGCCTCAGA ATTCATTGAA AATTTGTTTT GGGACAACTG GAAGAATCAG 1680CACCATGGAT ACTCACCCGT GGGCAGGGCT GTGGTCAGCC AAGAATAGAG GTCATATAGT 1740TGGGCCATGG GGCAATTGTT GGCAGCCATG ACTGACGGCC CCTTGTGCAA GCTCATTCTT 1800CAGTGGATCC TTCAGTGGAG TGGTGACACG TGCCAGCGGT CACTCTGCCA CATCACTTCC 1860TTCTTGAAAG CCTAAGAGTG CGTATGCGTG TGTGTGTGTG TGTGTGTACG TGAGGCAGAA 1920GAATATGACA GATGTCAGCT TCTCCCTGTG TCAGATGATA TGTCCTTGAA GCTGGCAGGG 1980GATTCCCAGT CCAGGGAATA TCCCTACATG ATTTTTGTCA TTCATGGGTC CTCCCTGGGC 2040CTGACAACGG GAGTGGTGGG TGGGTGAGAA CAGGTTCTGA GAGGGGGCTT CTAGGAAGGC 2100CCCAGCCCTA GTCCTAGGCG ACTTGAATAA AGTGGGAGGT CAAACATGGG CCTTCGGCAT 2160TGGGTTTCTA GGGAATATGG CTCAGTAGGG CCTGCCCCTT CAAGGGCAGC AAGAACGAAG 2220CAGGATGTTG TCACTCCCGT CTGAATAAAG GGCGAGCCGT GAAGATGG 2265(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度327個氨基酸(B)類型氨基酸
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ala Ala Val Val Glu Val Glu Val Gly Gly Gly Ala Ala Gly 15Glu Arg Glu Leu Asp Glu Val Asp Met Ser Asp Leu Ser Pro Glu 30Glu Gln Trp Arg Val Glu His Ala Arg Met His Ala Lys His Arg 45Gly His Glu Ala Met His Ala Glu Met Val Leu Ile Leu Ile Ala 60Thr Leu Val Val Ala Gln Leu Leu Leu Val Gln Trp Lys Gln Arg 75His Pro Arg Ser Tyr Asn Met Val Thr Leu Phe Gln Met Trp Val 90Val Pro Leu Tyr Phe Thr Val Lys Leu His Trp Trp Arg Phe Leu 105Val Ile Trp Ile Leu Phe Ser Ala Val Thr Ala Phe Val Thr Phe 120Arg Ala Thr Arg Lys Pro Leu Val Gln Thr Thr Pro Arg Leu Val 135Tyr Lys Trp Phe Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Tyr Ala Thr Gly 150Ile Val Gly Tyr Met Ala Val Met Phe Thr Leu Phe Gly Leu Asn 165Leu Leu Phe Lys Ile Lys Pro Glu Asp Ala Met Asp Phe Gly Ile 180Ser Leu Leu Phe Tyr Gly Leu Tyr Tyr Gly Val Leu Glu Arg Asp 195Phe Ala Glu Met Cys Ala Asp Tyr Met Ala Ser Thr Ile Gly Phe 210Tyr Ser Glu Ser Gly Met Pro Thr Lys His Leu Ser Asp Ser Val 225Cys Ala Val Cys Gly Gln Gln Ile Phe Val Asp Val Ser Glu Glu 240Gly Ile Ile Glu Asn Thr Tyr Arg Leu Ser Cys Asn His Val Phe 255His Glu Phe Cys Ile Arg Gly Trp Cys Ile Val Gly Lys Lys Gln 270Thr Cys Pro Tyr Cys Lys Glu Lys Val Asp Leu Lys Arg Met Phe 285Ser Asn Pro Trp Glu Arg Pro His Val Met Tyr Gly Gln Leu Leu 300Asp Trp Leu Arg Tyr Leu Val Ala Trp Gln Pro Val Ile Ile Gly 315Val Val Gln Gly Ile Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Glu 327(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度20堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO3GGGCGAGCCG TGAAGATGGC20(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度19堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO4CCATCTTCAC GGCTCGCCC 19(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度24堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5GGGCCCATGG CGGCAGTGGT GGAG 24(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6CATATGCCAG GATGTAGTTG ATGCC 25(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO7Cys Pro Tyr Cys Lys Glu Lys Val Asp Leu 10(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度18堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8CTCCACCACT GCCGCCAT 18(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度18堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO9ATGGCGGCAG TGGTGGAG 18
權(quán)利要求
1.一種分離的人的類谷氧化蛋白hGRX-Bio36，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽、或其多肽的活性片段、類似物或衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽、類似物或衍生物的氨基酸序列具有與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列至少95％的相同性。
3.如權(quán)利要求2所述的多肽，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽。
4.一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含選自下組中的一種(a) 編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽或其片段、類似物、衍生物的多核苷酸；(b) 與多核苷酸(a)互補的多核苷酸；或(c) 與(a)或(b)有至少70％相同性的多核苷酸。
5.如權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多核苷酸。
6.如權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列包含有SEQ ID NO1中16-999位的序列或SEQ ID NO1中1-2265位的序列。
7.一種含有外源多核苷酸的重組載體，其特征在于，它是由權(quán)利要求4-6中的任一權(quán)利要求所述多核苷酸與質(zhì)粒、病毒或運載體表達載體構(gòu)建而成的重組載體。
8.一種含有外源多核苷酸的遺傳工程化宿主細胞，其特征在于，它是選自于下列一種宿主細胞(a)用權(quán)利要求7所述的重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的宿主細胞；或(b)用權(quán)利要求4-6中的任一權(quán)利要求所述多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的宿主細胞。
9.一種具有人的類谷氧化蛋白hGRX-Bio36活性的多肽的制備方法，其特征在于，所述方法包括(a)在表達人的類谷氧化蛋白hGRX-Bio36條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求8所述的工程化宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人的類谷氧化蛋白hGRX-Bio36活性的多肽。
10.一種能與多肽結(jié)合的抗體，其特征在于，所述抗體是能與人的類谷氧化蛋白hGRX-Bio36特異性結(jié)合的抗體。
11.一類模擬或調(diào)節(jié)多肽活性或表達的化合物，其特征在于，它們是模擬、促進、拮抗或抑制人的類谷氧化蛋白hGRX-Bio36的活性的化合物。
12.如權(quán)利要求11所述的化合物，其特征在于，它是SEQ ID NO1所示的多核苷酸序列或其片段的反義序列。
13.一種權(quán)利要求11所述化合物的應用，其特征在于，所述化合物用于調(diào)節(jié)人的類谷氧化蛋白hGRX-Bio36在體內(nèi)、體外活性的方法。
14.一種檢測與權(quán)利要求1-3中的任一權(quán)利要求所述多肽相關的疾病或疾病易感性的方法，其特征在于，其包括檢測所述多肽的表達量，或者檢測所述多肽的活性，或者檢測多核苷酸中引起所述多肽表達量或活性異常的核苷酸變異。
15.如權(quán)利要求1-3中的任一權(quán)利要求所述多肽的應用，其特征在于，它應用于篩選人的類谷氧化蛋白hGRX-Bio36的模擬物、激動劑，拮抗劑或抑制劑；或者用于肽指紋圖譜鑒定。
16.如權(quán)利要求4-6中的任一權(quán)利要求所述的核酸分子的應用，其特征在于，它作為引物用于核酸擴增反應，或者作為探針用于雜交反應，或者用于制造基因芯片或微陣列。
17.如權(quán)利要求1-6及11中的任一權(quán)利要求所述的多肽、多核苷酸或化合物的應用，其特征在于，用所述多肽、多核苷酸或其模擬物、激動劑、拮抗劑或抑制劑以安全有效劑量與藥學上可接受的載體組成作為診斷或治療與人的類谷氧化蛋白hGRX-Bio36異常相關的疾病的藥物組合物。
18.權(quán)利要求1-6及11中的任一權(quán)利要求所述的多肽、多核苷酸或化合物的應用，其特征在于，用所述多肽、多核苷酸或化合物制備用于治療生殖系統(tǒng)疾病、癌癥、心血管疾病、腦缺血和腦神經(jīng)損傷、以及免疫系統(tǒng)紊亂所引起疾病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的多肽—人的類谷氧化蛋白(hGRX－Bio36),編碼此多肽的多核苷酸和經(jīng)DNA重組技術(shù)產(chǎn)生這種多肽的方法。本發(fā)明還公開了此多肽用于診斷和治療多種疾病的方法,如生殖系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、腦缺血和腦神經(jīng)細胞的損傷、以及免疫性疾病等。本發(fā)明還公開了抗此多肽的拮抗劑及其治療作用。本發(fā)明還公開了編碼這種新的人的類谷氧化蛋白(hGRX－Bio36)的多核苷酸的用途。
文檔編號G01N33/68GK1297897SQ9912410
公開日2001年6月6日 申請日期1999年11月24日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月24日
發(fā)明者毛裕民, 謝毅 申請人:上海生元基因開發(fā)有限公司