專利名稱：新的肝再生相關蛋白、其編碼序列及用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學和醫(yī)學領域，具體地說，本發(fā)明涉及新的編碼肝再生相關蛋白-LRTM4的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。具體地說，本發(fā)明的多肽是一種新的與肝再生有關的肝再生相關蛋白。
肝臟具有明顯的再生現(xiàn)象，肝臟部分切除后，或受到物理及化學損傷時，肝臟就開始再生，并且再生持續(xù)到肝臟與身體的比例到達一定值時終止。肝再生現(xiàn)象與多種肝臟疾病相伴隨，如肝硬化、急慢性肝炎等。肝癌的發(fā)生過程也往往伴隨有肝再生現(xiàn)象；同時，臨床上肝再生現(xiàn)象被應用于部分肝臟移植以及肝細胞移植。
肝癌是一種世界范圍內(nèi)的惡性腫瘤，死亡率極高，尤其中國是肝癌的高發(fā)病區(qū)。每年世界范圍內(nèi)有25萬人死于肝癌，我國占了其中的40％(李紹白，《肝臟病學》，人民衛(wèi)生出版社，1995)。肝癌的發(fā)生與病毒感染如乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染有關，食用含有黃曲霉毒素等致癌物質(zhì)的水和食物等都是肝癌發(fā)病的主要因素。目前還發(fā)現(xiàn)肝癌發(fā)生與肝臟再生有密切的關系肝癌發(fā)生的過程往往伴有肝再生現(xiàn)象。現(xiàn)已知道，肝再生是受到緊密調(diào)控的肝細胞增殖，而肝細胞癌是肝細胞不受控制的增殖?，F(xiàn)在有的學說認為，肝癌發(fā)生的過程包括肝臟被病毒或化學物質(zhì)損傷，持續(xù)的損傷導致持續(xù)的再生，再生失去控制后便成為肝癌。所以了解肝癌與肝再生的關系，無疑有助于人們更好地對早期肝癌進行預測與治療。
目前，對于一些肝臟疾病的治療最有效的方案是肝臟移植，而且肝臟移植手術的技術已經(jīng)比較成熟，但是每年能夠受益于這一技術的人數(shù)非常有限，這是因為目前的肝臟移植有兩個方面受到限制供體來源和免疫排斥。要想使更多的人受益于肝臟移植，就必須突破這兩個限制。現(xiàn)在突破這個限制的主要策略是部分肝移植和肝細胞移植。部分肝移植可以使一個供體肝臟移植到兩個人或者更多，同時也使親屬間肝臟移植成為可能，從而減少了免疫排斥。另外一個更理想的方案是肝細胞移植，即將肝細胞直接移植進病人肝臟或者脾臟部位，肝細胞逐漸再生，承擔起肝臟的功能。肝細胞移植可以利用病人自己的肝細胞，從而不會發(fā)生免疫排斥現(xiàn)象；同時對病人肝細胞進行體外培養(yǎng)并導入特定的基因，能夠進行基因治療。
為了滿足部分肝移植及肝細胞移植等的需求，本領域迫切需要了解與肝組織再生有關的因素，尤其是與肝再生有關的基因和蛋白。
本發(fā)明的目的是提供一種新的肝再生相關蛋白-LRTM4蛋白以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。本發(fā)明的LRTM4基因，是一個在國內(nèi)外未見報道的新基因，對它的分子機制的研究有利于闡明肝臟再生的分子生物學機制，同時也可能用于肝臟疾病的基因治療。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的LRTM4多肽，該多肽源自大鼠，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少75％相同性(a)編碼上述LRTM4多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中335-940位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1576位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的宿主細胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有LRTM4蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達LRTM4蛋白的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有LRTM4蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的LRTM4多肽特異性結合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的15-1576個核苷酸。
在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進、拮抗LRTM4多肽活性的化合物，以及抑制LRTM4多肽的表達的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是LRTM4多肽的編碼序列(或其片段)的反義序列。
在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在LRTM4蛋白的方法，它包括將樣品與LRTM4蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在LRTM4蛋白。
在本發(fā)明的第八方面，提供了一種檢測與LRTM4多肽異常表達相關的疾病或疾病易感性的方法，該方法包括檢測編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。
在本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。
在本發(fā)明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的LRTM4多肽、或其編碼序列、或含該編碼序列的載體，以及藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑和載體。這些藥物組合物可應用于肝炎或重癥肝炎引起的肝細胞損傷后修復，以及應用于肝癌的治療，肝臟部分移植以及肝細胞移植中促進肝細胞增殖等病癥。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
本發(fā)明人通過抑制差減雜交法克隆了一個肝再生過程中高表達的新基因LRTM4。全序列測定該cDNA全長為1576bp(見SEQ ID NO.1)，編碼了一個由202個氨基酸組成的LRTM4蛋白質(zhì)(見SEQ ID NO.2)。同源性分析表明LRTM4為一個新基因。
LRTM4蛋白是一個四跨膜蛋白，與肝再生密切相關，可應用于促進肝臟再生和肝臟損傷修復。
用點雜交方法對LRTM4表達進行分析，發(fā)現(xiàn)該基因在肝臟再生過程中在正常肝中有一定的表達，在肝再生過程中表達明顯升高，且表達量與肝再生持續(xù)的時間有關，這表明基因LRTM4與肝再生有很高的相關性。
對LRTM4基因進行Northern印跡組織分布分析表明，該基因在有細胞增殖的組織中表達，可以作為細胞增殖的標志。
大鼠四氯化碳肝損傷動物模型中進行的進一步實驗表明，LRTM4基因具有促進肝臟損傷修復即促進再生的作用，可應用于肝部分移植及肝細胞移植中促進再生、急慢性肝炎造成的肝細胞損傷的修復，具有重要的應用價值。
下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發(fā)明范圍。


圖1顯示了RNA點雜交檢測的LRTM4基因在肝再生過程中的表達情況。圖中1、2、3分別表示總RNA的取樣量為5、15、45μg點在尼龍膜上，0h、24h、48h、72h為大鼠肝部分切除后的時間；LRTM4表示用基因片段做探針雜交后的結果，18S表示用18S核糖體RNA基因片段做探針雜交的結果，作為參照。
圖2顯示了以LRTM4 cDNA為探針，與大鼠不同組織mRNA的Northern雜交結果。圖中9個組織包括再生肝、正常肝、睪丸、脾臟、前列腺、骨骼肌、肺、心臟、腦。上圖為用LRTM4基因片段標記作為探針雜交的結果，18S與28S指示電泳條帶所在位置，雜交條帶的大小為1.6Kb；下圖為用18S核糖體RNA片段標記作為探針雜交的結果，作為參照。
圖3顯示了在四氯化碳肝損傷大鼠模型中，肝臟LRTM4的表達與血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)的相關性。圖中不同處理組1為正常大鼠，2、3為灌喂0.5毫升四氯化碳/千克體重，4、5灌喂1毫升四氯化碳/千克體重，其中3、5均導入LRTM4基因。GPT水平為谷丙轉(zhuǎn)氨酶單位/毫升，LRTM4基因表達量為經(jīng)過管家基因GAPDH標準化后的相對比值?；驈姸鹊臏y定方法是LRTM4與GAPDH的擴增產(chǎn)物同時電泳，掃描定量，計算LRTM4與GAPDH量的比值作為LRTM4的表達水平。圖中曲線表示在不同的處理中測得的LRTM4的表達水平，柱狀圖表示血液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶GPT水平。圖中可以看出，GPT水平與LRTM4表達水平呈負相關。
圖4是LRTM4的CDNA序列和氨基酸序列。
在本發(fā)明中，術語“LRTM4蛋白”、“LRTM4多肽”或“肝再生相關蛋白LRTM4”可互換使用，都指具有肝再生相關蛋白LRTM4氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的肝再生相關蛋白LRTM4。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的LRTM4蛋白或多肽”是指LRTM4多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領域的技術人員能用標準的蛋白質(zhì)純化技術純化LRTM4蛋白。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學合成的產(chǎn)物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。
本發(fā)明還包括LRTM4蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然LRTM4蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
一類特殊的LRTM4類似物是在其他哺乳動物(如牛、羊、兔、狗、猴、人等)中LRTM4的同源蛋白。這些其他物種的同源蛋白的編碼序列，可根據(jù)本發(fā)明公開的序列，通過雜交或擴增的方法而獲得，進而通過常規(guī)重組方法獲得這些同源蛋白。
在本發(fā)明中，術語“LRTM4多肽”指具有LRTM4蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術語還包括具有與LRTM4蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術語還包括LRTM4蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與LRTM4 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗LRTM4多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含LRTM4多肽或其片段的融合蛋白(如SEQ ID NO3所示的融合蛋白)。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了LRTM4多肽的可溶性片段。通常，該片段具有LRTM4多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供LRTM4蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然LRTM4多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“LRTM4蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列+各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)+非編碼序列。
術語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少60％，較佳地至少75％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼LRTM4蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明的LRTM4核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或LRTM4蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組的LRTM4多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼LRTM4多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，LRTM4多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7的表達載體；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含LRTM4編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內(nèi)重組技術等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎允蛊淠軌虮磉_蛋白質(zhì)。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS、293細胞等動物細胞。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉(zhuǎn)錄。可舉的例子包括在復制起始點晚期一側(cè)的100到270個堿基對的SV40增強子、在復制起始點晚期一側(cè)的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
重組的LRTM4蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療LRTM4蛋白功能低下或喪失所致的疾病(尤其是促進肝臟損傷的修復)，和用于篩選促進或?qū)筁RTM4蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組LRTM4蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激LRTM4蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對LRTM4 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于LRTM4基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與LRTM4基因產(chǎn)物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結合并抑制LRTM4蛋白的分子，也包括那些并不影響LRTM4蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的LRTM4基因產(chǎn)物結合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；或嵌合抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領域內(nèi)技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的LRTM4基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物(如家兔，小鼠等)以誘導多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達LRTM4蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。可使用多種佐劑增強免疫反應，其中包括(但不限于)弗氏佐劑等。
本發(fā)明的單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備。本發(fā)明的各類抗體可以利用LRTM4基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與LRTM4基因產(chǎn)物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
抗LRTM4蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的LRTM4蛋白。此外，與LRTM4蛋白結合的單克隆抗體也可用放射性同位素標記，注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。這種放射性標記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于腫瘤細胞的定位和判斷是否有轉(zhuǎn)移。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與LRTM4蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或受體等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的多肽可直接用于疾病治療，例如，用于肝臟損傷修復方面的治療。在使用本發(fā)明LRTM4蛋白時，還可同時使用其他治療劑。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明LRTM4多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的LRTM4蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
LRTM4蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g可用于治療由于LRTM4蛋白的無表達、無活性或活性低下所致的細胞增殖、發(fā)育或代謝異常，也可用于增加LRTM4的表達和活性(例如用于促進肝再生)。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設計成表達LRTM4蛋白，以增加內(nèi)源性的LRTM4蛋白活性。來源于病毒的表達載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用于將LRTM4基因轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)。構建攜帶外源基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook，et al.)。另外重組LRTM4基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)。
抑制LRTM4 mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術獲得，如固相磷酸酰胺化學合成法合成寡核苷酸的技術已廣泛應用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側(cè)的序列長度，核糖核苷之間的連接應用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導入組織或細胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內(nèi)等。
能與LRTM4蛋白結合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測LRTM4蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的LRTM4蛋白水平，可以用作解釋LRTM4蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷LRTM4蛋白起作用的疾病。
一種檢測檢測樣品中是否存在LRTM4蛋白的方法是利用LRTM4蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與LRTM4蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在LRTM4蛋白。
LRTM4蛋白的多聚核苷酸可用于LRTM4蛋白相關疾病的診斷和治療。在診斷方面，LRTM4蛋白的多聚核苷酸可用于檢測LRTM4蛋白的表達與否或在疾病狀態(tài)下LRTM4蛋白的異常表達。如LRTM4 DNA序列可用于對活檢標本的雜交以判斷LRTM4蛋白的表達異常。雜交技術包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用LRTM4蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測LRTM4蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測LRTM4基因的突變也可用于診斷LRTM4蛋白相關的疾病。LRTM4蛋白突變的形式包括與正常野生型LRTM4 DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發(fā)明的優(yōu)點在于1、提供了一個全新的肝再生相關基因LRTM4。它在再生肝組織中表達升高，并調(diào)控細胞生長，是一個與肝再生高度相關、具有促進肝細胞增殖活性的功能基因。
2、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)LRTM4基因在體內(nèi)動物模型實驗中能促進肝臟損傷的修復，有刺激肝細胞生長的作用，表明LRTM4可以作為藥物治療肝臟的急慢性損傷等一系列臨床應用，包括肝臟移植后促進肝臟再生、肝癌的基因治療等應用。
3、LRTM4在多數(shù)正常組織中都不表達，但在睪丸和再生肝組織中高表達，表明LRTM4有很強的組織表達專一性。睪丸是成人組織中細胞增殖與分化十分旺盛的組織，表明LRTM4也與細胞增殖相關，可作為細胞增殖的標志應用于一些與細胞增殖有關的疾病如腫瘤的診斷。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1、抑制差減雜交篩選再生肝中高表達基因使用Trizol試劑和MessageMaker reagent assembly試劑盒(均為Gibco BRL公司產(chǎn)品)，按照說明書中推薦的方法進行組織總RNA和Poly(A)+RNA抽提，并使用Clontech公司試劑盒進行抑制差減雜交。具體方法如下取2μg mRNA(來自正常肝或再生肝)，加入1μl濃度為10μmol/L的寡聚核苷酸[5′-TTTGTACGCGGCCGC(T)15-3′]為引物，使用SuperScript II反轉(zhuǎn)錄酶(Gibco BRL)合成第一鏈cDNA，使用試劑盒內(nèi)的第二鏈合成酶合成第二鏈。合成的雙鏈cDNA片段用RsaI酶切，然后取出再生肝的cDNA片段為受檢者(tester)，分別加入兩組接頭1及接頭2R(接頭序列見試劑盒說明)。以正常肝組織來源的cDNA(不加接頭)作為驅(qū)動者(driver)，再生肝中與正常肝相同的DNA序列因雜交形成的雙鏈被減去，再生肝中因差異而剩下的片段經(jīng)PCR選擇性擴增后被克隆。所有的液相雜交與PCR均在一臺PTC-100 PCR儀(MJ Research Inc.)上進行。
實施例2、LRTM4全長cDNA的克隆從差減得到克隆序列中選擇一個新的EST，克隆全長cDNA。根據(jù)數(shù)據(jù)庫EST序列進行計算機拼接，設計多聚酶鏈式反應(PCR)引物P1(5′-GCAACTCGAACATCTTGTCTGT-3′(SEQ ID NO4))，P2(5′-GGCAAATTATGACAGGCTCATA-3′(SEQ ID NO5))。采用TRIZOL試劑盒(GIBCOL/BRL公司)，按照說明書中推薦的方法分離大鼠再生肝組織總RNA。在20μL逆轉(zhuǎn)錄反應體系中，加入1μg再生肝組織總RNA，1μL熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco公司產(chǎn)品)，dNTP，以寡聚(dT)20為引物。50℃1小時，85℃5分鐘，再加入1μL RNase H，37℃放置20分鐘切除RNA。以逆轉(zhuǎn)錄反應得到的cDNA為模板，PCR擴增獲得LRTM4基因cDNA，PCR反應條件為94℃2分鐘預變性，循環(huán)反應為94℃30秒，55℃30秒，68℃90秒，共進行35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物(約1600bp)用低熔點凝膠回收純化，克隆入T-載體(Promega公司產(chǎn)品)中，方法參照《分子克隆。實驗指南》(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsh，E.F.，and Maniais，T.，Molecular Cloning，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)。全序列由TaKaRa公司(中國，大連)測定。測定的cDNA全長為1576bp(SEQ ID NO1)，包含了一個完整的蛋白編碼區(qū)(SEQ ID NO1中第335-940位，不包括終止密碼子)，編碼了一個由202個氨基酸組成的蛋白質(zhì)(SEQID NO.2)。該蛋白被命名為LRTM4蛋白，基因被命名為LRTM4基因。
對LRTM4蛋白進行的結構分析表明，它是一個四跨膜蛋白，具有四個特征性的疏水跨膜區(qū)，從30到47位氨基酸殘基為第一個胞外區(qū)，從109到155位氨基酸殘基為第二個胞外區(qū)，其中第二個胞外區(qū)較長，為47氨基酸殘基。預測表明LRTM4蛋白具有兩個糖基化位點，分別是124與156位的天冬酰氨殘基。
同源比較發(fā)現(xiàn)，LRTM4與一個已知的人TM4SF4基因(Wice.B.M.etc，JBC，270(35)21907-21918，1995)有87％，但是在功能上，人TM4SF4蛋白的功能是抑制細胞增殖，而本發(fā)明中LRTM4基因的功能與之不同，具有促進細胞增殖與細胞損傷修復的功能。另外LRTM4蛋白與幾個人腫瘤標記蛋白具有同源性與L6腫瘤抗原有48％同源(Marken J.S.etc，PNAS，893503-3507，1992)，與TM4SF5腫瘤抗原由38％同源(Muller P.F.etc，208(1)25-30，1998)。
實施例3、點雜交檢測LRTM4在大鼠肝再生過程中的表達取大鼠正常肝與部分切除后不同時間點(24，48，72小時)的再生肝，手術切除后立即放入液氮中保存。采用TRIZOL試劑盒(GIBCOL/BRL公司)，按照說明書推薦的方法制備組織樣品總RNA。
將分離制備的正常肝(0)或24、48、72小時再生肝的總RNA，按照7.5單位DNase I/200μg RNA的量加入DNase I(Pharmacia Biotech)消化，除去可能污染的痕量基因組DNA，每個樣品分別按5、15、45μg RNA量，點印到尼龍膜上，然后80℃烤2小時。將尼龍膜放入雜交管中，加入5mL快速雜交液(Clontech公司產(chǎn)品)，68℃預雜交30分鐘，換5mL新鮮雜交液，加入變性的32P隨機標記的LRTM4片段的探針(Random Primer DNA標記試劑盒，TaKaRa公司)，68℃雜交1小時。雜交膜用洗滌緩沖液I(0.3M NaCl，0.03M醋酸鈉(PH7.0)，0.05％十二烷基磺酸鈉)于室溫洗兩次，每次20分鐘；然后用洗滌緩沖液II(15mM NaCl，1.5mM醋酸鈉(pH7.0)，0.1％十二烷基磺酸鈉)于50℃洗兩次，每次20分鐘。然后，壓片，-70℃放射自顯影。
結果如圖1所示，LRTM4基因在24與72小時再生肝中表達明顯升高。這表明LRTM4在肝臟的再生過程中表達升高。
實施例4、LRTM4在大鼠組織中的表達分析取液氮中保存的大鼠24小時再生肝、正常肝、睪丸、脾臟、骨骼肌、肺、心臟與腦，采用TRIZOL試劑盒(GIBCOL/BRL公司)，按照說明書推薦的方法制備組織樣品總RNA。取10-15μg各組織總RNA，在含2.2 mol/L甲醛的1％瓊脂糖中電泳分離后，使用毛細管方法轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，方法參照《分子克隆.實驗指南》(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsh，E.F.，and Maniais，T.，Molecular Cloning，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)。
將尼龍膜(Multiple Tissue Northern Blot I，Clontech公司產(chǎn)品)放入雜交管中，加入5mL快速雜交液(Clontech公司產(chǎn)品)，68℃預雜交30分鐘，換5mL新鮮雜交液，加入變性的32P隨機標記的LRTM4片段的探針(Random Primer DNA標記試劑盒，TaKaRa公司)，68℃雜交1小時。雜交膜用洗滌緩沖液I(0.3M NaCl，0.03M醋酸鈉(PH7.0)，0.05％十二烷基磺酸鈉)于室溫洗兩次，每次20分鐘；然后用洗滌緩沖液II(15mM NaCl，1.5mM醋酸鈉(pH7.0)，0.1％十二烷基磺酸鈉)于50℃洗兩次，每次20分鐘。然后，壓片，-70℃放射自顯影。
實驗結果如圖2所示，LRTM4基因在肝臟和睪丸中有表達，在再生肝中表達明顯升高，表達產(chǎn)物大小約為1.6Kb。這說明LRTM4基因可能不僅在肝再生過程中起作用，在睪丸的細胞分裂過程中也可能有一定的作用。
實施例5、在四氯化碳肝損傷大鼠模型中LRTM4基因促進肝臟修復用植物油溶解四氯化碳(CCl4)，至四氯化碳濃度為40％(V/V)。按照0.5ml/kg及1.0ml/kg體重的量用四氯化碳灌喂大鼠。取200μg含有LRTM4基因編碼區(qū)的pCDNA3重組質(zhì)粒，與50μL脂質(zhì)體分別溶于500μL PBS后混合，取灌喂24小時后的大鼠通過尾靜脈將LRTM4表達質(zhì)粒注入大鼠體內(nèi)。72小時后，處死大鼠，取出肝組織置入液氮保存；取血液靜置后離心取血清。
采用TRIZOL試劑盒(GIBCOL/BRL公司)，按照說明書推薦的方法制備組織樣品總RNA。按照實施例2的方法進行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA模板。LRTM4基因的擴增是使用LRTM4編碼區(qū)引物(CDS15′-CCGCTCGAGCCACCCCAGCATGTGTACT-3′(SEQ ID NO6)；CDS25′-GCGTCGACT GGTCTATCACCCCCACA-3′(SEQ ID NO7))，進行PCR擴增，反應條件為94℃2分鐘預變性，循環(huán)反應為94℃30秒，55℃30秒，72℃90秒，共進行35個循環(huán)。GAPDH表達量的測定是使用GAPDH基因特異引物(GAPDHL5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′；GAPDHR5′-ACCACAGTCCATGCC ATCAC-3′)，進行PCR擴增，反應條件為94℃2分鐘預變性，循環(huán)反應為94℃30秒，55℃30秒，72℃90秒，共進行25個循環(huán)，反應產(chǎn)物作為內(nèi)標。LRTM4與GAPDH的擴增產(chǎn)物同時電泳，掃描定量，計算LRTM4與GAPDH量的比值作為LRTM4的表達水平。
使用轉(zhuǎn)氨酶定量試劑盒(Transaminases Quantitative Kit，SIGMA公司)，按照產(chǎn)品說明推薦方法檢測血清中GPT水平取100微升丙氨酸-α-KG底物37℃預熱后，加入20微升血清，混合后37℃保溫30分鐘，然后加入100微升顯色試劑，混合后放置室溫20分鐘，加入1毫升0.4mol/L NaOH，混勻后放置至少5分鐘后，以水作為對照，測定505nm光吸收。按照說明繪制標準曲線，在標準曲線得到每個樣品中的GPT含量。
結果如圖3所示，不同處理組1為正常大鼠，2、3為灌喂0.5毫升四氯化碳/千克體重，4、5灌喂1毫升四氯化碳/千克體重，其中3、5均導入LRTM4基因。試驗表明，正常肝組織中LRTM4有低水平的表達，同時GPT水平較低；攝入四氯化碳后，GPT水平和LRTM4表達水平均升高，并且攝入量越大，GPT水平越高，而LRTM4表達水平在四氯化碳水平升高時反而降低；導入LRTM4基因后，LRTM4表達水平明顯升高，并且伴隨GPT水平下降。這表明在肝組織損傷后GPT水平與LRTM4基因的表達水平呈密切的負相關。
綜上所述，LRTM4蛋白為一未見報道的新型肝再生相關蛋白。實施例6 LRTM4蛋白重組表達和純化采用實施例2中得到的含有全長LRTM4基因的T載體純化質(zhì)粒作為模板，使用LRTM4蛋白第二胞外區(qū)的編碼區(qū)序列的引物(EC2f5’-CGGGATCCTTTCCATCAACAAGGGTCCT-3’(SEQ ID NO8)，EC2r5’CGAATTCCGAGATTCCAAGG GACCACAT-3’(SEQ ID NO9))，按照前述方法進行擴增，PCR反應條件為94℃2分鐘預變性，循環(huán)反應為94℃30秒，55℃30秒，72℃90秒，共進行20個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，以Bam HI與Eco RI限制性內(nèi)切酶處理，連接到經(jīng)這兩個酶處理的pGEX-3X載體上，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。
經(jīng)鑒定后的轉(zhuǎn)化細胞過夜的飽和培養(yǎng)物，按照1∶60的比例接種到1升2×YT培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3小時后，加入IPTG至0.3mmol/L，誘導3小時后，離心4000rpm，10分鐘收獲菌體，PBS洗滌一次后，用含有1mmol/L PMSF的25毫升PBS懸起菌體，超聲波破碎菌體后，在溶液中加入10％Triton X-100至1％，混勻后離心10000rpm，10分鐘。離心后的上清上平衡好的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠柱子，按照Pharmacia公司使用說明，純化融合蛋白。
經(jīng)10％SDS-PAGE電泳檢測，在約31kDa處有一主條帶，與預測的GST-LRTM4融合蛋白的分子量相符。GST-LRTM4融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO3所示，其中229-272位為源自LRTM4的片段。實施例7 抗LRTM4蛋白抗體的產(chǎn)生取200μg實施例6中獲得的純化融合蛋白，溶于0.5毫升去離子水中，加入等體積的弗氏完全佐劑并混勻，多點注射于體重2.5Kg的雄性新西蘭大白兔皮內(nèi)。4周后使用同樣的蛋白量以及弗氏不完全佐劑進行加強注射。過2周后進行再次加強。加強后在耳動脈取血，使用免疫雙擴散方法檢測抗體效價。當抗體效價達到要求時，頸動脈放血收集血液并制備抗血清，加入NaN3至0.1％，置于-20℃保存。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序 列 表(1)一般信息(ii)發(fā)明名稱新的肝再生相關蛋白、其編碼序列及用途(iii)序列數(shù)目3(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度1576bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1agcaactcga acatcttgtc tgtgctggtg gattattaac agaggttatt ggtctccatg 60gcaaaacaat tgaacgatcg cgcagaacgt aatctcattt atggggtgca aaaaaaaaaa 120gacattgggt cagggatata aatgcccatt gccactgagg gcctgctata gttcagaagt 180gactccacgg ttcaaaacgc tctgacattt tggtcccaaa tttcttactg aaccaggtac 240agccactgca acgcgctgcc aaaacccctg aggagtcctg tgaagctggt ggtgaggagc 300ctttgatctc tgtgctttac tgtgccaccc cagcatgtgt actgggggct gtgccaggtg 360cctggggggc accctcattc ccttggctgt gtttgccgtc ctggcaaata tcctgttgtt 420ttttcctgga ggaaaagtgg tggatgacaa cagccacctt tcagatgagg tctggtactt 480cggaggaata ctgggaagtg gagtcttgat gatcttccct gcgctggtgt tcttgggcct 540gcagaacaat gactgctgcg gatgctgtgg taatgagagc tgtgggaagc gatttgcgat 600gttcacctcc acgttgtttg ctgtggttgg cttcttgggt gctgcatact catttatcgt 660ctcagccgtt tccatcaaca agggtcctaa atgcttcatg accaataaca cctggggata 720ccccttccac gatggtgatt atcttaatga ccaagccttg tggagcaagt gcgaagaacc 780ccgcgatgtg gtcccttgga atctcaccct tttctccatt ctgctggtca tcggagggat 840ccagatggtt ctctgtgcca tccaggtgat caatggcctc ctgggaactc tctgtggaga 900ctgccagtgc tgtggctgct gtgggggtga tagaccagtc taacaggcta cgatgatctg 960ctccaagtct acagcaccat gtgtgggaag acatggccca ggcccagcac tgcacacatg 1020ggctgctaac tcctgtccgg ttggatcctc tctggcagag cttgggaggc acaggagatc 1080ctttactctc tccaaacaac ttagctcaac ccaggaattt ggtggaattt ttttactttg 1140caaattaggc cctattttga attccagaac aagtttaaag cacatttttc atgatttccc 1200ataagaaaag ttaaaataga ggaggtcact tgtcctacca cattgtctct ttgtgtataa 1260agatgtccat actttaggaa tatttgcatt gaactcaaag agataaagca ttacaaggaa 1320aaccggtttt tcaggatgca taggtaagga atgattgcta tattatatat aatttttatg 1380tgaagcctgt tttggctaac ttgtctggac tacttgtaac tagttttatg agcctgtcat 1440aatttgccag ggttcccaca tgtatattaa gttaattaaa ttcagaatta aaataataaa 1500tgtgggggga ggaagaagag aaagaatgta tcagacctgc ttgtcttttt tctttttata 1560aatgcattct ttcttt 1576(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度202個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO2MCTGGCARCL GGTLIPLAVF AVLANILLFF PGGKVVDDNS HLSDEVWYFG GILGSGVLMI60FPALVFLGLQ NNDCCGCCGN ESCGKRFAMF TSTLFAVVGF LGAAYSFIVS AVSINKGPKC120FMTNNTWGYP FHDGDYLNDQ ALWSKCEEPR DVVPWNLTLF SILLVIGGIQ MVLCAIQVIN180GLLGTLCGDC QCCGCCGGDR PV202(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度276個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO3MSPILGYWKI KGLVQPTRLL LEYLEEKYEE HLYERDEGDK WRNKKFELGL EFPNLPYYID 60GDVKLTQSMA IIRYIADKHN MLGGCPKERA EISMLEGAVL DIRYGVSRIA YSKDFETLKV 120DFLSKLPEML KMFEDRLCHK TYLNGDHVTH PDFMLYDALD VVLYMDPMCL DAFPKLVCFK 180KRIEAIPQID KYLKSSKYIA WPLQGWQATF GGGDHPPKSD LIEGRGILSI NKGPKCFMTN 240NTWGYPFHDG DYLNDQALWS KCEEPRDVVP WNLNSS 276(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度22堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO4GCAACTCGAA CATCTTGTCT GT 22(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度22堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5GGCAAATTAT GACAGGCTCA TA22(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度28堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6CCGCTCGAGC CACCCCAGCA TGTGTACT 28(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度26堿基
(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7GCGTCGACTG GTCTATCACC CCCACA 26(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度28堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ IDNO8CGGGATCCTT TCCATCAACA AGGGTCCT28(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度28堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO9CGAATTCCGA GATTCCAAGG GACCACAT28
權利要求
1.一種分離的LRTM4多肽，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少75％相同性(a)編碼如權利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中335-940位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1576位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求6所述的載體。
8.一種具有LRTM4蛋白活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達LRTM4蛋白的條件下，培養(yǎng)權利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有LRTM4蛋白活性的多肽。
9.一種能與權利要求1所述的LRTM4蛋白特異性結合的抗體。
10.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權利要求1所述的多肽或權利要求3所述的多核苷酸或權利要求6所述的載體，以及藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。
11.一種檢測樣品中是否存在LRTM4蛋白的方法，其特征在于，包括將樣品與權利要求9所述的抗體接觸，觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在LRTM4蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的肝再生相關蛋白－LRTM4蛋白以及編碼LRTM4蛋白的多核苷酸。本發(fā)明還公開了LRTM4蛋白及其多核苷酸的制法和用途。本發(fā)明還公開了此LRTM4蛋白用于治療多種疾病的方法,如用于肝臟損傷的修復等疾病。本發(fā)明還提供了含LRTM4蛋白的藥物組合物。
文檔編號G01N33/68GK1367179SQ0110528
公開日2002年9月4日 申請日期2001年1月22日 優(yōu)先權日2001年1月22日
發(fā)明者趙慕鈞, 劉占武, 李載平 申請人:中國科學院上海生物化學研究所