抑制i型糖尿病ccr5基因表達(dá)的干擾序列及其重組載體與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種可以抑制I型糖尿病特異性相關(guān)基因表達(dá)的干擾序列及其重組載體，以及在制備治療I型糖尿病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明將構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)染小鼠T淋巴細(xì)胞，可影響Th1/Th2細(xì)胞因子的分泌，在糖尿病前期的胰島炎中起重要作用，阻止I型糖尿病的進(jìn)程。本發(fā)明為I型糖尿病的治療提供了新的手段。
【專利說明】抑制I型糖尿病CCR5基因表達(dá)的干擾序列及其重組載體與 應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種可以抑制I型糖尿病特異性相關(guān)基 因表達(dá)的干擾序列及其重組載體，以及在制備治療I型糖尿病藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 在機(jī)體的免疫反應(yīng)和疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，一類免疫調(diào)節(jié)因子系統(tǒng)-趨化因子 及其受體起著重要的作用。趨化因子通過與細(xì)胞表面的受體結(jié)合而產(chǎn)生效應(yīng)，其特異性受 體屬于7次跨膜結(jié)構(gòu)域G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRS)目前已發(fā)現(xiàn)近20種。趨化因子及其受體 參與廣泛的病理、生理過程。
[0003] 趨化因子受體5 (CC-cheokine rec印tor5, CCR5)是CC亞族趨化因子的特異性受 體。CCR5基因位于3p21.3上，長1.9kb，編碼352個氨基酸，具有G蛋白偶聯(lián)受體家族（G - protein coupled receptors，GPCRs)所特有的七個跨膜區(qū)（transmembrine domains，TM), 呈α螺旋。自1996年人們克隆該基因并發(fā)現(xiàn)CCR5可以作為HIV的共受體（corec印tor) 參與HIV的感染，CCR5就引起人們極大的興趣并一直是科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，后來又陸續(xù) 發(fā)現(xiàn)在一些自身免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化、惡性腫瘤等的病程中CCR5可能 起著關(guān)鍵作用。
[0004] I型糖尿?。╰ypeldiabetes mellitus，T1DM)是一種嚴(yán)重威脅人類健康的常見 代謝性疾病，I型糖尿病患者大約占總糖尿病患者的5 % - 10%。目前認(rèn)為I型糖尿病 是T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，具體機(jī)制尚不清楚。遺傳學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)N0D鼠的致病 基因位于11號染色體上一個叫idd4的區(qū)域，而該區(qū)域恰恰也是CC亞家族基因所在位 點(diǎn)。有人研究了 Thl細(xì)胞和Th2細(xì)胞膜表面分子后指出，CCR5可以認(rèn)為是Thl細(xì)胞特異 的表面標(biāo)志之一 (Loetscher P, Uguccioni M, Bordoli L, et al. CCR5is characteristic of Thllymphocytes. [J]Nature, 1998, 391(6665) :344-345)。而目前公認(rèn) Thl 細(xì)胞分泌的多種 細(xì)胞因子（IL-2、INF-γ )可加重胰島炎癥反應(yīng)；而Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子（IL-4、IL-6、 IL-10)則是I型糖尿病的保護(hù)因素。2000年Cameron等人研究發(fā)現(xiàn)，CCR5mRNA在糖尿病 N0D小鼠的脾臟和胰腺中均有表達(dá)，且ΜΙΡ-1 α表達(dá)明顯上升；用IL-4治療后小鼠 ΜΙΡ-1 α 和CCR5的表達(dá)下調(diào)。表明CCR5與ΜΙΡ-1 α參與了 I型糖尿病的病理過程。此外有報道 稱CCR5-delta32突變的人群的I型糖尿病的發(fā)病率降低，或者發(fā)病時間推遲，但亦有報 道稱 CCR5-delta32 突變與 TIDM 的發(fā)病無關(guān)。（Maier-Moore J S, Cafias C A, Tob0n G, et al. The CCR5delta32polymorphism(rs333) is not associated with Sjogren's syndrome or TypelDiabetes in Colombians. Clin Immunol. 2013 ; 148 (2) : 206-8.)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種抑制I型糖尿病CCR5基因表達(dá)的干擾序列（SiRNA、 ShRNA)，并構(gòu)建含有I型糖尿病CCR5基因表達(dá)的干擾序列的重組載體。本發(fā)明的另一目的 是提供該干擾序列和重組載體在制備治療I型糖尿病藥物中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)：
[0007] -、在糖尿病N0D鼠 T細(xì)胞CCR5的陽性率為10. 46%，高于糖尿病前N0D鼠4. 9% (ρ〈0·05)，見圖 1。
[0008] 二、RNAi抑制CCR5后Τ細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子向Th2方向偏移，提示CCR5可以直接 調(diào)節(jié)T細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌和Thl/Th2平衡即GFP+細(xì)胞IL - 2、IFN- γ和IL - 4分別為 6. 13±1. 02ng/ml、8. 45±1. 09ng/ml 和 1. 23±0. 25ng/ml，GFP -細(xì)胞 IL - 2、IFN - γ 和 IL - 4 分別為 10. 95±L 24ng/ml、0. 40±0· 08ng/ml 和 14. 38±0· 87ng/ml(n = 4，ρ〈0· 05) 即抑制CCR5使得Τ細(xì)胞分泌IL 一 2、IFN - γ減少而IL 一 4分泌增加，見圖8。
[0009] 三、RNAi抑制CCR5后T細(xì)胞的細(xì)胞周期無明顯變化，見圖7。
[0010] 四、通過NOD. scid鼠過繼實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)表明RNAi抑制CCR5后的T細(xì)胞在過繼 5周后血糖值為7. 2±1.2mmol/l，明顯低于對照組10. 7±1.8mmol/l(p〈0. 05)和空載 體組11.2±2. lmmol/l(p〈0. 05) ;10周后血糖值為12. 3±2. 9mmol/l，明顯低于對照組 18.8±3.4mmol/l(p〈(X05)和空載體組 19.7±3.1mmol/l，（p〈0.05)。RNAi 抑制 CCR5 后 的T細(xì)胞在過繼1周后，胰島炎評分為0.31 ±0.46 (η = 90, p〈0. 01)，顯著低于對照組 1. 56±0. 15,和空載體組1. 428±0. 04,表明CCR5RNAi后抑制T細(xì)胞早期趨化至胰島，說明 其在糖尿病前期的胰島炎中起重要作用，見圖9、表1。
[0011] 本發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)表明，CCR5可能主要通過影響Thl/Th2細(xì)胞因子的分泌和參 與早期的胰島炎而影響I型糖尿病的進(jìn)程，CCR5可能作為I型糖尿病潛在的治療靶點(diǎn)。
[0012] 基于以上研究，本發(fā)明人設(shè)想在I型糖尿病早期應(yīng)用針對CCR5的ShRNA(慢病毒 載體或腺相關(guān)病毒構(gòu)建的CCR5-ShRNA以及直接合成的CCR5RNAi片段），下調(diào)CCR5的表達(dá)， 從而達(dá)到減緩I型糖尿病進(jìn)程的目的。
[0013] 本發(fā)明的第一方面，是提供一種抑制I型糖尿病CCR5基因表達(dá)的干擾序列 (SiRNA、ShRNA)。
[0014] 本發(fā)明設(shè)計(jì)針對hCCR5 (GenBank Accession No. U57840)為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)RNAi，靶序列 分別為
[0015] 1. GAGCGTGACTGATATCTAC(186-204)(SEQ ID NO:1)
[0016] 2. AGCTTCATAAGGCGCATGC(390-408)(SEQ ID NO :2)
[0017] 針對上述靶點(diǎn)，本發(fā)明設(shè)計(jì)、合成并篩選SiRNA，選擇LOOP連接成短發(fā)夾ShRNA。
[0018] CCR5 - shRNA- 1
[0019] 5 ' -GATCCGAGCGTGACTGATATCTACTTCAAGACGGTAGATATCAGTCACGCTCTTTTTTGTCGACA-3'（SEQ ID NO :3)
[0020] 3'-GCTCGCACTGACTATAGATGAAGTTCTGCCATCTATAGTCAGTGCGAGAAAAAACAGCTGTTCGA-5'（SEQ ID NO :4)
[0021] 轉(zhuǎn)錄合成的ShRNA:
[0022]

【權(quán)利要求】
1. 一種抑制I型糖尿病CCR5基因表達(dá)的干擾序列，其RNA序列如SEQ ID NO: 3或4所 /_J、1 ο
2. -種含有如權(quán)利要求1所述的抑制I型糖尿病CCR5基因表達(dá)的干擾序列的重組載 體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于，該重組載體采用GFP標(biāo)記的U6啟動 子的質(zhì)粒載體pGenesil - 1。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于，構(gòu)建方法如下： A、 合成 CCR5-shRNA-l 片段： 選擇合適的酶切位點(diǎn)BamH I和EcoR I，根據(jù)祀序列序列，設(shè)計(jì)其shRNA序列如下， 正義鏈如SEQ ID NO:3所示； 反義鏈如SEQ ID NO:4所示； B、 構(gòu)建到真核表達(dá)載體pGenesil - IsiRNA，獲得pGenesil - l_CCR5_shRNAl重組表 達(dá)載體。
5. -種抑制I型糖尿病CCR5基因表達(dá)的干擾序列在制備治療I型糖尿病藥物中的應(yīng) 用。
6. -種如權(quán)利要求2至4任一所述的重組載體在制備治療I型糖尿病藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/113GK104059918SQ201410290393
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月25日
【發(fā)明者】王棟, 郭滿盈, 孫瑜, 郭葆玉, 邱磊, 許家軍, 楊向群, 黃會龍, 張冉, 弓雪蓮, 李玉泉, 劉鎮(zhèn) 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)