一種具有降解棉酚作用的熱帶假絲酵母及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種具有降解棉酚作用的熱帶假絲酵母及其應(yīng)用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]棉柏(Cottonseed Meal, CSM)是棉籽經(jīng)脫殼、加熱、壓扁成薄片用溶劑己燒浸出油后，所剩余的副產(chǎn)品。棉柏是重要的蛋白飼料資源之一，其粗蛋白含量約為40%，僅次于豆柏，而且我國(guó)是世界產(chǎn)棉大國(guó)，棉花產(chǎn)量居世界第一位，每年棉籽餅柏產(chǎn)量約400-500萬(wàn)噸。但是，棉柏卻得不到高效利用，究其原因，是因?yàn)槊薹拥扔卸疚镔|(zhì)的存在，使得其應(yīng)用大大受到限制。近年來(lái)隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，世界范圍內(nèi)蛋白質(zhì)飼料的缺乏日益突出。棉籽餅柏是當(dāng)前形勢(shì)下理想的替代豆柏的植物蛋白質(zhì)源，而且棉籽餅柏價(jià)格低廉，現(xiàn)時(shí)售價(jià)不到大豆餅柏價(jià)格的一半，對(duì)棉籽餅柏的開(kāi)發(fā)利用，無(wú)疑會(huì)給我國(guó)畜牧業(yè)帶來(lái)顯著的經(jīng)濟(jì)效益。
[0003]棉酚(Gossypol)俗稱棉毒素，是棉籽腺體中一種黃色的多酚色素，分子式為C3oH3o08,分子量518.5。游離棉酸(Free Gossypol, FG)的毒性作用主要表現(xiàn)如下:破壞睪丸生精上皮，影響動(dòng)物的生殖機(jī)能；對(duì)腸胃黏膜有刺激作用，易引起腸胃黏膜發(fā)炎出血；使機(jī)體神經(jīng)受到損傷及抑制等。飼料中游離棉酚含量超過(guò)安全界限，將導(dǎo)致畜禽食欲下降、生長(zhǎng)遲緩、體重減輕、腹瀉、毛發(fā)脫落、不育等，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致心肌損傷，引起內(nèi)臟充血和水腫，胸腔和腹腔體液浸出、出血、甚至死亡。
[0004]目前，一些公開(kāi)專(zhuān)利文獻(xiàn)涉及棉酚降解的方法及其應(yīng)用，例如CN 104146166 A公開(kāi)了一種添加七水硫酸亞鐵和晶體賴氨酸的棉柏飼料，能有效降低其中游離棉酚的含量；CN 103766597 A公開(kāi)了一種新的飼料加工技術(shù)——蒸汽爆破處理技術(shù)，可以快速高效地去除棉柏中的游離棉酚；CN 102178030 A公開(kāi)了一種添加1 %的NaOH溶液進(jìn)行棉副產(chǎn)品脫棉酚的方法。但是，目前涉及利用厭氧發(fā)酵的方式來(lái)高效降低棉柏中棉酚含量的專(zhuān)利申請(qǐng)文件不多，例如CN 104031852 A公開(kāi)了一種產(chǎn)朊假絲酵母菌固態(tài)發(fā)酵棉桿，降解率達(dá)53.9%;CN 102154120 A公開(kāi)了一種稻根霉菌發(fā)酵棉柏后，對(duì)棉酚的降解率為61.38%。
[0005]前人多用霉菌進(jìn)行好氧發(fā)酵棉柏，此過(guò)程中，由于與空氣充分接觸，容易造成雜菌污染，其他雜菌跟著一起發(fā)酵，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)品容易二次污染，這樣發(fā)酵后的棉柏不但做不到安全脫毒，反而有可能增加其毒性。而本發(fā)明篩選出的熱帶假絲酵母，不僅對(duì)于游離棉酚的降解率高達(dá)80%以上，而且發(fā)酵方式采用厭氧發(fā)酵，相比于前人的好氧發(fā)酵，具有諸多優(yōu)勢(shì):能有效抑制雜菌，防止二次污染；發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白等其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量上升，使得棉柏在脫毒的同時(shí)，又不會(huì)破壞其中的營(yíng)養(yǎng)成分，使得棉柏飼料真正做到安全無(wú)毒；發(fā)酵后的棉柏伺料富有特殊風(fēng)味，能有效增加適口性，大大提尚棉柏作為畜禽伺料的利用率。
[0006]因此，篩選出一種能通過(guò)厭氧發(fā)酵高效降解棉酚的菌株，并在棉柏以及其他棉副產(chǎn)品中實(shí)際應(yīng)用就顯得十分必要。本發(fā)明在總結(jié)現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究，終于完成了本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于針對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐中的實(shí)際問(wèn)題和需求，探究篩選出一種新型的游離棉酚降解菌，使用本發(fā)明所述熱帶假絲酵母可以使高棉酚含量棉柏中的游離棉酚去除率達(dá)到82.63%，并且有很好的菌株穩(wěn)定性。使用該降解菌株可以高效降解棉籽柏中的游離棉酚，使之達(dá)到使用標(biāo)準(zhǔn)，把棉籽柏變成可利用的飼料蛋白源，對(duì)提高棉籽柏的高效利用率以及促進(jìn)我國(guó)飼養(yǎng)業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。
[0008]本發(fā)明獲得的熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)，于2015年06月23日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC N0.11000。
[0009]所述熱帶假絲酵母CGMCC N0.11000具有以下特性:
[0010](1)菌落特征:在YH)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落呈奶油色，稍有光澤，軟而平滑，有褶皺，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)呈卵圓形。
[0011](2)生長(zhǎng)特性:熱帶假絲酵母CGMCC N0.11000以28_35°C的生長(zhǎng)溫度為佳，在30°C條件下培養(yǎng)，該菌株在液體YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)8h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)20h左右進(jìn)入穩(wěn)定期。生長(zhǎng)曲線如圖1。
[0012](3)熱帶假絲酵母CGMCC N0.11000能以游離棉酚為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，在游離棉酚(FG)濃度為0.lg/L的唯一碳源培養(yǎng)基中，對(duì)FG的降解率最高可達(dá)到82.56%。游離棉酚的降解率隨著時(shí)間的變化曲線如圖2。
[0013]本發(fā)明提供的熱帶假絲酵母CGMCC N0.11000可用于生物降解游離棉酚，可在高濃度游離棉酚含量的棉籽柏的生物處理中應(yīng)用。發(fā)酵后可有效降低棉柏中游離棉酚的含量，具有十分廣泛的應(yīng)用前景。
[0014]生物材料保藏
[0015]熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)，該菌株已于2015年06月23日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC N0.11000。
【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為熱帶假絲酵母CGMCC N0.11000的生長(zhǎng)曲線。
[0017]圖2為不同時(shí)間下熱帶假絲酵母CGMCC N0.11000對(duì)游離棉酚的降解效果圖。
[0018]圖3為溫度對(duì)熱帶假絲酵母CGMCC N0.11000降解游離棉酚能力的影響。
[0019]圖4為pH值對(duì)熱帶假絲酵母CGMCC N0.11000降解游離棉酚能力的影響。
[0020]圖5為利用熱帶假絲酵母CGMCC N0.11000發(fā)酵前后棉柏中游離棉酚的含量變化圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0022]實(shí)施例1游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)液的配置
[0023]所述游離棉酚為游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)品，由江南大學(xué)油脂及植物蛋白工程研究中心提供，使用時(shí)配制成1000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)液。具體配制方法為:精確稱取lOOmg的游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)品，將其溶解于lOOmL的乙腈中，于棕色容量瓶中定容，充分混勻溶解后，轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中，置于_20°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0024]實(shí)施例2降解游離棉酚的酵母菌的篩選
[0025]配制以游離棉酚為唯一碳源的固體培養(yǎng)基，其中無(wú)碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方如下:硫酸,安5g，磷酸二氫鉀lg，氯化鈉0.lg，硫酸鎂0.5g，氯化I丐0.lg，酵母膏0.2g,吐溫807.5ml，瓊脂20g。加去離子水至1000mL，115°C濕熱滅菌20min。無(wú)菌條件下，在滅過(guò)菌的無(wú)碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，加入游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)液，使其濃度達(dá)到0.lg/L。
[0026]將分離自傳統(tǒng)發(fā)酵食品的不同酵母菌株涂布于上述以游離棉酚為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上，同時(shí)，以不加碳源的培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為陽(yáng)性對(duì)照。30°C下靜置恒溫培養(yǎng)，定期觀察菌株的生長(zhǎng)情況，進(jìn)行初步篩選。將初篩選出的部分菌株，接種于以游離棉酚為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中，利用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)其中游離棉酚含量的變化，從而篩選出能高效降解游離棉酚的酵母菌株，獲得熱帶假絲酵母CGMCCN0.11000ο
[0027]實(shí)施例3熱帶假絲酵母CGMCC N0.11000生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
[0028]取_20°C甘油管保存的熱帶假絲酵母CGMCC N0.11000，將其在YPD固體培