一種富硒光滑假絲酵母菌株fxy-4及其培養(yǎng)方法和作為魚飼料添加劑的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明設(shè)及一種富砸光滑假絲酵母菌株 FXY-4及其培養(yǎng)方法和作為魚飼料添加劑的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 砸（Se)是動(dòng)物體必需的微量元素，在維護(hù)動(dòng)物健康方面發(fā)揮著重要作用，但過量 的砸會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒害作用，因此砸在動(dòng)物飼料中最適添加量的研究得到了廣泛開展。魚 類飼料中砸的營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究表明，飼料中過高或過低的砸含量均會(huì)影響魚類健康。水產(chǎn)集約 化養(yǎng)殖過程中，一些致病菌，特別是腸道條件性致病菌，能迅速繁殖，進(jìn)而引發(fā)相應(yīng)的疾病。 目前，主要是通過在飼料中添加抗生素的方法來控制和減弱應(yīng)激?？股匮a(bǔ)給后可W抑制 魚腸道致病菌的生長(zhǎng)繁殖、有利于有益菌的生長(zhǎng)，從而維持腸道的正常微生物群落結(jié)構(gòu)。然 而，抗生素在飼料中的大量使用存在著嚴(yán)重的弊端，比如抗生素引起內(nèi)源性感染和二重感 染、耐藥菌株的產(chǎn)生、免疫力下降和水產(chǎn)品及環(huán)境中殘留等。益生菌具有安全、無污染、具有 免疫增強(qiáng)功能等優(yōu)點(diǎn)，成為抗生素替代品的首選，而酵母更是益生菌中使用最廣泛的一種 微生態(tài)制劑。
[0003] 充分發(fā)揮富砸酵母增強(qiáng)免疫和促進(jìn)生長(zhǎng)的活性，篩選得到富砸能力強(qiáng)的酵母，對(duì) 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本專利篩選具有增強(qiáng)免疫和抗應(yīng)激功能的富砸能力強(qiáng)的 光滑假絲酵母菌株；同時(shí)，飼料中添加該菌株后，可W降低抗生素在飼料中的添加量，從而 有效降低飼料生產(chǎn)成本。目前，高產(chǎn)富砸光滑假絲酵母在水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料中的應(yīng)用尚未有報(bào) 道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種富砸光滑假絲酵 母，然后通過化學(xué)誘變方法，獲得了 1株高產(chǎn)富砸酵母FXY-4。通過鑒定，該菌株不僅具有光 滑假絲酵母（Candidagl油rata)的生理生化特性，且同時(shí)具備高富砸能力和益生屬性。 陽0化]本發(fā)明另一目的在于提供了上述所述光滑假絲酵母（Candidagl油rata)FXY-4的 培養(yǎng)方法。
[0006] 本發(fā)明的還一目的在于提供了上述所述富砸光滑假絲酵母（Candidagl油rata) FXY-4作為魚飼料添加劑的應(yīng)用。
[0007] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取W下技術(shù)方案：一種富砸光滑假絲酵母FXY-4,其 獲得方式如下：
[0008] 將泡菜汁樣品稀釋后涂布到Y(jié)EPDQOg酵母粉，20g蛋白腺，20g葡萄糖，1L水， P冊(cè).0)培養(yǎng)基的平板上，28Γ下培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間觀察菌落生長(zhǎng)狀態(tài)，并挑取單菌落轉(zhuǎn)接 到Y(jié)EPD斜面上保存，然后用含NazSeOs(終濃度為0. 5g/L)的YEPD培養(yǎng)基中進(jìn)行富砸酵母菌 的篩選，隨后將初篩得到的酵母菌用YEPD培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每株菌分為空白組和實(shí)驗(yàn)組進(jìn) 行培養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)組中加入NazSeOs(終濃度為0. 5g/L)，空白組中不加入，培養(yǎng)24h后，采用國(guó) 家標(biāo)準(zhǔn)方法（GB5009. 93-2010)-原子巧光光度計(jì)法測(cè)定砸元素含量，獲得1株富砸能力 最強(qiáng)的酵母原始菌株，經(jīng)化學(xué)誘變后與生理生化鑒定后確定其分類命名為：光滑假絲酵母 (Candidagl油rata)FXY-4,該細(xì)菌已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、（CCTCC)，地址：中國(guó) 武漢武漢大學(xué)，其保藏編號(hào)為：CCTCCNO:M2015664,保藏日期為2015年11月6日。
[0009] 本發(fā)明另一目的在于提供了上述所述富砸光滑假絲酵母（Candidagl油rata) FXY-4的培養(yǎng)方法，所述方法包括如下步驟：
[0010] (1)將光滑假絲酵母（Candidagl油rata)FXY-4在搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫 度為28~30°C，抑值為6.0~6. 8,轉(zhuǎn)速為180~2(K)r/min，發(fā)酵時(shí)間為24~32h，搖瓶 發(fā)酵培養(yǎng)基為YEPD液體培養(yǎng)基：葡萄糖2 %，蛋白腺2 %，酵母粉1 % ;
[0011] (2)搖瓶發(fā)酵結(jié)束后在發(fā)酵罐中進(jìn)行中試發(fā)酵，取搖瓶發(fā)酵種子液接種到1化發(fā) 酵罐中，接種量為6~8%，發(fā)酵罐中裝4~化的培養(yǎng)基，發(fā)酵溫度為28~30°C，抑值為 6. 3~6. 8,攬拌速度為3(K)r/min，發(fā)酵28~32h，通氣比為1:1，發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵培養(yǎng)液 置于4°C備用，其中，發(fā)酵培養(yǎng)基為：乳糖15g、蛋白腺20g、酵母粉lOg、硝酸鐘2g、化2Se〇3 0. 5g、去離子水 1000ml，pH6. 5 ~6.8。
[0012] 一種富砸光滑假絲酵母FXY-4作為魚飼料添加劑的應(yīng)用，其應(yīng)用方法為：將本發(fā) 明的富砸光滑假絲酵母（Candidagl油rata)FXY-4發(fā)酵液直接在商業(yè)魚飼料中添加，添加 量為5X1〇6~10i°C即/Kg魚飼料。
[0013] 所述魚類可W為經(jīng)魚、羅非魚、邊魚、武昌魚等。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0015] 1、本發(fā)明的光滑假絲酵母（Candidagl油rata)FXY-4具有顯著增強(qiáng)免疫、促生長(zhǎng) 的功能，并通過動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)和健康具有促進(jìn)作用，從而節(jié)省養(yǎng)殖成本， 提高經(jīng)濟(jì)效益，具有良好的應(yīng)用前景；
[0016] 2、本發(fā)明的光滑假絲酵母（Candidagl油rata)FXY-4能在生長(zhǎng)繁殖過程中富砸， 從而在飼料中實(shí)現(xiàn)有機(jī)砸的補(bǔ)給； 陽017] 3、本發(fā)明的光滑假絲酵母（Candidagl油rata)FXY-4添加到飼料中后，可W增加 水產(chǎn)品中的有機(jī)砸含量，增加其附加值，節(jié)省有機(jī)砸在飼料中的添加量，從而有效降低飼料 生產(chǎn)成本。
【具體實(shí)施方式】
[001引 W下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用于限制本發(fā)明的范圍，如未特別說明，本發(fā)明 所用方法為常規(guī)技術(shù)，所用試劑均購自生化商店。
[0019] 實(shí)施例1:
[0020] 光滑假絲酵母FXY-4,其獲得方式如下：
[0021] 原始菌株的分離：
[0022] 將泡菜汁樣品稀釋后涂布到Y(jié)EPD培養(yǎng)基的平板上，28°C下培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間觀 察菌落生長(zhǎng)狀態(tài)，并挑取單菌落轉(zhuǎn)接到Y(jié)EPD斜面上保存，經(jīng)過初篩篩選到如下酵母菌株： FXY-1、FXY-3、FXY-4、FXY-5、FXY-7、FXY-10、FXY-11、FXY-19、FXY-21、FXY-23、FXY-24、 FXY-25、FXY-38、FXY-42、FXY-43、FXY-44、FXY-46、FXY-47、FXY-49、FXY-50、FXY-53、FXY-55、 FXY-56。
[0023] 在含NazSeOs(終濃度為0. 5g/L)的YEPD培養(yǎng)基中進(jìn)行富砸酵母菌的篩選，隨后將 初篩得到的酵母菌用YEPD培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每株菌分為空白組和實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行培養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn) 組中加入NazSeOs(終濃度為0. 5g/L)，空白組中不加入，培養(yǎng)24h后，采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法（GB 5009. 93-2010) 一一原子巧光光度計(jì)法測(cè)定砸元素含量，獲得1株富砸能力最強(qiáng)的酵母原始 菌株。接著將此菌株接種到Y(jié)EPD培養(yǎng)基中，搖瓶180轉(zhuǎn)/min, 3(TC培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取 菌液5血離屯、并用抑值為7. 0的憐酸緩沖液（PBS)洗兩次，再用PBS稀釋到濃度約為1〇1° 個(gè)/mU轉(zhuǎn)入10血離屯、管中，加入0. 8%的硫酸二乙醋（DE巧溶液，30°C誘變處理20min，再 按照2. 5倍DES溶液體積加入25 %硫代硫酸鋼溶液終止反應(yīng)，將誘變后的菌液取200μL涂 布在含NazSeOs(終濃度為0. 5g/L)的YEPD平板上，30°C培養(yǎng)4化后挑取單菌落，獲得一批 誘變菌株，最后采用原子巧光光度計(jì)法測(cè)定每株誘變酵母菌的砸含量，得到1株富砸能力 最強(qiáng)的誘變酵母菌株，經(jīng)過18SITSRNA序列測(cè)定與生理生化鑒定后被命名為富砸光滑假 絲酵母（Candidagl油rata)FXY-4,該細(xì)菌已于2015年11月6日送往中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏 中屯、進(jìn)行保藏，分類命名：光滑假絲酵母（Candidagl油rata)FXY-4 ;保藏編號(hào)：CCTCCNO: Μ2015664 ;地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)。
[0024] 實(shí)施例2 陽0巧]酵母菌株FXY-4(保藏編號(hào)：CCTCCNO:Μ2015664) 18SITSrRNA基因序列分析：
[0026] (1)染色體DM(小量）的提取：
[0027] 1.取 1. 5血菌液于 1. 5mLE卵endo;rf管中，12OOOr/min離屯、5min;
[0028] 2.棄上清，900 μ L憐酸緩沖液（PB巧重懸沉淀，4°C12OOOr/min離屯、5min;
[0029] 3.棄上清，加入300TE和200μLlOmg/血溶菌酶，吹吸混勻，37°C溫育比，每隔 15min顛倒混勻一次；
[0030] 4.向沉淀加入 600TENS裂解液（200mmol/L化Cl，100mmol/LTrU-肥 1P冊(cè).0， 2.0%SDS，50mmol/L邸TA，0.5%TritonX-100)和 20mg/mL蛋白酶KlOyL，顛倒混勻， 55°C溫育比，每隔15min顛倒混勻一次； 陽的1] 5. 4°C12OOOr/min離屯、5min，取上清；
[0032] 6.向上清中加入等體積的P:C: 1(25 : 24 : 1)充分混勻，4°C12OOOr/min 離屯、lOmin; 陽03引 7.重復(fù)步驟6;
[0034] 8.將上清轉(zhuǎn)入新的EP管中，加入1/10體積的3mol/L醋酸鋼，2倍體積的無水乙 醇，混勻，-20°C下放置 60min，4°C12OOOr/min離屯、lOmin;
[0035] 9.棄上清，將離屯、管倒扣在吸水紙上，吸干液體后風(fēng)干，加入30μL無菌水和 lOmg/mLRNaseA0. 5yL，-20°C保存。
[0036] 1. 2 18SITSrRNA基因序列的PCR擴(kuò)增
[0037] (2)PCR擴(kuò)增 W38]W剛提取并檢測(cè)合格的染色體DM為模板，利用由上海英驗(yàn)生物公司 合成的引物（上游引物口51，5'-1'(1^了466了644(：口'6〔66-3'；下游引物口54， 5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進(jìn)行口SrRNA基因序列的PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系見表1。 [0039]表1PCR擴(kuò)增引物
[0040]
陽〇W PCR擴(kuò)增條件：
[0042] Step]； 預(yù)變t'l; 94T，lOniin; St