一種發(fā)酵與膜分離耦合生產(chǎn)長鏈二元酸的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明的技術方案屬于發(fā)酵工程技術領域，具體涉及一種發(fā)酵與膜分離耦合生產(chǎn)長鏈二元酸的方法。
【背景技術】
[0002]長鏈二元酸是合成香料、工程塑料、熱熔膠、涂料、潤滑油、樹脂和醫(yī)藥等的重要原料。
[0003]目前，長鏈二元酸主要采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，利用微生物雙端氧化的特殊功能發(fā)酵正烷烴制取長鏈二元酸。國內(nèi)外生產(chǎn)菌株的ω-氧化能力較強，產(chǎn)酸可達200g/L，但在生產(chǎn)長鏈二元酸過程中面臨的一個首要問題是生產(chǎn)效率較低。因此，為了解決該問題研究人員從菌種篩選方面做了大量的工作，如中國專利CN1233658A公開了一種生產(chǎn)長鏈二元酸的熱帶假絲酵母菌的篩選方法，該方法能快速而高效的獲得α、ω-氧化能力強的假絲酵母突變菌株，為提高產(chǎn)酸量和轉化率打下基礎。另外，中國專利CN1130685A、CN1162644A、CN1369464A、CN1092108A、CN1034579A、CN1046757A 分別公開了通過硝基胍、亞硝酸和紫外線多次反復誘變，選育ω-氧化能力更強的熱帶假絲酵母突變株并以烷烴作為生長碳源，氧化正烷烴生產(chǎn)長鏈二元酸的方法，這些菌株對十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸、十七碳二元酸有一定效果。上述方法主要從菌種改良方面提高發(fā)酵效率，而菌種改良的工作量大，不確定因素多且發(fā)酵效率仍然較低，如專利CN1928100A中DC12生產(chǎn)效率是1.3g/L *h，專利CN102115765A中十七碳二元酸的生產(chǎn)效率為L 13g/L.h，專利CN10225411A中混合二元酸的生產(chǎn)效率僅有0.92g/L.h，因此如何進一步提高二元酸的發(fā)酵效率仍是急需解決的問題之一。
[0004]到目前為止，專利和文獻主要是側重于菌種的改造以獲得高產(chǎn)二元酸的菌株的方面，而鮮有針對發(fā)酵工藝改變而提高其效率的報道。因此，本專利主要針對長鏈二元酸發(fā)酵過程的特點，開發(fā)一種發(fā)酵與膜分離耦合生產(chǎn)長鏈二元酸的新技術。該技術利用膜工藝回流菌體并分離出已合成的高濃度二元酸，降低產(chǎn)物二元酸對其合成過程的抑制作用，提高發(fā)酵過程的菌體密度，縮短發(fā)酵周期，提高合成二元酸的生產(chǎn)強度；特別是采用膜分離回流菌體時，未被利用的正烷烴也同時返回至發(fā)酵過程，降低了二元酸提取過程分離正烷烴的難度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對目前微生物合成長鏈二元酸過程生產(chǎn)效率低下的問題，本發(fā)明所解決的技術問題是:發(fā)酵過程中利用膜技術回流菌體并分離出已合成的高濃度二元酸，降低產(chǎn)物二元酸對其合成過程的抑制作用；提高發(fā)酵過程的菌體密度，縮短發(fā)酵周期，提高合成二元酸的生產(chǎn)強度；膜分離回流菌體時，未被利用的正烷烴也同時返回至發(fā)酵過程，降低了二元酸提取過程分離正烷烴的難度。
[0006]本發(fā)明解決該技術問題所采用的技術方案是:
[0007]—種發(fā)酵與膜分離耦合生產(chǎn)長鏈二元酸的方法，包括如下步驟:
[0008](I)將維斯假絲酵母ipe-1 (Candidaviswanathii ipe_l)培養(yǎng)成的種子液接入pH5.0-8.5含有5-40% (v/v) 10-18個碳原子的正烷烴和95-60% (v/v)包括糖質多元底物做生長碳源的液體發(fā)酵培養(yǎng)基混合液中；液體發(fā)酵培養(yǎng)基包括:糖質10-90g/L,金屬磷酸鹽 2-10g/L，酵母膏 l_6g/L，玉米漿 l-3g/L，尿素 0.5-1.5g/L，NaCl0.5-lg/L，鉀鹽 1-1Og/L，吐溫 0.5-1.5g/L ；
[0009](2)上述混合液在24_40°C、通氣量0.1-3.0vvm下發(fā)酵42_194h，啟動發(fā)酵與膜分離耦合裝置，采用分批補料發(fā)酵、半連續(xù)發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵的形式，經(jīng)膜組件分離后的細胞循環(huán)回發(fā)酵罐，經(jīng)膜組件分離后的透過液進入提取環(huán)節(jié)制備長鏈二元酸，同時向發(fā)酵罐中補充液體發(fā)酵培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵過程；
[0010](3)在上述發(fā)酵過程中，通過連續(xù)或間歇的方式補加正烷烴，使發(fā)酵液中正烷烴濃度始終大于等于1% (v/v)。
[0011]本專利米用的維斯假絲酵母ipe_l (Candida viswanathii ipe_l)已在2014年2月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種編號CGMCCN0.8824。
[0012]為實現(xiàn)上述過程，發(fā)酵與膜分離耦合裝置中采用的膜為微濾膜或超濾膜，膜材料為:聚砜、聚醚砜、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯腈有機膜，氧化鋁質、氧化鈷質、氧化硅質、硅酸鋁質、碳化硅質陶瓷膜，Ag膜、Ni膜、Ti膜及不銹鋼膜金屬膜或金屬與陶瓷復合型無機膜；膜組件的型式為平板式、外壓中空纖維式或管式；當采用微濾膜時，膜的孔徑為0.l-ι μ m的有機或無機膜，處理中的壓力是0.01-0.2Mpa ;當采用微濾膜時，膜截留分子量為1-1，OOOKDa的有機或無機膜，處理的壓力是0.1-1.0Mpa0
[0013]發(fā)酵與膜分離耦合發(fā)酵過程，可以采用分批補料發(fā)酵、半連續(xù)發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵的形式。所述的分批補料發(fā)酵指的是發(fā)酵過程中通過連續(xù)或間歇的方式補加正烷烴和液體發(fā)酵培養(yǎng)基的混合液或僅補充正烷烴，直至發(fā)酵罐允許最大體積，當發(fā)酵罐中產(chǎn)物濃度未達到其最大發(fā)酵濃度時，采用分離耦合裝置移除一定的發(fā)酵體積直至發(fā)酵初始體積，之后繼續(xù)補料發(fā)酵過程，該過程反復進行，直至達到產(chǎn)物最大發(fā)酵濃度時終止該發(fā)酵過程；所述的半連續(xù)發(fā)酵指的是在發(fā)酵進行42-194h時，通過分離耦合裝置移除產(chǎn)物二元酸，直至分離耦合裝置死體積時，采用0-3倍耦合裝置死體積的無菌水洗滌菌體，然后將菌體全部返回發(fā)酵罐中并一次性補加權利要求1步驟(I)中的包括烷烴和液體發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵成份，繼續(xù)發(fā)酵過程，該過程反復進行；所述的連續(xù)發(fā)酵指的是發(fā)酵進行42-194h時，通過分離耦合裝置移除已合成的二元酸，同時連續(xù)向發(fā)酵體系內(nèi)補充步驟I中的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，以連續(xù)或間歇的方式補加正烷烴，并以維持發(fā)酵液體積恒定、維持發(fā)酵液中殘留二元酸濃度恒定或維持發(fā)酵液中殘留烷烴濃度恒定的方式連續(xù)進行發(fā)酵過程。
[0014]該技術對不同菌種轉化含有10-18個碳原子正烷烴或其混合物，進而合成相應的二元酸均有顯著效果，特別是對于轉化含有12-17個碳原子正烷烴或其混合物的效果更顯著。
[0015]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，有益效果是:第一，采用膜技術使發(fā)酵過程的二元酸移出發(fā)酵體系，降低產(chǎn)物抑制作用；第二，采用膜技術使發(fā)酵過程的菌體回流至發(fā)酵過程，提高發(fā)酵體系的菌體密度，縮短發(fā)酵周期；第三，實現(xiàn)了細胞的循環(huán)使用，降低了發(fā)酵前期培養(yǎng)細胞的物質消耗和培養(yǎng)時間，提高了二元酸的底物轉化率；第四，膜分離回流菌體時，未被利用的正烷烴也同時返回至發(fā)酵過程，降低了二元酸提取過程分離正烷烴的難度。
【具體實施方式】
[0016]下面結合實施例對本發(fā)明做進一步說明，本發(fā)明所涉及的主題保護范圍并非僅限于這些實施例。
[0017]實施例1
[0018]本實施例為不添加發(fā)酵與膜分離耦合裝置的發(fā)酵過程，作為添加發(fā)酵與膜分離耦合裝置的對照，發(fā)酵合成長鏈二元酸的過程如下:
[0019]第一步，培養(yǎng)基配制
[0020]①斜面培養(yǎng)基:麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基；
[0021]②種子培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L，磷酸氫二鈉2g/L，酵母膏l(xiāng)g/L，玉米漿2g/L，尿素0.5g/L，正十二烷 100mL/L ；
[0022]③發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L，磷酸氫二鈉2g/L，酵母膏l(xiāng)g/L，玉米漿2g/L，尿素0.5g/L，NaCl lg/L, KCl lg/L,正十二烷 300mL/L，吐溫 801g/L。
[0023]第二步，菌種活化
[0024]取一環(huán)維斯假絲酵母(Candida viswanathii)涂布在20X 180mm的大試管固體斜面培養(yǎng)基上，于27°C培養(yǎng)72h。
[0025]第三步，種子培養(yǎng)
[0026]將斜面上活化的種子培養(yǎng)物接種于裝10ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，在27°C,200r/min條件下振蕩培養(yǎng)40小時。
[0027]第四步，接種發(fā)酵
[0028]將第三步制得的培養(yǎng)物以10%的接種量接種于裝3L發(fā)酵培養(yǎng)基的7.5L發(fā)酵罐中，初始PH6.0，溫度27°C，通氣量1.0vvm，通過連續(xù)或間歇的方式補加正十二烷，使發(fā)酵液中正十二烷濃度始終大于等于1%(ν/ν)，培養(yǎng)42h產(chǎn)酸60.5g/L，培養(yǎng)194h時產(chǎn)酸210.2g/L發(fā)酵結束，平均產(chǎn)酸速率為1.08g/h.L0
[0029]實施例2
[0030]按如下步驟發(fā)酵合成長鏈二元酸:
[0031]第一步，培養(yǎng)基配制
[0032]同實施例1
[0033]第二步，菌種活化
[0034]同實施例1
[0035]第三步，種子培養(yǎng)
[0036]同實施例1
[0037]第四步，接種發(fā)酵
[0038]將第三步制得的培養(yǎng)物以10%的接種量接種于裝3L發(fā)酵培養(yǎng)基的7.5L發(fā)酵罐中，初始PH6.0，溫度27°C，通氣量1.0vvm,培養(yǎng)42h。啟動膜組件使菌體經(jīng)膜組件回流至發(fā)酵罐中，經(jīng)過膜組件的滲透液進入提取環(huán)節(jié)。當發(fā)酵罐中DC12濃度小于10g/L時，降低經(jīng)分離耦合裝置后透過液的流出速率；當發(fā)酵罐中DC12>50g/L時，提高經(jīng)分離耦合裝置后透過液的流出速率；此過程通過補充新鮮的培養(yǎng)基控制發(fā)酵罐內(nèi)體積恒定，新鮮培養(yǎng)基中包括葡萄糖20g/L,磷酸氫二鈉2g/L,酵母膏l(xiāng)g/L,玉米衆(zhòng)2g/L,尿素0.5g/L, NaCl lg/L, KCl Ig/L，吐溫801g/L，同時通過連續(xù)或間歇的方式補加正十二烷，使發(fā)酵液中正十二烷濃度始終大于等于1%(ν/ν)。所述的膜組件采用微濾膜，操作壓力是0.2Mpa，膜孔徑為0.5 μ m的管式有機膜。發(fā)酵300h，平均產(chǎn)酸速率2.0g/h-L,較對照提高1.85倍，長鏈二元酸平均濃度30.7g/L。
[0039]實施例3
[0040]按如下步驟發(fā)酵合成長鏈二元酸:
[0041]第一步，培養(yǎng)基配制
[0042]同實施例1
[0043]第二步，菌種活化
[0044]同實施例1
[0045]第三步，種子培養(yǎng)
[0046]同實