檢測光滑假絲酵母菌的試劑盒、引物和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測光滑假絲酵母菌的試劑盒、引物和方法，所述試劑盒包括序列組成如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的內(nèi)引物、如SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的外引物、以及如SEQ ID No:5所示的環(huán)引物，以待測樣本組織的基因組DNA作為模板，采用所述引物進行實時熒光環(huán)介導(dǎo)恒溫PCR反應(yīng)，收集熒光信號，繪制擴增曲線，即可快速檢測光滑假絲酵母菌。本發(fā)明的快速檢測光滑假絲酵母菌的方法特異性好，靈敏度高，重復(fù)性好，且操作要求低，簡單快速，具有較好的發(fā)展意義和推廣前景。
【專利說明】
檢測光滑假絲酵母菌的試劑盒、引物和方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于微生物的檢測方法技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種快速檢測光 滑假絲酵母菌的引物、試劑盒和方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來隨著廣譜抗菌藥物和免疫抑制劑的廣泛使用，由光滑假絲酵母菌引起的黏 膜和系統(tǒng)性感染病顯著地增加，常見于免疫力低下或者合并糖尿病人群，且治療十分困難 往往對許多唑類抗真菌藥物耐受，特別是氟康唑，因此具有很高的死亡率。由于臨床對光滑 假絲酵母菌分離率及其感染率的上升，因此加強對光滑假絲酵母菌的快速鑒定研究具有現(xiàn) 實的意義。
[0003] 隨著科學(xué)的發(fā)展和生物分子學(xué)的深入研究，Notomi等科學(xué)家發(fā)明了一種新型的等 溫擴增技術(shù)一環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)，此法是針對目的基因的6個區(qū)域設(shè)計4-6條特異性引 物，利用Bst DNA酶在恒溫條件(60°C~65°C)下反應(yīng)60min，便可將目的基因擴增IO9~IOiq 倍，擴增結(jié)果產(chǎn)物可與加入的DNA結(jié)合染料結(jié)合產(chǎn)生顏色變化，操作簡單，可高效、快速地檢 測序列，適用于多種檢測環(huán)境。
[0004] 國內(nèi)有報道采用重復(fù)序列PCR(REP-PCR)方法檢測光滑假絲酵母菌的研究，但是實 時熒光LAMP檢測光滑假絲酵母菌具有快速、敏感的特性，具有廣闊的發(fā)展前景，且此法檢測 光滑假絲酵母菌在國內(nèi)外尚未開展，故本發(fā)明希望探索出一套快速、靈敏檢測光滑假絲酵 母菌的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種快速檢測光滑假絲酵 母菌的引物、試劑盒和方法。
[0006] 為了實現(xiàn)以上發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：
[0007] 一種檢測光滑假絲酵母菌的試劑盒，包括有序列組成為SEQ ID No: 1和SEQ ID No: 2的內(nèi)引物，序列組成為SEQ ID No:3和SEQ ID No:4的外引物，序列組成為SEQ ID No:5 的環(huán)引物。
[0008] 在其中一些實施例中，所述試劑盒還包括有熒光染料SYT0-9。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種檢測光滑假絲酵母菌的引物，包括有序列組成為SEQ ID No: 1和SEQ ID No: 2的內(nèi)引物，序列組成為SEQ ID No:3和SEQ ID No:4的外引物，序列組成為 SEQ ID No:5的環(huán)引物。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種檢測光滑假絲酵母菌的方法，采用上述試劑盒，主要包括以 下步驟：
[0011] 1)提取待檢測樣品的基因組；
[0012] 2)加樣和加熒光染料后構(gòu)成反應(yīng)體系，進行環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增；
[0013] 3)檢測擴增產(chǎn)物。
[0014] 在其中一些實施例中，反應(yīng)體系中引物SEQ ID No:l、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、 SEQ ID No:4、SEQ ID 吣：5的濃度比為8:8:1:1:4。
[0015] 在其中一些實施例中，所述SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No: 4、SEQ ID No: 5在反應(yīng)體系中的濃度分別為I · 6ymol/L、I · 6ymol/L、0 · 2ymol/L、0 · 2ymol/L、 0·8ymol/L。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下顯著效果：
[0017] 1、本發(fā)明采用特殊的引物對，利用Rea-LAMP法(Real-Time Fluorescence Loop-Mediated Isothermal Amplif i cat ion) 測定 10 株相關(guān)菌株 ，只 有光滑假絲酵母菌出 現(xiàn)強陽 性，其他均為陰性;利用倍比稀釋法測定目的菌株，檢測下限達到2.23pg/ml，遠遠高于普通 PCR;重復(fù)測定3次樣本，變異系數(shù)CV小于5%，說明本發(fā)明的Rea-LAMP法測定光滑假絲酵母 菌具有較好的特異性、靈敏性、重復(fù)性;具有鑒定簡單、實時監(jiān)測等優(yōu)點，有利于快速檢測光 滑假絲酵母菌；
[0018] 2、本發(fā)明的Rea-LAMP法在配制反應(yīng)體系時便加入熒光物質(zhì)，無需像大多傳統(tǒng)的 LAMP檢測方法那樣在反應(yīng)結(jié)束后開蓋加入熒光染料，故在整個擴增檢測過程中都是閉管工 作，可從源頭上控制氣溶膠污染；同時，由于熒光染料的預(yù)先加入，儀器可在預(yù)先設(shè)置好的 每30秒檢測一次熒光信號，從而做到實時監(jiān)測；
[0019] 3、傳統(tǒng)的LAMP檢測方法結(jié)果判讀利用肉眼觀察擴增產(chǎn)物的濁度，故存在較大的主 觀誤差，而Rea-LAMP法利用熒光信號檢測擴增產(chǎn)物，具有較高的準確性；
[0020] 4、本發(fā)明的Rea-LAMP法使用的恒溫?zé)晒鈾z測儀工作原理簡單，提供LAMP反應(yīng)體系 需要的溫度和人為設(shè)置每30秒的對擴增產(chǎn)物進行檢測。
【附圖說明】
[0021 ]圖1為本發(fā)明試驗例1中的引物篩查結(jié)果圖；
[0022]圖2為本發(fā)明試驗例2中的Rea-LAMP方法引物特異性結(jié)果圖；
[0023]圖3為本發(fā)明試驗例3中的Rea-LAMP方法引物靈敏度結(jié)果圖；
[0024]圖4為本發(fā)明試驗例4中的Rea-LAMP方法重復(fù)性實驗結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0025]以下通過具體的實施例進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，具體實施例不代表對本發(fā) 明保護范圍的限制。其他人根據(jù)本發(fā)明理念所做出的一些非本質(zhì)的修改和調(diào)整仍屬于本發(fā) 明的保護范圍。
[0026]以下實施例中所使用的菌株由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗科微生物室分離、 VITEK2全自動微生物鑒定儀鑒定并于-70°C保存。實驗用菌株如下:光滑假絲酵母菌、化膿 性鏈球菌、近平滑假絲酵母、克柔假絲酵母、肺炎克雷伯桿菌、熱帶念珠菌、金黃色葡萄球 菌、糞腸球菌、白色念珠菌、馬爾尼非菌。
[0027]以下實施例中所使用的儀器有：加樣槍、微型離心機、振蕩器、干式恒溫金屬浴、 Thermo Scientific Nanodrop 2000微量分光光度計、超凈工作臺、迪澳恒溫焚光檢測儀 Deaou-308C、VITEK 2全自動微生物鑒定儀。主要試劑有:血平板、迪澳DNA擴增試劑盒24測 試/盒、天根細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型）、天根酵母基因組DNA提取試劑盒(離心 柱型）、ITSII基因引物由英濰捷基上海貿(mào)易有限公司合成）、超純水等除了特殊說明外，均 來源于市售。
[0028] 實施例中的步驟除了特殊說明外，均為本領(lǐng)域常規(guī)操作步驟，以下實施例中所使 用的原料，均來源于市售。
[0029] 實施例1光滑假絲酵母菌的快速檢測方法
[0030] 本實施例的光滑假絲酵母菌的快速檢測方法包括以下具體步驟：
[0031] (1)、細菌基因組DNA提取
[0032] 將-70°C保存的光滑假絲酵母菌201503A3、化膿性鏈球菌20150321、近平滑假絲酵 母GYSY14019001、克柔假絲酵母GYSY14019002、肺炎克雷伯桿菌20150322、熱帶念珠菌 201503A4、金黃色葡萄球菌20150324、糞腸球菌20150323、白色念珠菌GYSY14019003、馬爾 尼非菌GYSY14019004接種于血平板，在37°C溫箱培養(yǎng)18~24小時，取平板上的菌混于無菌 生理鹽水中制成Iml菌懸液。按照天根細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行操作。
[0033] (2)、引物設(shè)計與合成
[0034] 根據(jù)光滑假絲酵母菌的ITSII基因序列，利用LAMP引物設(shè)計軟件Primer Explorer 3設(shè)計引物。引物序列由英濰捷基上海貿(mào)易有限公司合成(見表1)。
[0035] 表1 Rea-LAMP檢測體系引物
[0037] (3)、Rea_LAMP反應(yīng)體系及配制
[0038]按照DNA擴增試劑說明書(迪澳公司）配制LAMP反應(yīng)體系。反應(yīng)體系如表2。
[0039] 表2 Rea-LAMP的反應(yīng)體系
LUU^Ij 兵1f，引被J丄rr/儀田女照濃度比8:8:1:1:4混合配制，使上述引 物加入25yL體系后濃度分別為1.6UM、1.6UM、0.2UM、0.2UM、0.8UM;加入DNA模板前加入20ul 密封液，防止DNA被污染。每次試驗均設(shè)置用CldH2O代替DNA模板的陰性對照。
[0042] (4)、Rea_LAMP 反應(yīng)
[0043] 在迪澳恒溫?zé)晒鈾z測儀Deaou_308C中進行Rea-LAMP反應(yīng)，反應(yīng)溫度為63°C，反應(yīng) 時間為60~90min，每30秒檢測一次熒光信號，收集熒光信號，繪制擴增曲線。
[0044] (5)、反應(yīng)結(jié)果
[0045] 當(dāng)機器收集的熒光強度達到1000 Omv時報陽，并呈峰，說明檢測到目標菌，本實施 例的樣品中只有光滑假絲酵母菌201503A3報陽，并呈峰形，其他菌都沒有呈峰形。
[0046]試驗例1實施例1的Rea-LAMP反應(yīng)的引物篩選
[0047]分別配制工作液:①加環(huán)引物工作液，②不加環(huán)引物工作液，把這兩種工作液分別 加入Rea-LAMP體系，對光滑假絲酵母菌的ITSII基因進行擴增，觀察擴增曲線，比較加、不加 環(huán)引物對基因 ITSII擴增的影響。
[0048] 結(jié)果見圖1，可觀察到在反應(yīng)后40min，加環(huán)引物(Positive control)出峰，且焚光 強度達到17021mV，不加環(huán)引物無出峰現(xiàn)象，由此可以得出結(jié)論:加環(huán)引物ITSII對光滑假絲 酵母ITSII基因有相對高的擴增效率，選擇該引物進行后續(xù)的實驗。
[0049] 試驗例2實施例1的Rea-LAMP反應(yīng)的引物特異性
[0050] 按實施例1的方法提取光滑假絲酵母菌及其他常見病原菌(化膿性鏈球菌、近平滑 假絲酵母、克柔假絲酵母、肺炎克雷伯桿菌、熱帶念珠菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、白色 念珠菌、馬爾尼非菌）的基因組DNA，按照Rea-LAMP的反應(yīng)條件進行擴增，分析檢測信號，評 價該引物的特異性。
[0051 ] 結(jié)果見圖2,可以看出，除了糞腸球菌在35min處出峰，且峰值僅僅達到5704mV，而 光滑假絲酵母菌在32min內(nèi)被特異性地檢測出來，峰值達到15000,而本試驗例選取其他常 見的病原菌在同樣的處理下均未出現(xiàn)擴增現(xiàn)象，表明該引物對光滑假絲酵母菌檢測的特異 性較好。本發(fā)明所設(shè)計的Rea-LAMP引物具有良好的特異性，與非目標菌不存在交叉反應(yīng)。
[0052] 試驗例3實施例1的Rea-LAMP反應(yīng)的引物靈敏性
[0053] 測定光滑假絲酵母菌的DNA液濃度，先用IyL TE液對Thermo ScientificNanodrop 2000微量分光光度計調(diào)0,再加1此光滑假絲酵母菌的DNA提取液，測量DNA模板濃度，為 22.3ngAiL。取5yL DNA原液用超純水進行10倍梯度稀釋6次，得到7個不同濃度的DNA模板， 加入Rea-LAMP體系中反應(yīng)，觀察擴增曲線，檢測引物對光滑假絲酵母菌的檢測靈敏度。 [0054] 結(jié)果見圖3,可以看出，本試驗例DNA模板濃度為22.3ngAiL、2.23 ngAxL、223pgAi L、22 · 3 pg/ml、2 · 23pg/ml，可分別在20min、23min、28min、30min、60min時出峰，說明可檢測 到原濃度為22.3ng/yL的DNA模板。說明本試驗例的檢測靈敏度可達到2.23pg/ml。
[0055] 試驗例4實施例1的Rea-LAMP反應(yīng)的重復(fù)性實驗
[0056] 用同一光滑假絲酵母菌DNA同時做3個重復(fù)性實驗，比較反應(yīng)曲線的重合度。
[0057]結(jié)果見圖4,可以看出，3個重復(fù)管幾乎同時出峰，且擴增曲線重合度好，報陽時間 為45min、44.5min、45min，CV值=0.64%，小于5%，說明Rea-LAMP的重復(fù)性良好。
[0058]以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并 不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來 說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護 范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。
【主權(quán)項】
1. 一種檢測光滑假絲酵母菌的試劑盒，其特征在于，包括有序列組成為SEQ ID N〇:l和 SEQ ID No:2的內(nèi)引物，序列組成為SEQ ID No:3和SEQ ID No:4的外引物，序列組成為SEQ ID No:5的環(huán)引物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，還包括有熒光染料SYTO-9。3. -種檢測光滑假絲酵母菌的引物，其特征在于，包括有序列組成為SEQ ID No: 1和 SEQ ID No: 2的內(nèi)引物，序列組成為SEQ ID No:3和SEQ ID No:4的外引物，序列組成為SEQ ID No:5的環(huán)引物。4. 一種檢測光滑假絲酵母菌的方法，其特征在于，采用權(quán)利要求1-2任一項所述的試劑 盒，主要包括以下步驟： 1) 提取待檢測樣品的基因組； 2) 加樣和加熒光染料后構(gòu)成反應(yīng)體系，進行環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增； 3) 檢測擴增產(chǎn)物。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述反應(yīng)體系中SEQ ID No: 1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID 吣：5的濃度比為8:8:1:1:4。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于，所述SEQ ID No :1、SEQ ID No: 2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID 如：5在反應(yīng)體系中的濃度分別為1.6以111〇1/1、1.6以111〇1/1、 0·2ymol/L、0·2ymol/L、0·8ymol/L〇
【文檔編號】C12N15/11GK106086181SQ201610438496
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月16日
【發(fā)明人】郭旭光, 何淑君, 黃美淦, 劉慶鋒, 鄧穗燕, 陳瓊, 夏勇
【申請人】廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院