專利名稱：具有腫瘤靶向性和腫瘤自殺性的溶瘤性抗癌重組腺病毒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于抗癌領域，涉及惡性腫瘤基因治療和溶瘤性病毒療法。以遺傳改造腺病毒的E1A基因而使重組腺病毒具有強大的溶瘤能力。同時，遺傳修飾腺病毒的纖維基因(fiber)導致溶瘤性重組腺病毒具有腫瘤靶向性。當攜帶有腫瘤自殺性基因時，這些重組腺病毒表現(xiàn)出更強的抗癌效應。在老鼠身上建立的多種人的腫瘤模型的試驗中，這些具有溶瘤性、腫瘤靶向性和腫瘤自殺性的重組腺病毒顯示出強大的抗癌能力。在正常細胞中，這些重組腺病毒沒有自我復制的能力，對正常組織的致病性很輕微，保證了臨床應用的安全性。
背景技術：
癌癥已成為現(xiàn)代社會頭號致死疾病，尤其在我國，隨著現(xiàn)代化的進展，人民的生活和飲食習慣的變化(如飲酒、抽煙、吃更多的肉類、等等)和環(huán)境污染的加劇，近十年來，肺癌、肝癌、胃癌、鼻咽癌、食道癌、腸癌、宮頸癌等的發(fā)病率呈快速上升趨勢。目前各國對惡性腫瘤的治療依然是以手術摘除為主，并加以化療和放療，這些常規(guī)的治療方法對早期癌癥有一定的效果，但對大多數(shù)的中晚期或轉移擴散了的惡性腫瘤則效果欠佳，且伴有明顯的副作用。因此，人們在研發(fā)新的癌癥診斷技術的同時，也在不斷地探索新的癌癥治療方法。
以腺病毒作載體的腫瘤基因治療就是近年來興起的一種很好的新方法。腺病毒自從上個世紀五十年代被分離鑒定以來，有關它的各個學科都得到了廣泛的研究，知之甚深。最常用的腫瘤基因治療的病毒載體是人的腺病毒5型，簡稱ad5。因為ad5具有如下優(yōu)點(1)具有廣譜的感染力，能感染人類多種器官和組織的細胞；(2)安全性高，除ad4，ad7，ad11，ad21和ad37型對人有致病性外(如引起氣管炎、結膜炎和嬰兒胃腸炎等)，ad5和其它型都無明顯的致病癥狀；(3)無引起宿主細胞的基因突變，因為病毒的DNA不整合到宿主細胞的染色體上；(4)易于培養(yǎng)繁殖，便于大規(guī)模生產(chǎn)和純化。
ab5是不含包膜的DNA病毒，形狀為規(guī)則的二十個三角形面體，并在每個角上長出一條纖維，即在外殼表面共有十二條纖維。腺病毒入侵細胞時主要通過粘附和進入兩個步驟。首先是病毒纖維的末端節(jié)以高度親和性粘在細胞表面的腺病毒受體(CAR)上。然后病毒外殼蛋白五鄰體的RGD短肽與細胞表面的受體 結合，引發(fā)細胞攝粒作用，將病毒吞飲入細胞內。病毒在細胞質內解體后，病毒的DNA(總長約36Kb)進入到細胞核內，在那里進行基因轉錄和DNA復制。根據(jù)腺病毒侵入細胞的基理，人們試圖通過改造或者修飾病毒纖維的末端和五鄰體的RGD短肽來改變腺病毒的宿主范圍，達到降低病毒對人正常細胞的感染，使病毒靶向腫瘤細胞，從而提高基因治療的效果。本發(fā)明在這方面有了很好的建樹。
腺病毒DNA進入細胞核后，首先是轉錄病毒的E1A基因。合成的E1A基因產(chǎn)物(蛋白)再引導E1B，E2，E3，和E4等病毒基因的表達。E1A基因產(chǎn)物激發(fā)細胞進入DNA復制期(S期)，E1B基因產(chǎn)物則影響mRNA的代謝、宿主細胞的蛋白合成和防止細胞提前進入凋亡期。E2基因產(chǎn)物是病毒DNA復制所必需的，而E3基因產(chǎn)物則主要調節(jié)宿主的免役反應。E4基因產(chǎn)物也參與DNA復制和病毒晚期基因(L1，L2，L3，L4和L5)的表達。這5個晚期基因的表達都起始于病毒的主要晚期啟動子(MLP)。由于E3基因的產(chǎn)物是病毒DNA復制和病毒組裝的非必需品，所以，E3基因常被除去以提供空間來裝入外源治療基因。因為MLP啟動子主要在病毒繁殖的晚期活動，它常被用來調控外源治療基因的表達，以期減少治療基因的表達對病毒的影響。E1A和E1B基因也常被人們進行改造，以期使ad5成為腫瘤特異性的治療基因載體。即E1A或者E1B突變型的ad5載體能專一性地在腫瘤細胞中進行復制、繁殖，將腫瘤細胞溶解和殺死(故稱為溶瘤性腺病毒載體)，而對正常細胞沒有(或者很輕)影響。本發(fā)明概括了我們在重組腫瘤特異性ad5載體和組織特異地表達腫瘤治療基因方面的努力和取得的顯著成效。
第一代腫瘤基因治療的腺病毒載體不具有自我復制的能力。在這類載體上，E1A，E1B和E3基因被去除掉。它們一般只能在帶有E1基因的細胞株(如HEK293)中繁殖。E1區(qū)間則由治療基因取代。腫瘤治療基因常為腫瘤抑制基因(如p53，Rb等)、各種干擾素基因和自殺性(毒性)基因(如CD，HSV1-tk等)。臨床表明，以沒有復制能力的ad5作腫瘤治療基因的載體是安全的。80％的成人都有ad5的抗體，所以少于15％的癌癥病人對ad5載體表現(xiàn)免疫反應癥狀。然而，治療腫瘤的臨床試驗效果并不理想。因為腺病毒對腫瘤細胞的感染力較低，限制了治療基因的表達和療效。同時，對肝臟細胞則有高度的感染力。當治療基因為自殺性(毒性)基因且其表達為非專一性(如由CMV啟動子調控)時，肝臟會表現(xiàn)中毒反應。
第二代腫瘤基因治療的ad5載體為溶瘤性重組腺病毒。在這類病毒中，E1A或者E1B基因被遺傳突變，或者它們的啟動子被具有腫瘤特異性的啟動子取代。因此，它們能在腫瘤或者具體一種腫瘤中進行DNA復制和繁殖，最終將腫瘤細胞溶解。而腫瘤細胞裂解所釋放出來的腺病毒則可感染周圍的腫瘤細胞，擴大它們的溶瘤能力和劑量效應。這類病毒載體對正常細胞也能感染，但無自我復制和繁殖的能力，所以對正常組織影響較輕。例如，ONYX-015(原名d11520)[參見Bischoff J.R.等，1996.Sciences 274373-376]，就是一種缺失了E1B-55KD基因的腺病毒(ad2和ad5復合型)。該病毒能在p53缺失型、突變型或失活型的腫瘤細胞中復制、繁殖、從而選擇性地殺死腫瘤細胞。在正常細胞和p53正常型的腫瘤細胞中，該病毒則不能自我復制。ONYX-015已在美國進行了III期臨床試驗，顯示一定的療效。但也存在不少的缺點。首先，它對p53正常型的腫瘤基本無效。此外，它在腫瘤細胞內的自我復制能力僅為其野生型的10％。[參見Fueyo J等2000，Oncogene 192-12]重組了一種E1A突變的腺病毒，名為Ad-△24。該病毒中E1A基因的CR-2區(qū)域(與pRb結合的位點)帶有一段24bp的缺失，能有效地在pRb缺失型，突變型或細胞復制失控型的腫瘤細胞中復制、繁殖和溶解細胞。在老鼠身上進行的人類惡性腫瘤模型的試驗中，該溶瘤性腺病毒表現(xiàn)出很強的抑制腫瘤生長的能力(優(yōu)于ONYX-015)。由于絕大部分惡性腫瘤都是pRb缺失型或者是pRb信息線路缺陷型，所以，E1A突變型的溶瘤性腺病毒會有更好的應用前景。最近，一種帶有E1A和E1B基因突變的溶瘤性腺病毒(CB1)也表現(xiàn)出很好的抗癌能力[參見Gomez-Manzano C，等2004，oncogene 231821-1828]。有關ad-△24和CB1的臨床試驗尚未見報道。
另一類的溶瘤性腺病毒則是用外源特異性的啟動子來取代E1A或者E1B基因的啟動子。利用腫瘤特異性的啟動子來調控E1A基因的表達來達成腺病毒溶瘤(復制)能力的腫瘤專一性，從而防止病毒在正常細胞中復制繁殖，提供更好的臨床安全性。針對前列腺癌的溶瘤性腺病毒CV706是一個典范[參見Rodriguez R等1997，Cancer Research 572559-2563]。在這種病毒中，前列腺專性抗原基因的啟動子(PSA)調控病毒E1A基因的表達。在前列腺抗原陽性的細胞中，CV706表現(xiàn)出很強的自我復制能力，能摧毀移植在老鼠身上人的前列腺腫瘤。第一期的臨床試驗結果也不錯。此外，利用別的組織或者腫瘤專異性的啟動子來調控E1A基因而重組成的溶瘤性腺病毒亦有很好的表現(xiàn)。例如以甲胎蛋白啟動子(AFP)來調控E1A基因表達的溶瘤性腺病毒[參見Hallenbeck P，L等1999，Human Gene Therapy101721-1733]。該病毒對肝癌有很強的殺傷力。用端粒反轉錄酶(hTERT)啟動子取代E1A啟動子而重組出來的腺病毒對多種腫瘤也有很強的溶瘤能力[參見Wirth T.等2003，Cancer Research633181-3188]。
雖然溶瘤性腺病毒作為治療惡性腫瘤的新方法，在臨床前期和臨床期的試驗中都呈現(xiàn)出令人鼓舞的效果，但仍然存在著腺病毒對腫瘤細胞的低感染力的主要問題。腺病毒主要依賴細胞表面的腺病毒受體(CAR)來感染細胞的，而大部分腫瘤的細胞都攜帶較少或者缺乏腺病毒受體(CAR)，導致低感染率。為了提高腺病毒載體對腫瘤細胞的感染力，依賴受體CAR的感染途徑必須改變。[參見Dmitriev I.等，1998，Journal of Biology 729706-9713]以遺傳工程的手段在病毒纖維的末端節(jié)插入一段RGD短肽。由于RGD短肽能與受體 integrin親合，而腫瘤細胞常表達高量的 新的重組腺病毒(無自我復制能力)對腫瘤細胞有較高的感染力。
借鑒如上所述以腺病毒作癌癥基因治療所取得的可喜成果和存在的問題，我們經(jīng)過多年的研究和探索，重組了一系列腫瘤專異性的溶瘤性腺病毒。這些腺病毒攜帶有腫瘤治療基因和具有腫瘤靶向性。實驗表明，這些新型的重組腺病毒具有很強的抗癌效果和很好的安全性。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了兩組靶向性的溶瘤性腺病毒。它們能增強對腫瘤細胞的感染，攜帶有毒性基因HSV1-tkm，能在腫瘤細胞中自我復制、繁殖和溶解腫瘤細胞。被釋放出來的子代腺病毒繼續(xù)感染周圍的腫瘤細胞。如此不斷的繁殖和感染循環(huán)，擴大病毒和治療基因的劑量效應和抗癌能力，達到抑制腫瘤的生長和擴散，促使腫瘤縮小和腫瘤細胞凋亡。由于這些重組腺病毒具有腫瘤靶向性，對正常細胞的感染力有所降低，在正常細胞中缺乏自我復制繁殖的能力，所以對正常組織和細胞的副作用很輕或者不明顯。提高了臨床腫瘤治療的安全性。
第一組溶瘤性重組腺病毒由在E1A基因上定點突變而產(chǎn)生。病毒的E1A蛋白通過其與p300/CBP和pRb的相互作用來促使宿主細胞進入DNA復制期。蛋白pRb能抑制轉錄因子E2F-1的活動而使細胞處在靜止期。在E1A基因序列中，缺失4-25號氨基酸短肽可阻止E1A蛋白和p300/CBP的結合，而缺失111-123號氨基酸短肽則可使E1A蛋白失去與pRb結合的親和位點[參見Egan C.等，1988，Molecular and Cellular Biology，83955-3959]。我們使用PCR定點突變的方法，將含4-25號氨基酸短肽和含111-123號氨基酸短肽從E1A基因序列中除去。所產(chǎn)生的突變型E1A蛋白僅失去了與pRb和p300/CPB結合的能力，其他功能則沒有改變。以突變型E1A基因(取名E1Ad12p)來重組的腺病毒失去了刺激宿主細胞進入DNA復制期的能力。所以，當這種帶有E1Ad12p基因的腺病毒感染正常(或pRb正常型)細胞后，宿主細胞依然處在靜止期(Go)，腺病毒無法進行自我復制繁殖。只有當這種E1Ad12p突變型的重組腺病毒感染pRb缺陷型或者pRb信息傳遞線路缺陷型的腫瘤細胞時，才能進行自我復制和繁殖。迄今為止，所診斷的人類腫瘤，幾乎都是pRb缺陷型或者pRb信息傳遞缺陷型。故此，這組E1Ad12p突變型的重組腺病毒具有廣譜溶瘤能力。
第二組溶瘤性重組腺病毒是以腫瘤專異性啟動子取代E1A啟動子而產(chǎn)生的。鑒于很多腫瘤的細胞都高度表達轉錄因子E2F-1，我們以人類的E2F-1基因的啟動子來調控腺病毒E1A基因的表達。當野生型腺病毒ad5侵入細胞后，首先表達的是E1A基因。然后E1A基因的產(chǎn)物(蛋白)作為引導子啟動其它腺病毒基因的表達和刺激宿主細胞進入DNA復制期(S)。當E1A基因由E2F-1啟動子控制的重組腺病毒感染正常細胞后(絕大多數(shù)正常的細胞都是處在靜止期的非增生性細胞)，由于E2F-1啟動子不能啟動，E1A基因不能表達，所以病毒不能自我復制繁殖，宿主細胞依然在靜止期。可是，在這種重組病毒侵入腫瘤細胞后，E2F-1啟動子被高頻啟動，E1A基因被高度表達，從而使腺病毒能有效地進行自我復制、繁殖和再感染，表現(xiàn)強大的抗癌能力。同樣的原理，我們也用人類染色體端粒酶的反轉錄酶(hTERT)啟動子來取代E1A基因的啟動子。因為在絕大部分人的體細胞中，染色體端粒酶以及它的重要組成部分反轉錄酶hTERT都沒有表達?？墒窃诮^大多數(shù)腫瘤中(＞90％)，這兩種酶則得到高度表達。所以，以hTERT啟動子調控E1A基因表達而重組成的溶瘤性腺病毒能表現(xiàn)出強大的抗癌效應，而對正常體細胞則沒有明顯的致病性。此外，我們選用人的甲胎蛋白(AFP)啟動子來調控重組溶瘤腺病毒的E1A基因的表達。據(jù)統(tǒng)計，約80％的肝癌患者都表現(xiàn)出高度的甲胎蛋白水平，即甲胎蛋白啟動子呈高頻活動。由于肝癌在我國的發(fā)病率很高，我們構建由AFP啟動子控制E1A基因的溶瘤性腺病毒，就是直接針對肝癌細胞的。這種重組腺病毒能在肝癌細胞中自我復制、繁殖和再感染，對肝癌有很大的殺傷力。這種病毒對正常的肝細胞或者體細胞則沒有造成明顯的影響。
本發(fā)明的大部分溶瘤性腺病毒具有感染腫瘤細胞的靶向性。如在前面背景技術部分所述，腺病毒感染細胞的第一步是通過其纖維蛋白末端節(jié)與在細胞表面的腺病毒受體CAR相互認識和結合。這一步很重要，它決定了病毒感染細胞的能力。緊接著的第二步為病毒外殼上的五鄰體的RGD短肽與細胞膜上的受體 結合，引發(fā)細胞攝粒作用，將病毒吞進細胞內。腺病毒受體CAR普遍表達在上皮細胞和肝細胞。但在腫瘤細胞中，CAR的表達水平則變化很大。大部分腫瘤的細胞都含有很少的腺病毒受體CAR。而另一方面，腫瘤細胞普遍高度表達受體 所以，我們以遺傳工程的手段，在腺病毒纖維蛋白末端節(jié)的H1-環(huán)上插入RGD短肽，使RGD與受體integrin的親合也成為腺病毒感染細胞的關鍵性第一步。從而顯著地提高了這些溶瘤性重組腺病毒對腫瘤細胞的感染力(靶向性)和增強它們的抗癌效應。
在本發(fā)明中，有一半溶瘤性重組腺病毒為E3基因部分缺失型。E3基因缺失所留下的空間被用來安置突變型的單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV1-tkm)。胸苷激酶的底物為胸苷類衍生物，例如，acyclovir(ACV)，ganciclovir(GCV)，penciclovir(PCV)。這類衍生物基本上是沒有毒性的。當它們被胸苷激酶磷酸化后，就變成對細胞有很強毒性的藥物(如2、3-磷酸核苷)。其毒性表現(xiàn)為(1)直接殺死細胞，(2)抑制DNA復制和細胞繁殖。因而HSV1-tk被稱為毒性基因或者自殺性基因，廣泛地用于癌癥基因治療。突變型的HSV1-tkm比其野生型HSV1-tk有5-7倍強的對胸苷類衍生物(如ACV，GCV)磷酸化的活性，而對胸苷嘧啶的親和性則有所降低[參見Black M.E等，2001，Cancer Research 613022-3026]。所以突變型的HSV1-tkm表現(xiàn)更強的抗癌效應，為更好的癌癥治療基因。我們有一半的溶瘤性重組腺病毒攜帶有毒性基因HSV1-tkm，以統(tǒng)合腺病毒載體的溶瘤性、靶向性和自殺性基因HSV1-tkm來攻擊腫瘤細胞，提高治療癌癥的臨床效果和減輕副作用反應。
在我們的溶瘤性重組腺病毒中，自殺性基因HSV1-tkm的表達是由ad5的主要晚期啟動子(MLP)或者人的循環(huán)氧合酶2(COX-2)啟動子來調控的。所以，HSV1-tkm的表達具有時間上或者組織上的特異性。ad5的MLP啟動子是在病毒DNA復制完后才高頻活動來合成病毒外殼蛋白。故由MLP啟動子控制的HSV1-tkm自殺性基因只能在病毒可自我復制的癌細胞中表達，從而專一性地抑制和殺死癌細胞。另一個被應用的組織特異性啟動子為人的循環(huán)氧合酶2(COX-2)啟動子。在正常的生理條件下，大多數(shù)組織都沒有表達COX-2基因，尤其在肝臟細胞，COX-2啟動子沒有活動。但在腸胃癌和肝癌中，COX-2基因呈高度表達。COX-2啟動子的這種在肝臟靜止而在腫瘤中高度活躍的特性對以腺病毒載體攜帶毒性基因來治療癌癥顯得更為可貴。因為(1)血管內表皮細胞層的阻隔和血流的快速循環(huán)，(2)肝臟缺少完整的血管構造和肝細胞表膜存在著大量的腺病毒受體CAR，當腺病毒載體以靜脈注射進入人體后，90％的病毒都聚集在肝臟。如果腺病毒載體上的毒性基因能在正常肝細胞中高度表達，則很可能傷害肝臟，導致肝中毒。本發(fā)明使用COX-2啟動子來調控毒性基因HSV1-tkm，則HSV1-tkm只在癌細胞中表達，專一性地殺死癌細胞。在正常肝細胞中，HSV1-tkm不能表達，沒有傷害肝臟。
概括地說，本發(fā)明應用了最新的科學知識和技術，綜合利用了重組腺病毒的溶瘤性、靶向性和腫瘤毒性基因來進攻癌細胞，明顯地提高了抗癌能力和安全性。本發(fā)明根據(jù)不同種類腫瘤的特異性，提供了多種腺病毒癌癥基因治療的選擇方案。例如adE1Adl2p、adE1Adl2p.RGD、adE1Adl2P.MLPtkm.RGD、adE1Adl2p.COXtkm.RGD、adE2F1.RGD、adE2F1.MLPtkm.RGD、adhTERT.RGD和adhTERT.MLPtkm.RGD具有廣譜抗癌能力；對肝癌可選用adAFP.RGD、adAFP.COXtkm和adE1Adl2p.COXtkm.RGD；對腦癌、肺癌、卵巢癌、神經(jīng)膠質瘤、畸胎瘤等則可選用adE1Adl2p.RGD、adE1Adl2P.MLPtkm.RGD、adE2F1.RGD或adE2F1.MLPtkm.RGD。溶瘤性重組腺病毒可通過多種途徑到達腫瘤組織，例如腫瘤直接注射、靜脈注射、腹腔注射和氣管噴射等。本發(fā)明的腫瘤基因治療方法可與傳統(tǒng)腫瘤治療方案(如手術、放療等)結合使用。例如，對不能手術摘除的原位腫瘤，可用我們的溶瘤性重組腺病毒結合放療來醫(yī)治；對于由手術摘除原位腫瘤的病人，也可用我們的溶瘤性重組腺病毒結合放療來摧毀擴散和轉移的腫瘤或者腫瘤細胞。
本發(fā)明的溶瘤性重組腺病毒由如下方案構建而成一、遺傳改造E1A基因成缺失變異基因E1Adl2p從ad5質粒pXC1中以內切酶SSPI和XbaI分離出含有大部分E1A基因序列的1Kb DNA片段，克隆到pGEM-7Zf載體質粒上。所產(chǎn)生的重組質粒取名為pGEM-7E1A。采用PCR定點突變的方法，首先使E1A基因序列中的nt10-75片段缺失，然后使nt333-369片段缺失。雙缺失突變了的E1A基因序列再從pGEM-7E1Adl2p質粒上以SSPI/XbaI內切酶切出，克隆回到pXC1上。所得到的質粒命名為pXC1E1Adl2p。
二、插入RGD-4C短肽到ad5纖維基因Fiber上從質粒pBHGE3i中以BamH1內切酶將ad5右端14.5kb DNA片段切出，克隆到pGEM3載體上。此段DNA含有野生型的E3基因和纖維基因fiber。所得重組質粒取名為pGEM14.5。同樣，ad5右端12Kb DNA片段也以BamH1內切酶從pBHGE10i中分離出來，克隆到pGEM3質粒上。該12kb DNA片段含有fiber基因，但缺失E3基因。所得重組質粒名為pGEM12。以內切酶KpnI和SphI同時消化，從pGEM14.5中分離出2.4kb的DNA片段，并克隆到pGEM3載體上，所產(chǎn)生的質粒命名為pGEM2.4。此段2.4kb的DNA含有fiber基因的大部分序列(從nt183到nt1746)。以PCR定點突變的方法，在纖維基因fiber序列的nt1638后插入27nt的序列TGT GAC TGC CGC GGA GAC TGT TTC TGC。此段27nt序列轉譯成相應的肽鏈為CDCRGDCFC。也即在病毒纖維蛋白末端節(jié)的H1-環(huán)上加入了RGD短肽。突變后的2.4kb DNA片段通過KpnI和SphI酶切點從pGEM2.4RGD上載下來，取代pGEM14.5以及pGEM12質粒上相應的野生型2.4kbDNA序列。所構建成的重組質粒分別取名pGEM14.5RGD和pGEM12RGD。最后，突變后的14.5kb和12kb DNA片段分別從pGEM14.5RGD和pGEM12RGD中以BamH1內切酶切出，再分別克隆回到pBHGE3i和pBHGE10i上以取代相應的野生型DNA片段。所構建的質粒取名為pBHGE3iRGD和pBHGE10iRGD。
三、以E2F-1、hTERT和AFP啟動子分別取代E1A啟動子來調控E1A基因首先對在pGEM7E1A上的E1A啟動子DNA序列進行定點突變。在ad5序列上的nt 361-366(GACTTT)改變成內切酶EcoRI的切點GAATTC，而在nt517-522(GTAGAG)突變成內切酶SalI的切點GTCGAC。以EcoRI和SalI消化，除去pGEM7E1A上的E1A啟動子部分序列(156bp)，插入兩端配有相應酶切點E2F-1的啟動子DNA(290bp)。所取得質粒名為pGEM7E2F1。同理，270bp的hTERT啟動子DNA序列取代在pGEM7E1A上的156bp E1A啟動子序列。新的質粒取名為pGEM7hTERT。1.8kb的AFP啟動子為改造后的序列。它含有兩組AB加強子序列和6組sd抑制子序列來調控AFP啟動子的活動。同樣，以兩端配有EcoRI和SalI切點的1.8kb AFP啟動子DNA序列取代了在pGEM7E1A的156bp E1A啟動子序列。得到的質粒稱為pGEM7AFP。E1A啟動子被取代的ad5DNA序列再分別從質粒pGEM7E2F1、pGEM7hTERT和pGEM7AFP中以XbaI和SSPI內切酶切下，克隆回到pXC1上。所得的質粒分別取名為pXC1E2F1、pXC1hTERT和pXC1AFP。
四、產(chǎn)生突變型的HSV1-tkm克隆野生型的1.2kb HSV1-tk基因序列到pCR2.1載體上，然后以PCR定點突變的方法，將HSV1-tk酶活性中心的重要氨基酸遺傳密碼進行定位改變。結果為143號密碼CTC(亮氨酸)變?yōu)锳TC(異亮氨酸)，144號密碼ATC(異亮氨酸)變?yōu)門TC(笨丙氨酸)，145號密碼TTC(笨丙氨酸)變?yōu)門TA(亮氨酸)，152號密碼GCC(丙氨酸)變?yōu)門TC(笨丙氨酸)和153號密碼CTC(亮氨酸)變?yōu)锳TG(蛋氨酸)。突變后的基因取名為HSV1-tkm，而相應的重組質粒取名為pCRHSV.tkm。
五、構建由MLP啟動子和COX-2啟動子控制HSV1-tkm表達的兩種質粒以EcoRI和HindIII內切酶把1.2kb HSV1-tkm DNA序列從pCRHSV.tkm質粒切出，分別克隆到pMLP和pCOX-2載體上。所得的質粒命名為pMLP.tkm和pCOX.tkm。在pMLP.tkm中，HSV1-tkm基因由其5′上游1.5kb的MLP啟動子控制其表達。在HSV1-tkm基因的3′端，則有215bp的BGHpA DNA序列作為HSV1-tkm基因轉錄的終止信號。在pCOX.tkm中，HSV1-tkm基因的表達是由1.5kb的人的COX-2啟動子控制，其轉錄的終止信號也同樣是215bp的BGHpA DNA序列。然后，以PacI內切酶將含有MLP啟動子HSV1-tkm基因和BGHpA的3kb DNA序列從pMLP.tkm切出，分別克隆到pBHGE10i和pBHGE10i RGD載體上。所獲質粒取名為pBHGE10iMLPtkm和pBHGE10iMLPtkm.RGD。同樣的方法，含有COX-2啟動子、HSV1-tkm基因和BGHpA的3kb DNA序列也被分別克隆到pBHGE10i和pBHGE10iRGD載體上，得到重組質粒pBHGE10iCOXtkm和pBHGE10iCOXtkm.RGD。
六、構建E1A突變型溶瘤性重組腺病毒在通過上邊方案取得ad5穿梭質粒pXC1E1Adl2p以及ad5骨架質粒pBHGE3i、pBHGE3iRGD、pBHGE10iMLPtkm.RGD和pBHGE10iCOXtkm.RGD后，我們以每一個骨架質粒同穿梭質粒pXC1E1Adl2p共同轉染HEK 293細胞。通過細胞內病毒DNA同源重組產(chǎn)生出E1A突變型溶瘤性腺病毒。經(jīng)過三次重復單一噬斑篩選提純、腺病毒DNA的內切酶圖譜比對、PCR鑒定和tkm活性分析而確認所需的各個重組腺病毒。具體的組合為1)穿梭質粒pXC1E1Adl2p與骨架質粒pBHGE3i在體內重組產(chǎn)生adE1Adl2p；2)穿梭質粒pXC1E1Adl2p與骨架質粒pBHGE3iRGD在體內重組產(chǎn)生adE1Adl2p.RGD；3)穿梭質粒pXC1E1Adl2p與骨架質粒pBHGE10iMLPtkmRGD在體內重組產(chǎn)生adE1Adl2p.MLPtkm.RGD；4)穿梭質粒pXC1E1Adl2p與骨架質粒pBHGE10iCOXtkmRGD在體內重組產(chǎn)生了adE1Adl2p.COXtkm.RGD。在adE1Adl2p中，僅E1A基因是突變型(E1Adl2p)，其它所有的基因都是野生型。adE1Adl2p.RGD對腫瘤細胞具有更強的感染能力。因為此種重組病毒的纖維末端節(jié)上加了RGD短肽，能與細胞外膜上腺病毒受體CAR和integrin結合。adE1Adl2p.MLPtkm.RGD和adE1Adl2p.COXtkm.RGD是在adE1Adl2p.RGD基礎上增加HSV1-tkm基因。所以它們除有adE1Adl2p.RGD的功能外，還有以HSV1-tkm毒殺腫瘤細胞的能力。這四種重組病毒都具有廣譜的抗癌能力。
七、構建以腫瘤特異性啟動子控制E1A基因表達的溶瘤性重組腺病毒通過如前面所述實驗取得ad5穿梭質粒pXC1E2F1、pXC1AFP、pXC1hTERT和ad5骨架質粒pBHGE3iRGD、pBHGE10iMLPtkm.RGD、pBHGE10iRGD、pBHGE10iCOXtkm、pBHGE10iMLPtkm后，我們以HEK 293細胞作宿主，重組了如下溶瘤性腺病毒A)以穿梭質粒pXC1E2F1與骨架質粒pBHGE3iRGD在293細胞中進行DNA同源重組，產(chǎn)生adE2F1.RGD。以穿梭質粒pXC1E2F1同骨架質粒pBHGE10iMLPtkmRGD進行體內重組，產(chǎn)生adE2F1.MLPtkm.RGD。
B)以穿梭質粒pXC1AFP同骨架質粒pBHGE10iRGD進行體內DNA同源重組，產(chǎn)生adAFP.RGD。以穿梭質粒pXC1AFP與骨架質粒pBHGE10iCOXtkm進行體內重組，得到adAFP.COXtkm。
C)以穿梭質粒pXC1hTERT同骨架質粒pBHGE3iRGD進行體內重組，產(chǎn)生adhTERT.RGD。以穿梭質粒pXC1hTERT同骨架質粒pBHGE10iMLPtkm進行體內重組，獲得adhTERT.MLPtkm。


圖1本發(fā)明所闡述的十種不同溶瘤性重組腺病毒的示意圖。
圖2溶瘤性重組腺病毒在腫瘤細胞和正常細胞中自我復制及繁殖能力的比較。
A.腫瘤細胞B.正常細胞圖3裝配在纖維蛋白末端節(jié)上的RGD短肽對增強重組腺病毒感染腫瘤細胞能力的檢測。
圖4比較溶瘤性腺病毒對癌細胞和正常細胞的致病性效應。
A.肝癌細胞Hep3B B.正常乳腺上皮細胞HMEC圖5溶瘤性重組腺病毒中外源毒性基因HSV1-tkm在腫瘤細胞(肝癌細胞株Hep3B)的表達水平檢測。
圖6藥物前體GCV被HSV1-tkm激酶磷酸化后對腫瘤細胞毒性效應的分析。
圖7溶瘤性腺病毒對動物皮下人的腫瘤模型(宮頸癌細胞株C33A)的抗癌效應。
A.老鼠身上人的宮頸癌模型體積變化的照片記錄。
B.經(jīng)溶瘤性重組腺病毒處理后，老鼠身上腫瘤體積變化的測定。
圖8HSV1-tkm和GCV對動物皮下人的腫瘤模型(肺癌細胞株H2122)的抗癌效應。
A.老鼠身上人的肺癌模型體積變化的照片記錄。
B.經(jīng)攜帶有HSV1-tkm毒性基因的溶瘤性重組腺病毒和GCV處理后，腫瘤體積變化的觀察結果。
圖9溶瘤性重組腺病毒對動物肝臟人的腫瘤模型(能穩(wěn)定地表達螢火蟲熒光素酶作為腫瘤報告基因的肝癌細胞株Hep3B-ffLuc)的抗癌效應。
A.老鼠肝臟人的肝癌模型的照片記錄。
B.經(jīng)溶瘤性重組腺病毒處理后，老鼠肝臟人的肝癌(Hep3B-ffLuc)報告基因螢火蟲熒光素酶(Firefly Luciferase)的總活性。
圖10溶瘤性重組腺病毒對動物肺部人的腫瘤模型(結腸癌細胞株Ls174T-ffLuc)的抗癌效應。
A.老鼠肺部人的結腸癌模型的照片記錄。
B.經(jīng)溶瘤性重組腺病毒處理后，老鼠肺部人的結腸癌(Ls174T-ffLuc)報告基因螢火蟲熒光素酶的總活性。
具體實施例方式
本發(fā)明所使用的分子生物學、細胞生物學、分子病毒學、腫瘤學、實驗室動物學，病理學和DNA重組等技術和實驗方法，都是相應科學領域中常用和標準的。本發(fā)明中所用的初始腺病毒5型(ad5)的質粒pXC1、pBHGE3i和pBHGE10i來自于加拿大的Microbix BiosystemsInc公司。我們按照該公司提供的實驗方法進行了本發(fā)明的溶瘤性腺病毒的構建、篩選、增殖和提純。本發(fā)明所使用的人的腫瘤細胞株主要購自于美國的ATCC公司，而人的正常細胞(株)則來自于美國的Clonetics公司。
實施例1溶瘤性腺病毒的重組構建。
本發(fā)明共有十種不同的溶瘤性重組腺病毒。具體各種病毒的產(chǎn)生方法和步驟已在前面技術方案中描述，在此不再重復。圖1為這十種重組腺病毒基因組DNA簡圖，主要標明本發(fā)明中對ad5所進行遺傳改造的位點和基因。
實施例2噬斑法檢測重組腺病毒的自我復制能力。
為了評價本發(fā)明的重組腺病毒的復制能力，我們以野生型的ad5d1309(其E3有部分缺失和插入突變)作對照，用同等劑量的病毒(MOI為10)分別感染人的肝癌細胞株Hep3B、宮頸癌細胞株Hela、肺癌細胞株H661、正常肝細胞Chang liver、正常乳腺上皮細胞HMEC和正常肺成纖維細胞WI38。三天后，收集細胞。經(jīng)三次-80℃和30℃的凍融釋放出病毒體后，細胞上清液用以感染HEK 293細胞來進行噬班法滴度測定病毒量(pfu)。在同一種細胞株內，重組病毒和野生型病毒所產(chǎn)生的病毒量的比較，則可表明該重組病毒的復制能力。圖二列出各組具有代表性的重組腺病毒在上述3種癌細胞株和3種正常細胞中的復制能力(以野生型的ad5d1309的復制能力當100％作比對)。adE1Adl2p.RGD、adE2F1.RGD和adhTERT.RGD在腫瘤細胞株中都有與野生型相當?shù)膹椭颇芰?。adAFP.RGD在肝癌細胞株Hep3B中，有強于ad5d1309的復制能力。但在沒有表達AFP的癌細胞株H661和Hela中，adAFP.RGD的復制能力則相對較弱。所有這些重組病毒在人的正常細胞中都基本上沒有自我復制的能力。
實施例3檢測在纖維蛋白末端節(jié)加上RGD短肽對病毒腫瘤細胞感染力的影響。
我們選用了人的膀胱癌細胞株T24、卵巢癌細胞株HEY和胰腺癌細胞株Hs7667來比較adE1Adl2p和adE1Adl2p.RGD的感染力。這三種癌細胞都有中等數(shù)量的腺病毒受體CAR和多量的 以同等劑量的兩種病毒(MOI為50)分別感染癌細胞。5個小時后，收獲細胞，并從細胞中提取病毒DNA。然后以數(shù)量PCR的方法來擴增腺病毒DNA中1Kb的MLP片段。所得PCR DNA的量如圖三所示。在這些癌細胞中，纖維蛋白末端節(jié)配有RGD短肽的重組腺病毒adE1Adl2p.RGD的感染力是其對照病毒adE1Adl2p的4-6倍。顯然，RGD短肽可有效地增強重組腺病毒對含有多量 的癌細胞感染的靶向性。
實施例4比較溶瘤性腺病毒對癌細胞和正常細胞的毒性效應。
重組腺病毒和野生型腺病毒ad5d1309以1×105-8×106pfu的劑量范圍分別感染肝癌細胞株Hep3B、肺癌細胞株H661、宮頸癌細胞株Hela、正常肝細胞Chang liver、正常乳腺上皮細胞HMEC和正常肺成纖維細胞WI38。我們以細胞增殖試劑WST-1(購自美國Roche公司)來測定細胞毒性。根據(jù)Roche公司提供的WST-1實驗方法，我們將細胞培養(yǎng)在96-洞的培養(yǎng)盤中，每洞約有1×105個細胞。在病毒感染后72個小時，對每洞細胞加入10微升的WST-1試劑，再培養(yǎng)24個小時，然后用EL1SA測定儀測量每洞細胞在440nM光譜的吸收值(OD440nM)。吸收值高的表明細胞增殖正常，而吸收值低的，則表明細胞受到毒害，沒能正常增殖。實驗結果為受測試的重組腺病毒對癌細胞都有很強的毒性效應，而對正常細胞的毒性效應則很輕微。圖4A為受測試的重組腺病毒對肝癌細胞株Hep3B的毒性效應。這些重組腺病毒有近似或超過野生型腺病毒ad5d1309對癌細胞的毒性效應。圖4B為受測試的重組腺病毒對正常乳腺上皮細胞HMEC的毒性效應。完全不同于野生型ad5d1309，重組腺病毒對正常乳腺上皮細胞的毒性非常輕微，與沒有復制能力的腺病毒載體adv對細胞的毒性相似。
實施例5檢測溶瘤性重組腺病毒中毒性基因HSV1-tkm的表達水平。
重組腺病毒adE1Adl2p.MLPtkm.RGD、adE1Adl2p.COXtkm.RGD、adE2F1.MLPtkm.RGD、adAFP.COXtkm和adhTERT.MLPtkm分別以3×105--1×109pfu的劑量范圍感染肝癌細胞株Hep3B、肺癌細胞株A549和HEK 293細胞(培養(yǎng)在12-洞的培養(yǎng)盤中)。兩天后，收集細胞、提取蛋白上清液。以[H3]-GCV作底物，分析胸苷激酶HSV1-tkm的活性。結果表明，HSV1-tkm毒性基因在這些重組腺病毒中能有效地表達。圖5為這些重組腺病毒在肝癌細胞株Hep3B中表達HSV1-tkm的水平。
實施例6胸苷激酶HSV1-tkm對藥物前體GCV的磷酸化增強溶瘤性腺病毒對癌細胞的毒性效應。
重組腺病毒adE1Adl2p.MLPtkm.RGD、adE1Adl2p.COXtkm.RGD、adAFP.COXtkm、adE2F1.MLPtkm.RGD和adhTERT.MLPtkm以劑量1×106pfu分別感染肺癌細胞株A549、肝癌細胞株Hep3B和結腸癌細胞株HT29(在96-洞培養(yǎng)盤中)。兩天后，加入0.0003-1微克分子(μM)的GCV到培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)兩天。然后，以WST-1試劑(如在例4中所述)測定細胞毒性效應。實驗結果顯示，HSV1-tkm/GCV對癌細胞有顯著的殺傷力。圖6為肝癌細胞株Hep3B的試驗結果。從圖中可見，攜帶有HSV1-tkm毒性基因的adE1Adl2p.MLPtkm.RGD或者adE1Adl2p.COXtkm.RGD都比其對照adE1Adl2p.RGD有更強的細胞毒性。
實施例7溶瘤性重組腺病毒對動物皮下人的腫瘤模型的抗癌效應。
在雄性無胸腺裸鼠的下背部進行皮下注射約1百萬個宮頸癌細胞(C33A)以建立人的腫瘤模型。當腫瘤直徑約達0.5厘米時，每天對腫瘤注射5×109pfu劑量的重組腺病毒，連續(xù)5天。每隔5天測量腫瘤體積(V＝L×W2÷2)的變化，連續(xù)記錄40天。圖7A為腫瘤經(jīng)adhTERT.RGD和1X PBS(負對照)處理后的照片。圖7B為經(jīng)過adE1Adl2p、adE1Adl2p.RGD、adE2F1.RGD、adAFP.RGD、adhTERT.RGD、野生型腺病毒ad5d1309和1X PBS處理后，各組(每組4個老鼠)老鼠身上腫瘤體積變化(相對起始時的100％)的總結。接受1X PBS處理的負對照組，腫瘤快速生長，40天后腫瘤體積約為原來的12倍。接受重組腺病毒處理的各組，腫瘤生長緩慢，僅為起始時的1.5-2倍，優(yōu)于野生型腺病毒ad5d1309的抗癌效應(腫瘤長了3.5倍)。重組腺病毒adAFP.RGD對宮頸癌的抗癌能力較差，該組腫瘤的體積為原來的5倍。因為在宮頸癌細胞株C33A中的AFP表達水平很低，使adAFP.RGD的AFP啟動子未能充分活動。
實施例8HSV1-tkm和GCV對動物皮下人的腫瘤模型的抗癌效應。
皮下注射約1百萬個人的肺癌細胞(H2122)到雄性無胸腺裸鼠的下背部以建立人的腫瘤模型。當腫瘤直徑約達0.5厘米時，連續(xù)5天以每天注射5×109pfu劑量的重組腺病毒到腫瘤中去。然后每天靜脈注射2毫克的GCV，連續(xù)5天。每5天測量腫瘤的體積變化，連續(xù)記錄40天。每組處理有4個老鼠。圖8A為經(jīng)adE1Adl2p.MLPtkm.RGD/GCV和1X PBS/GCV處理后腫瘤生長變化的照片記錄。圖8B為腫瘤經(jīng)注射重組腺病毒adE1Adl2p.RGD、adE1Adl2p.MLPtkm.RGD、adE1Adl2p.COXtkm.RGD、adE2F1.RGD、adE2F1.MLPtkm.RGD、adhTERT.MLPtkm、adhTERT.RGD、1X PBS和經(jīng)GCV處理后體積變化的總結。結果清楚地證明，在每小組重組腺病毒中，攜帶有毒性基因HSV1-tkm的比其相應沒有攜帶HSV1-tkm的有更強的抗癌能力。例如，adE1Adl2p.COXtkm.RGD/GCV處理組的腫瘤在45天時的體積是其起始時的1.5倍，而adE1Adl2p.RGD/GCV組的腫瘤體積則為原來的3倍。所以，HSV1-tkm/GCV能顯著地增強溶瘤性腺病毒的抗癌能力。
實施例9溶瘤性重組腺病毒對動物肝臟人的腫瘤模型的抗癌效應。
我們首先建立了穩(wěn)定表達螢火蟲熒光素酶(Firefly Luciferase，ffLuc)的肝癌細胞株Hep3B-ffLuc。以ffLuc作為腫瘤細胞的報告基因來評估重組腺病毒的抗癌能力。在雄性無胸腺裸鼠的前腹部以外科手術切開一個小口，用平嘴鑷子拉出部分前葉肝，并注射入約2×105的Hep3B-ffLuc肝癌細胞，然后縫合傷口。兩個星期后，靜脈注射5×109pfu劑量的重組腺病毒，連續(xù)注射5天(每組處理有4個老鼠)。自病毒注射后一個月，采集老鼠肝臟及查看腫瘤是否擴散到別的器官和腹腔。然后把整個肝臟打爛、提取蛋白質上清夜和測定ffLuc酶的活性(用美國Promega公司的Luciferase Assay System)。圖9A為老鼠肝臟的記錄照片。在負對照組(1X PBS)，老鼠的肝臟有1到4個較大的腫瘤，并在其中兩個老鼠的十二指腸—胃—胰區(qū)域發(fā)現(xiàn)長有腫瘤。接受重組腺病毒處理的各組老鼠，它們的肝臟一般長有1-2個小腫瘤，也有幾個長有3-4個小腫瘤的，但別的器官或組織則沒有發(fā)現(xiàn)肉眼可見的腫瘤。圖9B總結各組老鼠肝臟的腫瘤報告基因ffLuc的產(chǎn)物熒光素酶的活性。經(jīng)過重組腺病毒處理的各組老鼠的肝臟，它們的熒光素酶的活性僅及負對照組(1X PBS)的6-12％。尤其是以adAFP.RGD處理的一組老鼠，它們肝臟的腫瘤報告基因產(chǎn)物的活性最低，只為其對照組(1XPBS)的6％。這是肝癌細胞株Hep3B的AFP啟動子高度活躍，使adAFP.RGD能高效自我復制而表現(xiàn)出更強的溶瘤能力。
實施例10溶瘤性重組腺病毒對動物肺部人的腫瘤模型的抗癌效應。
我們以穩(wěn)定表達ffLuc的結腸癌細胞株(Ls174T-ffLuc)，通過靜脈注射(2×105細胞)，在雄性無胸腺裸鼠的肺部建立人的腫瘤模型。自細胞注射后兩個月，老鼠(每組4個)接受連續(xù)5天的5×109pfu/天劑量的重組腺病毒靜脈注射。注射的病毒為adE1Adl2p、adE1Adl2p.RGD、adE2F1.RGD、adAFP.RGD和adhTERT.RGD。一個月后，采集老鼠的肺器官，并觀察腫瘤是否長在別的器官和腹腔。然后將整個肺來制備蛋白質上清液，并測定腫瘤報告基因產(chǎn)物熒光素酶的活性。圖10A為老鼠肺器官的記錄照片。經(jīng)過溶瘤性腺病毒處理的各組老鼠，它們肺的體積與正常老鼠肺體積無異，僅長有一些小的腫瘤。但接受1X PBS注射的負對照組，老鼠的肺長得很大，是正常肺的5-7倍，且長滿了腫瘤，呈不均勻的深褐色。其中一個老鼠的肝臟也長有腫瘤。圖10B總結各組老鼠肺的腫瘤報告基因ffLuc產(chǎn)物熒光素酶的活性。接受重組腺病毒注射的各組老鼠，它們肺的熒光素酶的活性一般只是對照組(1X PBS)的4-7％(adAFP.RGD組除外，它們肺的ffLuc活性接近對照組的50％。這是由于結腸癌細胞株Ls174T沒有表達AFP)?？梢?，這些溶瘤性腺病毒具有很強的抗癌能力。
權利要求
1.一組重組腺病毒，其特征在于突變型的腺病毒E1A基因產(chǎn)物失去與pRb和p300/CBP結合的能力、腺病毒纖維基因fiber上插入RGD-4C短肽遺傳密碼和攜帶有腫瘤自殺性基因。
2.一組重組腺病毒，其特征在于腺病毒E1A基因的啟動子被腫瘤特異性外源啟動子取代、腺病毒fiber基因上插入RGD-4C短肽遺傳密碼和攜帶有腫瘤自殺性基因。
3.權利要求1所述的重組腺病毒，其特征在于其中所述病毒能靶向感染腫瘤細胞、在pRb功能缺陷型和pRb信息傳遞線路缺陷型的腫瘤細胞內大量復制繁殖、腫瘤特異性地表達腫瘤自殺性基因和溶解腫瘤細胞并釋放出子代腺病毒繼續(xù)感染周圍的腫瘤細胞。如此繁殖感染循環(huán)，擴大病毒和治療基因的劑量效應和抗癌能力。而在正常細胞中這些腺病毒沒有自我復制繁殖能力，對正常組織沒有傷害作用。
4.權利要求2所述的重組腺病毒，其特征在于其中所述腺病毒能靶向感染腫瘤細胞、在腫瘤細胞內大量復制繁殖、腫瘤專一性地表達腫瘤自殺性基因和溶解腫瘤細胞并釋放出子代腺病毒來繼續(xù)感染周圍的腫瘤細胞。如此繁殖感染循環(huán)，擴大腺病毒和治療基因的劑量效應和抗癌能力。而在正常細胞中這些腺病毒沒有自我復制繁殖能力，對正常組織沒有傷害作用。
5.權利要求1和2中所述大部分重組腺病毒，其特征在于突變型病毒纖維蛋白末端節(jié)的H1--環(huán)上帶有RGD-4C短肽，使這些病毒能靶向感染帶有受體integrin的腫瘤細胞，提高感染力。
6.權利要求1和3所述重組腺病毒，其特征在于被遺傳改變的E1A基因產(chǎn)物為289R和243R蛋白。這兩種蛋白僅失去了與pRb和p300/CBP結合的能力，其它功能則沒有改變。
7.權利要求2和4所述重組腺病毒，其特征在于這些病毒中控制E1A基因表達的腫瘤特異性外源啟動子包括人的E2F-1基因的啟動子、甲胎蛋白(AFP)基因的啟動因子和染色體端粒酶中反轉錄酶(hTERT)基因的啟動子。
8.權利要求1和2所述部分重組腺病毒，其特征在于這些腺病毒攜帶突變型的單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV1-tkm)作為腫瘤自殺性基因。HSV1-tkm是由在其野生型HSV1-tk基因上定點突變胸苷激酶活性中心的5個重要肽鏈密碼子而產(chǎn)生的。突變型HSV1-tkm的產(chǎn)物胸苷激酶比其野生型具有更強的腫瘤殺傷力。
9.權利要求1、2和8所述部分重組腺病毒，其特征在于這些腺病毒攜帶的腫瘤自殺性基因HSV1-tkm是由腺病毒的主要晚期啟動子(MLP)或者人的循環(huán)氧合酶2(COX-2)啟動子調控，從而使HSV1-tkm主要在腫瘤細胞內高度表達，殺死腫瘤細胞。與之相反，在正常肝細胞中，COX-2和MLP啟動子都沒有活動，HSV1-tkm沒有表達，所以對人的肝臟沒有毒性影響。
10.權利要求1、3、5、6、8、和9中所述的重組腺病毒adE1Adl2p.RGD、adE1Adl2p.MLPtkm.RGD、和adE1Adl2p.COXtkm.RGD，其特征在于這些病毒帶有突變型的E1A基因(E1Adl2p)和突變型的纖維基因fiber-RGD。此外，adE1Adl2p.MLPtkm.RGD還攜帶有由MLP啟動子調控的腫瘤自殺性基因HSV1-tkm，而adE1Adl2p.COXtkm.RGD則攜帶有由COX-2啟動子調控的腫瘤自殺性基因HSV1-tkm。
11.權利要求2、4、5、7、8、和9中所述的重組腺病毒adE2F1.RGD和adE2F1.MLPtkm.RGD，其特征在于這些病毒的E1A基因的啟動子被人的E2F-1基因的啟動子取代和攜帶有突變型的纖維基因fiber-RGD。此外，adE2F1.MLPtkm.RGD還攜帶有由MLP啟動子調控的腫瘤自殺性基因HSV1-tkm。
12.權利要求2、4、5、7、8、和9中所述的重組腺病毒adAFP.RGD和adAFP.COXtkm，其特征在于這些病毒的E1A基因的啟動子被人的AFP基因的啟動子取代。此外，adAFP.RGD還攜帶有突變型的纖維基因fiber-RGD，而adAFP.COXtkm則攜帶有由COX-2啟動子調控的腫瘤自殺性基因HSV1-tkm。
13.權利要求2、4、5、7、8、和9中所述的重組腺病毒adhTERT.RGD和adhTERT.MLPtkm，其特征在于這些病毒的E1A基因的啟動子被人的染色體端粒酶中反轉錄酶(hTERT)基因的啟動子取代。此外，adhTERT.RGD還攜帶有突變型的纖維基因fiber-RGD，而adhTERT.MLPtkm則攜帶有由MLP啟動子調控的腫瘤自殺性基因HSV1-tkm。
全文摘要
本發(fā)明提供了兩組(十種)溶瘤性重組腺病毒。一組由在病毒E1A基因上定點突變而產(chǎn)生。另一組以腫瘤專異性啟動子取代E1A啟動子而構建成。此外，一部分重組腺病毒因其纖維末端節(jié)加了RGD短肽而具有感染癌細胞的靶向性。同時，一部分重組病毒攜帶有腫瘤自殺性基因HSV
文檔編號A61P35/00GK1793343SQ200510119019
公開日2006年6月28日 申請日期2005年11月28日 優(yōu)先權日2005年11月28日
發(fā)明者陳智博 申請人:陳智博