專(zhuān)利名稱(chēng)：一種篩選抑制新血管生成藥物的方法和用于該方法的細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種篩選抑制新血管生成藥物的方法和用于該方法的細(xì)胞系。
目前，對(duì)CD146功能方面的認(rèn)識(shí)非常有限。已證實(shí)它是細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞胞內(nèi)外的信號(hào)傳導(dǎo)分子[4-6]，對(duì)局部的黏附集合，細(xì)胞骨架重組，細(xì)胞間相互作用，細(xì)胞形態(tài)維護(hù)，細(xì)胞遷移、增生控制都起著作用。另外，CD146在腫瘤發(fā)展、胚泡植入、胎盤(pán)形成中等過(guò)程發(fā)揮著重要的作用[7-9]。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于本發(fā)明的方法的細(xì)胞系。
本發(fā)明提供了一種篩選抑制新血管生成藥物的方法，包括使用CD146蛋白分子或者表達(dá)CD146蛋白的細(xì)胞篩選出具有CD146結(jié)合活性的生物分子；用天然表達(dá)CD146分子的細(xì)胞檢測(cè)上述的具有CD146結(jié)合活性的生物分子是否能夠抑制或激活這種細(xì)胞生長(zhǎng)。
在本發(fā)明的方法中，所述的生物分子可以是配體、抗體分子或基因工程片段、多肽、或者免疫毒素；所述的表達(dá)CD146的細(xì)胞可以是293-EBNA細(xì)胞系，其保藏編號(hào)為CGMCC0642；所述的篩選具有CD146結(jié)合活性的生物分子可以是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性ELISA進(jìn)行的。
本發(fā)明還提供了一種用于篩選抑制新血管生成藥物的表達(dá)CD146蛋白的293-EBNA細(xì)胞系。該細(xì)胞系已與2001年10月8日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物生物中心(CGMCC)，保藏中心地址是，中國(guó)，北京，中關(guān)村。保藏編號(hào)為CGMCC0642。
本發(fā)明的細(xì)胞系的制備方法如下首先把CD146全長(zhǎng)基因插入到高效表達(dá)載體pCEP-Pu，構(gòu)建一個(gè)含有CD146基因的重組質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞系293-EBNA。在選擇培養(yǎng)基上篩選含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆。由于CD146分子可表達(dá)于宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜表面，因此該細(xì)胞可以用于篩選各種各樣與CD146結(jié)合的物質(zhì)，并可以通過(guò)天然表達(dá)CD146分子的細(xì)胞檢測(cè)篩選出來(lái)的配體、抗體、多肽或蛋白毒素是否具有特異性的抑制或激活效應(yīng)。
該模型的應(yīng)用可示例于以下幾個(gè)方面1)通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合篩選CD146靶向藥物。即使獲得的只是親和力較弱的分子，也可經(jīng)進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)研究對(duì)分子加以改進(jìn)從而獲得親和力高的藥物。它的進(jìn)一步鑒定與應(yīng)用包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)甚至臨床實(shí)驗(yàn)，均將與最初的篩選模型的效率息息相關(guān)。2)檢測(cè)篩選出的藥物是否具有阻斷或激活信號(hào)傳導(dǎo)的作用。在天然表達(dá)CD146分子的細(xì)胞中，加入篩選出的藥物分子(抗體，多肽，免疫毒素等)，若能抑制或激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，必將導(dǎo)致細(xì)胞某些表型的改變，如生長(zhǎng)率、細(xì)胞多態(tài)性、細(xì)胞集落形成、在軟瓊脂上的生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞的抗腫瘤活性、抗原的表達(dá)等方面，而其對(duì)照組細(xì)胞將不表現(xiàn)此類(lèi)特征。3)該模型還提供了一種從抗血清中選擇抗體的方法。將合成的肽段免疫動(dòng)物得到的抗血清經(jīng)細(xì)胞模型進(jìn)行篩選，獲得高親和力的抗體，進(jìn)而研究其與CD146相互作用引發(fā)的生物學(xué)過(guò)程以及確定CD146的相關(guān)活性部位。若其具有潛在的藥物活性，可進(jìn)行相關(guān)的毒理、藥理學(xué)測(cè)定。
本發(fā)明的應(yīng)用價(jià)值在于(1)CD146偶聯(lián)物或CD146工程細(xì)胞可以作為疫苗，用于上述疾病的預(yù)防和治療，(2)CD146工程細(xì)胞可以作為一種藥物篩選分子模型，用于篩選各種各樣的配體、抗體、多肽或蛋白毒素，(3)CD146的天然配體可以是一種藥物和藥物靶向，用于血管生成相關(guān)疾病的預(yù)防、診斷和治療，而且可作為一種新型流產(chǎn)避孕藥物，用于人口控制。
我們研制得CD146特異性的單克隆抗體，首次發(fā)現(xiàn)抗體與CD146的相互作用可以導(dǎo)致以下結(jié)果(1)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，(2)抑制血管生成，(3)引起腫瘤血管的萎縮和堵塞，抑制多種腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，其抑制率分別為平滑肌肉瘤50％，肝癌71.9％，胰腺癌48.7％。(4)通過(guò)抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞，導(dǎo)致懷孕小鼠流產(chǎn)，說(shuō)明CD146是胚胎發(fā)育早期的關(guān)鍵分子和特有標(biāo)志物，對(duì)于胚胎發(fā)育和妊娠維持至關(guān)重要。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)CD146蛋白是一種新的血管標(biāo)志分子，它參與血管生成、胚胎發(fā)育和腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。
實(shí)施例一CD146藥物篩選細(xì)胞模型的建立1.CD146基因表達(dá)載體的構(gòu)建從臍帶靜脈內(nèi)皮提取總mRNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。根據(jù)CD146的基因序列(P43121)設(shè)計(jì)含有限制酶切位點(diǎn)的5‘和3’端引物。以cDNA為模板，通過(guò)PGR反應(yīng)擴(kuò)增出CD146全長(zhǎng)基因片段。通過(guò)雙酶切將其插入到高效表達(dá)載體pCEP-Pu(Eddie Kohfeldt，1996)的多克隆位點(diǎn)，使之與載體的開(kāi)放閱讀框吻合。通過(guò)DNA瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物及重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。酶切重組質(zhì)粒結(jié)果顯示外源基因已被克隆至載體的多克隆位點(diǎn)。DNA序列分析證實(shí)重組質(zhì)粒含有CD146基因。
2.CD146工程細(xì)胞系的構(gòu)建及鑒定制備293-EBNA感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)磷酸鈣沉淀法將構(gòu)建好的含有CD146基因的表達(dá)載體pCEP-Pu導(dǎo)入宿主細(xì)胞系293-EBNA(Invitrogen，CatNo.R620-07)。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在含有Puromycin和G418的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑取細(xì)胞集落，繼續(xù)在選擇培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)一周后凍存工程細(xì)胞。
在基因和蛋白水平鑒定CD146分子在293-EBNA細(xì)胞系中的表達(dá)。首先，用PCR方法確定CD146基因是否存在于293-EBNA細(xì)胞中。收集并裂解細(xì)胞，加入PCR反應(yīng)體系和引物，PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染CD146基因的293-EBNA細(xì)胞出現(xiàn)一條約2000bp的基因條帶，而未轉(zhuǎn)染的293-EBNA細(xì)胞沒(méi)有任何PCR產(chǎn)物出現(xiàn)。說(shuō)明CD146基因存在于293-EBNA細(xì)胞中。該細(xì)胞系已與2001年10月8日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物生物中心(CGMCC)，保藏中心地址是，中國(guó)，北京，中關(guān)村。保藏編號(hào)為CGMCC0642。
進(jìn)一步鑒定CD146基因是否在293-EBNA細(xì)胞系中表達(dá)。我們向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入細(xì)胞裂解緩沖液，刮下細(xì)胞后離心，用SDS-PAGE及Westernblotting方法鑒定CD146分子的表達(dá)情況，結(jié)果顯示293-EBNA細(xì)胞中表達(dá)的CD146分子可被CD146特異性抗體識(shí)別。
實(shí)施例二采用流式細(xì)胞儀(FACS)分析CD146結(jié)合物方法如下將106工程細(xì)胞懸浮于100μl含10μg/mlCD146特異性抗體的的培養(yǎng)基中，孵育1h，經(jīng)培養(yǎng)基洗三次，加入FITC-羊抗鼠IgG，孵育45分鐘，洗三遍后，將細(xì)胞重新懸浮在200μl-500μl PBS中，在FACS上進(jìn)行免疫熒光分析并測(cè)定平均熒光密度。FACS分析顯示，所構(gòu)建的細(xì)胞能在其表面表達(dá)CD146分子，并與抗體發(fā)生特異性的結(jié)合。說(shuō)明構(gòu)建的細(xì)胞所表達(dá)的CD146分子較好的維持了其天然構(gòu)象。
實(shí)施例三CD146分子細(xì)胞模型篩選特異性抗體1.ELISA法篩選與CD146特異結(jié)合的抗體ELISA方法可以用于篩選與CD146-293-EBNA細(xì)胞結(jié)合的物質(zhì)，如抗體。方法如下以每孔105細(xì)胞接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞80％鋪滿(mǎn)培養(yǎng)孔時(shí)，用甲醇固定細(xì)胞，2％BSA封閉2h，加入待檢測(cè)的抗體樣品(雜交瘤上清、可溶性抗體分子片段)，相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基或緩沖液為陰性對(duì)照，37℃孵育2h，PBS洗3次，加入AP標(biāo)記的羊抗鼠κ，37℃孵育1h，以PNPP為底物顯色。酶標(biāo)儀讀數(shù)。根據(jù)顯色反應(yīng)的結(jié)果，初步篩選出反應(yīng)信號(hào)強(qiáng)的樣品，進(jìn)行Western blot鑒定。
2.利用抗體庫(kù)及肽庫(kù)篩選CD146分子的特異性抗體及結(jié)合肽以105細(xì)胞/孔接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，4％多聚甲醛固定，2％BSA封閉2h，每孔加入100μl 1010噬菌體抗體庫(kù)或肽庫(kù)(溶于0.5％BSA)，37℃孵育2h，PBST及PBS各洗10次，再以100μl 0.1MpH11.6三乙胺洗脫，收集洗脫液，以不同比例稀釋后感染宿主菌，涂LB平板。陽(yáng)性克隆經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后離心取上清進(jìn)行下一輪篩選。
經(jīng)數(shù)輪篩選后獲得的克隆通過(guò)ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)一步鑒定。
將細(xì)胞以105細(xì)胞/孔接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)2h，4％多聚甲醛固定，2％BSA封閉2h，加入待檢克隆上清及可溶性CD146分子，孵育2h，經(jīng)PBST及PBS洗滌，加入HRP或AP標(biāo)記的二抗，孵育1h后加入底物顯色，酶標(biāo)儀讀數(shù)。與CD146特異結(jié)合的噬菌體抗體孔將呈現(xiàn)出弱顯色反應(yīng)。
經(jīng)以上步驟確認(rèn)有特異結(jié)合活性的噬菌體抗體重新轉(zhuǎn)化宿主菌，制備成質(zhì)粒DNA，將重、輕鏈克隆于通用載體，利用通用引物測(cè)序。
實(shí)施例四檢測(cè)CD146細(xì)胞模型篩選藥物的激活或抑制效應(yīng)1.MTT法檢測(cè)CD146細(xì)胞模型篩選藥物的激活或抑制效應(yīng)。
以天然表達(dá)CD146分子的內(nèi)皮細(xì)胞為對(duì)象，采用MTT法檢測(cè)CD146細(xì)胞模型篩選藥物的激活或抑制效應(yīng)。方法如下取新生血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，胰酶消化并計(jì)數(shù)，以每孔3000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板。24小時(shí)后加入不同濃度篩選出的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24-72小時(shí)。棄上清，每孔加入0.1mg/0.1ml的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后加150μl DMSO振蕩，于560nm測(cè)OD值并計(jì)算存活率?？瞻讓?duì)照為不加細(xì)胞孔。陰性對(duì)照為不加藥物組。根據(jù)細(xì)胞的存活率分析藥物對(duì)細(xì)胞的影響，判斷該藥物是內(nèi)皮細(xì)胞的激活劑還是抑制劑。
2.[3H]摻入法測(cè)定藥物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。
方法如下取旺盛生長(zhǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞，胰酶消化后以3000個(gè)細(xì)胞每孔接種96孔板，加入含10％FCS的DMEM培養(yǎng)基，孵育2h，棄培養(yǎng)液，加入無(wú)血清培養(yǎng)基過(guò)夜，次日加入不同量的藥物，孵育48h。然后加入[3H]標(biāo)記胸腺嘧啶，溫育4h，收集細(xì)胞，經(jīng)液閃儀測(cè)定，分析藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。
3.檢測(cè)藥物對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞黏附的影響方法如下分離培養(yǎng)原代天然表達(dá)CD146分子的滋養(yǎng)層細(xì)胞。用胞外基質(zhì)蛋白鋪96孔板，室溫過(guò)夜。，以每孔約1×105個(gè)細(xì)胞接種，將不同濃度篩選出的藥物到滋養(yǎng)層細(xì)胞中，孵育2h。用PBS洗去沒(méi)黏附的細(xì)胞，黏附的細(xì)胞用4％多聚甲醛固定15分鐘，再用PBS洗，然后用2％Giemsa染色30分鐘，洗滌，甲醇固定，用酶標(biāo)儀在630nm波長(zhǎng)處測(cè)定O.D.值。陰性對(duì)照為不加藥物組。根據(jù)O.D.值的比較，判斷該藥物是滋養(yǎng)層細(xì)胞黏附的激活劑還是抑制劑。
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權(quán)利要求
1.一種篩選抑制新血管生成藥物的方法，包括使用CD146蛋白分子或者表達(dá)CD146蛋白的細(xì)胞篩選出具有CD146結(jié)合活性的生物分子；用天然表達(dá)CD146分子的細(xì)胞檢測(cè)上述的具有CD146結(jié)合活性的生物分子是否能夠抑制或激活這種細(xì)胞生長(zhǎng)。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的生物分子是配體、抗體分子或基因工程片段、多肽、或者免疫毒素。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的表達(dá)CD146的細(xì)胞是293-EBNA細(xì)胞系，其保藏編號(hào)為CGMCC 0642。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的篩選具有CD146結(jié)合活性的生物分子是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性ELISA進(jìn)行的。
5.一種用于篩選抑制新血管生成藥物的表達(dá)CD146蛋白的293-EBNA細(xì)胞系，其保藏編號(hào)為CGMCC 0642。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種篩選抑制新血管生成藥物的方法，包括使用CD146蛋白分子或者表達(dá)CD146蛋白的細(xì)胞篩選具有CD146結(jié)合活性的生物分子；用天然表達(dá)CD146分子的細(xì)胞檢測(cè)上述的具有CD146結(jié)合活性的生物分子是否能夠抑制或激活這種細(xì)胞生長(zhǎng)。用本發(fā)明篩選出的藥物不僅可應(yīng)用于血管生成相關(guān)疾病的預(yù)防、診斷和治療，而且可作為一種新型流產(chǎn)避孕藥物，用于人口控制。
文檔編號(hào)G01N33/15GK1410772SQ0113609
公開(kāi)日2003年4月16日 申請(qǐng)日期2001年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月8日
發(fā)明者閻錫蘊(yùn), 林蕓, 劉琴 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所