一種用于防治番茄灰霉病的解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物防治領(lǐng)域，具體涉及一種用于防治番茄灰霉病的解淀粉芽抱 桿菌，及含有該解淀粉芽抱桿菌的微生物菌劑，還涉及它們在防治番茄灰霉病i:的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 番茄灰霉病是由灰簡萄適菌度ot巧tiscinereaPers.)引起的一種重要病害。該 病害:±1要危害果實(shí)，造成果買腐欄i，位危害葉、圣和接1，番茄減產(chǎn)Rj虹2 0 ?."〇~5 0 %,損失嚴(yán) 重。該病原菌寄主范圍較廣，除侵染茄科蔬菜外，還可侵染瓜類、甘藍(lán)、菜豆.，萬宦、洋蔥、蘋 果等作物。
[0003] 目前，拇番茄灰霉病的主耍防治方法畜；一是化學(xué)防治?；瘜W(xué)防治雖有見效決、效 率高等優(yōu)點(diǎn)，但是因長期使用會造成環(huán)境污染、危害害蟲的天敵等缺點(diǎn)，因化逐步被淘汰； 其次是生物防治，臣于生物防治藥效高、捧效期長、不易產(chǎn)生抗藥性、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)日益 受到人們的青釀。
[0004] 芽適桿菌優(yōu)acilliusSP)是一種受到廣泛關(guān)注的生防細(xì)菌，W其分布廣、易分 離培養(yǎng)、能產(chǎn)生抗逆性較強(qiáng)的芽抱、肢藏期長和使羯方便等特點(diǎn)，成為--種理想的生防微 生物。因芽抱桿菌能產(chǎn)生內(nèi)生芽鹽，有極強(qiáng)的抗逆能力，報(bào)比其他類型的生防因子，更有 利于菌剤的生產(chǎn)，在劑型加工環(huán)境中存活、定殖與繁殖。因此，歸選猜病原菌具有抑朝 作用的芽抱桿菌是防治有關(guān)植物病害的最有效方法之一。解淀粉芽抱桿菌優(yōu)acillus a也yloliquefaciens)是羯于防治蓄茄灰霉病的芽抱桿菌之--，目前，用于防治番茄灰霉病 的解淀粉芽抱桿菌主耍有CGMCCNo. 4777 (專利號：ZL201210059785, 0)、BA-KA3 (【申請?zhí)枴?201410618581. 5)、SZ23(【申請?zhí)枴?01410683826. 2)、LH-1 (專利申請?zhí)枺?01410735508.巧 和NCPSJ17(申請?zhí)枺?013i0112580.9)等。由于病原菌的多樣性和同步迸化，因化需耍不 斷-尋找新的雇株防治番茄灰霉病。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供一種周于防治番茄灰霉病的解淀粉芽抱桿菌菌株，該菌株具 有高效、廣譜殺菌活性化點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明第二目的在平提供利用上述解淀粉芽抱桿菌生產(chǎn)的微生物菌滿。
[0007] 本發(fā)明第=目的在于提供上述微生物菌荊的副備方按。
[0008] 本發(fā)明第四目的在于提供上述解淀粉芽抱桿菌在防治番茄灰霉病上的用途。
[0009] 本發(fā)明第五目的在于提供上述微生物菌韻在防治番茄灰霉病±的用途。
[0010] 本發(fā)明第六目的在于提供上述上述解淀粉芽抱桿菌的鑒定方接。
[0011] 本發(fā)明第七目的在于提供上述微生物菌劑的鑒定方法。
[0012] 本發(fā)明通過於F技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)；
[0013] -一種解淀粒芽抱桿菌（BacillusafflyloHquefaciens)菌樣HMB27633,己于 2015 年9月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中必（保藏地址為：北京市 朝陶區(qū)北辰西路i號院3號中國科學(xué)院微生物研究所），保藏編號為CG版匯No. 11454。 防014] 利用i：述解淀粉芽殖桿菌生產(chǎn)的微生物菌剤，其活性成分為H艦27633菌體。
[0015] ±述微生物菌刻巧臥為液體制滿或粉剤。
[0016] ±述徵生物菌剤中1做827633的活菌數(shù)大于21. 0X108cfu/mL。
[0017] 上述微生物菌劑的制備方法，包括如下步驟；
[0018] (1)菌種活化；蔣低溫保存的HMB27633菌株在LB平板培養(yǎng)基上活化；挑取單菌落 在LB斜面培養(yǎng)基上，在巧~3日°0下培養(yǎng)10~16小時，得活化的菌株；
[001引 城種子液制備：用無菌的接種環(huán)刮取一環(huán)步驟（1)活化的菌株接種到100因LLB 液體培養(yǎng)基中，在2日~35。0、轉(zhuǎn)速為150~220rpm條件下培養(yǎng)10~16小時，得種子液；
[0020] 城發(fā)酵培養(yǎng)；按照體積比為1~3%的比例將步驟城所得的種子液接入到玉米 粉黃豆粉培養(yǎng)基中，在溫度為巧~35'C、轉(zhuǎn)遽為150~22化pm條鐘下發(fā)醇培養(yǎng)40~50h， 得發(fā)酵液；
[0021] (4)檢測發(fā)酵液中菌體巧芽疆?dāng)?shù)量，待發(fā)薛液中成熟芽疆占到芽抱和菌體總數(shù)的 90%時停止發(fā)酵培養(yǎng)，所得即為欄827633菌株的液俸副剤。
[0022] ±述制備方法中所述的LB平板培養(yǎng)基、LB斜面培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基均按照常 規(guī)方按制備。
[0023] 述制備方法步驟（1)中所述的LB平板培養(yǎng)基，其組成成分及其重量比為：膜蛋 白朦8~12g,酵母提取物4~6g，氯化鋼4~6g，瓊脂粉口~18g,水1000陽U
[0024] ±述制備方法步驟（1)中所述的LB斜面培養(yǎng)基，其組成成分及其重量比為：膜蛋 白藤8~12g，酵母提襄物4~6g，氯化鏈4~6g，瓊脂粉12~18g，水lOOOmL。
[002引上述審y備方法步驟巧中所述的LB液體培養(yǎng)基，其組成成分及其重量比為：膜蛋 白腺8~12g，酵母提取物4~6g，氯化鏈4~6g，水1000陌L，
[0026] ±述制備方接步驟（3)中所述的玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基，其組成成分及其重量百分 比為；玉米粉1.日~3, 0 %，黃岳粉1.日~3, 0%，NaCl0. 1~L0 %，M;iS〇4* &0 0.日~ 1. 0 %，其余為水；pH值為7. 2。
[0027] 所述的玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基的靑1|備方法，包括按照重量百分比將玉米粉、黃豆粉、 化C1和MnS〇4 *HgO混合，再加水，媚節(jié)pH攬拌巧勻即可。 賄2引 ±述解淀粉芽袍桿菌描舊27633在防治番茄灰霉病上的應(yīng)周。
[0029] 上述微生物菌劑在防治番茄灰霉病上的應(yīng)用。
[0030] ±述微生物菌剤的使用方法；將上述所得微生物菌剤用水稀禪至活菌體數(shù)為 107c化ZmL，于蓄茄灰霉病發(fā)病前迸行葉面噴霧，即可達(dá)到預(yù)蘭番茄灰霉病發(fā)生的目的。
[0031] 1做827633菌株的篩選分離過程
[0032] HMB27633菌棟是河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所從湖北省雍!州市的棉田上壤 中分離得到。2013年4月河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所從湖北省嫣州市棉田中五點(diǎn)采 集±；樣，混勻后稱取Ig放到250血的滅菌H角瓶中，加入lOOmL無菌水，放到搖床上，17化/ min振蕩30min，靜置化，取上清液lOmL加入50血滅菌離也管中，在80'C恒濕水浴30分鐘， 然后取imL加無菌水9mU即成lOmLlO3倍上壤徽生物懸液，繼而將上壤懸液稀釋成10 \ 10 5、10 6倩稀釋液，取各濃度微生物懸液200UL涂于LB培養(yǎng)基平板上，每個濃度重復(fù)3次， 在30。直溫培養(yǎng)Id~3d，進(jìn)行細(xì)菌的分離和純化。并番茄灰霉病為雖標(biāo)，通過平板捉時 法、離體葉片法、盆栽試驗(yàn)法進(jìn)行生防菌的歸選。結(jié)果從中篩選化一個對番茄灰霉病具有明 濕防治效果的菌株，足名為陸松27633。
[0033] HMB27633菌株的分類鑒定：
[0034] (1)形;態(tài)特征鑒定
[003引在LB培養(yǎng)基__h培養(yǎng)菌體為桿狀，培養(yǎng)lOh后產(chǎn)生芽胞，芽廳中生，楠圓形，胞囊不 膨大，抗酸染魚陰性，無伴胞晶體，能運(yùn)動，鞭毛周生。在營養(yǎng)瓊脂平板上，培養(yǎng)初期菌落淡 乳白色，腺狀，圖形，邊緣整齊，菌落隆起呈慢頭狀，表面濕潤：培養(yǎng)后期菌落淡黃色，邊緣 不整齊，表面平燥有摺皺；在營養(yǎng)瓊脂斜面上劃線培養(yǎng)，呈直線形；在液體培養(yǎng)基中靜記培 養(yǎng)，表面形成白色菌膜。這些形態(tài)特征與《常見翊菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠等編著.科學(xué) 出版社，2001年）中描述的芽抱桿菌屬形態(tài)特征基本--致，初步判斷菌株[1陸27633屬于芽 袍桿菌。
[0036] (2)利周16S巧NA序列鑒定分類
[0037] 勁MB27633的基因組DNA為模板，F(xiàn)27和R1492為引物對16SrDNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，所述的引物序列為；
[0038] F27 :5,AGAGTTTGATCATGGCTCAG3,；（SEQIDNo:l)
[0039] R1492 ;5,GGCTACCTTGTTACGACTT3';(絕QI日No:2)
[0040] 16SrDNA的擴(kuò)增反應(yīng)體系為 50tiL:i0XPCRBuffer舶g2+巧uLsdNTP 齡巧ure任 5 訊曲 5wL;Taq巧[J/uL) 1L，F(xiàn)27 (10u!!ioi/L) 1yL，R1492 (10y也oj_/L) 1uL;HMB27633的基因組D