一株耐乙醇運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一株耐己醇運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌及其制備方法和 應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 隨著能源危機(jī)的不斷高漲W及環(huán)境問題日益突出，利用再生資源制備生物燃料領(lǐng) 域越發(fā)受人矚目，其重要性也不斷凸顯。在過去幾十年中，生物己醇的生產(chǎn)一直受人關(guān)注。 其中，利用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis)制備生物己醇的研究已進(jìn)行多年。運(yùn)動(dòng) 發(fā)酵單胞菌作為唯--種通過化tner-Doudoroff巧D)代謝途徑發(fā)酵葡萄糖的微生物，具 有較高的己醇發(fā)酵力和己醇耐受性等優(yōu)勢(shì)，在生物己醇生產(chǎn)中具有重要地位。
[0003] 然而，在纖維素等生物質(zhì)己醇發(fā)酵過程中，許多環(huán)境壓力因素抑制著菌體的生長(zhǎng) 及其己醇發(fā)酵的能力。高己醇濃度、滲透壓W及有氧脅迫等是抑制運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的生長(zhǎng) 和己醇發(fā)酵的主要因素。如何獲得高耐受性菌株，是研究者多年來的愿望。
[0004] 然而，在現(xiàn)有技術(shù)中，可耐己醇的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌少之又少，且耐受能力普遍較 低。其原因在于，一般的誘變育種方法所需時(shí)間長(zhǎng)、效率低且隨機(jī)性巨大。隨著基因工程技 術(shù)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)改造細(xì)菌并獲得耐己醇的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌可能成為解決該一 問題的方法。然而，在如何對(duì)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌進(jìn)行基因改造使之耐受己醇方面上，目前的研 究還很少，且尚未獲得確切認(rèn)識(shí)。
[0005] 因此，亟待找到一種可W獲得耐己醇運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的基因工程改造方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的之一在于提供一株耐己醇運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌， 該耐己醇運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌含有經(jīng)突變改造后的rpoD基因，該基因編碼的化oD蛋白的點(diǎn)突 變?yōu)镼5化、G426C和I448N ;所述耐己醇運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌能耐受初始濃度至少為9%的己醇； 所述耐己醇運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的分類命名為皿?如7is ZM4-mropD，保藏于中國(guó)普 通微生物菌種保藏管理中也（北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究 所郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC NO. 10617,保藏時(shí)間為2015年3月12日。
[0007] 一般而言，Q57殘基負(fù)責(zé)調(diào)控DNA連接和啟動(dòng)子連接，W獲得正確的啟動(dòng)，因此，突 變Q5化有可能影響了 DNA和啟動(dòng)子對(duì)RNA聚合酶的連接。突變I448N的作用，有可能是W 一種未知而精妙的方式影響著轉(zhuǎn)錄。雖然該菌株耐己醇的機(jī)理還有待研究，但該菌株的耐 己醇性能是十分優(yōu)良的。如本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例所示，本發(fā)明的菌株可W耐受初始濃度至 少為9%的己醇，在己醇初始濃度為10%時(shí)仍可W較為良好的生長(zhǎng)。在含有己醇初始濃度為 9%的RM培養(yǎng)基中，本發(fā)明菌株ZM4-m巧oD在培養(yǎng)4她后，菌體濃度便達(dá)到了 0Dew=l. 5,而 對(duì)照菌株ZM4-巧oD (化oD未受突變）的菌體濃度僅為0〇6。。=0. 8。
[0008] 需要指出的是，本發(fā)明得到的菌株含有經(jīng)突變改造后的rpoD基因，該基因編碼的 化oD蛋白的點(diǎn)突變?yōu)镼57L、G426C和I448N，任何在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，再對(duì)其它無(wú)關(guān)的位置 進(jìn)行突變而得的菌株，均實(shí)質(zhì)上與本發(fā)明相同，仍屬本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0009] 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供耐己醇運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的制備方法，該方法包括如 下步驟： 1) 突變巧oD 基因的制備；利用 GeneMo;rph II Random Mutagenesis Kit 對(duì);rpoD 的 PCR產(chǎn)物進(jìn)行易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；篩選出編碼蛋白的點(diǎn)突變?cè)赒5化、G426C和I448N的突 變巧oD基因； 2) 重組質(zhì)粒pBmrpoD的構(gòu)建；將步驟1)所得物進(jìn)行純化后，用化;Ml I和思<3 I 處理，再連接到與質(zhì)粒地BRlMCS-tet所對(duì)應(yīng)的限制性位點(diǎn)即得重組質(zhì)粒地皿poD，所述 pBBRlMCS-tet含有丙麗酸脫駿化酶的啟動(dòng)子和終止子； 3) 將重組質(zhì)粒地皿poD轉(zhuǎn)化入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌Z. mobilis ZM4中，并在培養(yǎng)基中進(jìn)行 培養(yǎng)； 4) 將步驟3)的培養(yǎng)物接種到含有己醇的培養(yǎng)基中，己醇初始濃度為7-9%，經(jīng)H輪篩選 后，將細(xì)菌置于含有9%己醇和5 y g/ml四環(huán)素的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，隨機(jī)挑選單克隆，提 取質(zhì)粒后，進(jìn)行DNA測(cè)序。
[0010] 所述純化是利用E. Z. N. A?Gel Extraction Kit,并嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書操作說明 進(jìn)行的。
[0011] 步驟3)和步驟4)中，所述培養(yǎng)基為RM培養(yǎng)基。
[0012] 步驟3中，所述轉(zhuǎn)化為電轉(zhuǎn)化。
[0013] 步驟3中，在所述培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)方式為：先于RM固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，再于RM液體 培養(yǎng)基中在3(TC下靜置過夜培養(yǎng)。
[0014] 本發(fā)明的第H個(gè)目的在于提供所得的耐己醇運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌在己醇生產(chǎn)上的應(yīng) 用。如本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例所示，在含有己醇初始濃度為9%的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2化之后，本 發(fā)明菌株ZM4-mE4消耗了近78%的葡萄糖，而對(duì)照菌株ZM4-巧oD僅僅消耗了 35%左右的葡 萄糖；培養(yǎng)5化之后，本發(fā)明菌株ZM4-m巧oD消耗了近93%的葡萄糖，而對(duì)照菌株ZM4-巧oD 僅消耗了 70%左右的葡萄糖。該證明本發(fā)明菌株ZM4-mE4在生產(chǎn)己醇時(shí)，能耐受較高濃度 的己醇，可W更高效的利用葡萄糖進(jìn)行繁殖生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)己醇的高效生產(chǎn)。
[0015] 本發(fā)明的有益效果： 1、 本發(fā)明所得菌株具有優(yōu)良的耐受己醇的能力，能耐受初始濃度至少為9%的己醇； 2、 本發(fā)明的制備方法工藝要求不苛刻，易于操作； 3、 本發(fā)明菌株ZM4-mrpoD在己醇生產(chǎn)上具有巨大的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0016] 圖1為不同己醇濃度對(duì)本發(fā)明菌株ZM4-m巧oD和對(duì)照菌株ZM4-巧oD生長(zhǎng)的影響， 圖中，ZM4-m巧oD為本發(fā)明菌株ZM4-m巧oD，ZM4-巧oD為對(duì)照菌株ZM4-巧oD，ethanol意為 己醇； 圖2為本發(fā)明菌株ZM4-m巧oD和對(duì)照菌株ZM4-巧oD在不同己醇濃度下的生長(zhǎng)曲線；a 為在己醇濃度為0%的生長(zhǎng)曲線，b為在己醇濃度為6%的生長(zhǎng)曲線，C為在己醇濃度為8%的 生長(zhǎng)曲線，d為在己醇濃度為10%的生長(zhǎng)曲線； 圖3為本發(fā)明菌株ZM4-m巧oD和對(duì)照菌株ZM4-巧oD在己醇濃度為9%時(shí)對(duì)葡萄糖的消 耗情況，其中，Glucose concentration of ZM4-巧oD意為"培養(yǎng)對(duì)照菌株ZM4-巧oD后，培 養(yǎng)基所剩葡萄糖的濃度"，Glucose concentration of ZM4-nirpoD意為"培養(yǎng)本發(fā)明菌株 ZM4-m巧oD后，培養(yǎng)基所剩葡萄糖的濃度"，Growth of ZM4-巧oD意為"對(duì)照菌株ZM4-巧oD 的生長(zhǎng)情況"，Growth of ZM4-nirpoD意為"本發(fā)明菌株ZM4-nirpoD的生長(zhǎng)情況"，Glucose意 為"葡萄糖"，Cell growth意為"細(xì)菌生長(zhǎng)"； 圖4為在含有己醇情況下本發(fā)明菌株ZM4-m巧oD和對(duì)照菌株ZM4-巧oD的粗提物中的 丙麗酸脫駿酶（roc)和己醇脫氨酶（ADH)的活性表征圖； 圖5為本發(fā)明菌株ZM4-m巧oD和對(duì)照菌株ZM4-巧oD在不同己醇濃度下，a化B和pdc的 表達(dá)的倍數(shù)情況，A為在己醇濃度為0%的情況，B為己醇濃度為9%的情況； 圖6為本發(fā)明菌株ZM4-nirpoD的重組質(zhì)粒pBmrpoD和對(duì)照菌株ZM4-巧oD的重組質(zhì)粒 pBmrpoD的示意圖，Ppdc和化dc分別代表丙麗酸脫駿酶的啟動(dòng)子和終止子。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要在此指出的是W下實(shí)施例只是用 于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練 人員根據(jù)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
所做出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0018] 下述實(shí)施例中所需的引物序列如表1所示。
[001引 實(shí)施例1 重組質(zhì)粒pBm巧oD的構(gòu)建： 利用GeneMo;rph II Random Mutagenesis Kit對(duì)化oD的PCR產(chǎn)物進(jìn)行易錯(cuò)聚合酶鏈 式反應(yīng)；篩選出編碼蛋白的點(diǎn)突變?cè)赒57L、G426C和I448N的突變r(jià)poD基因；將反應(yīng)產(chǎn)物 利用E. Z. N. A?Gel Extraction Kit進(jìn)行純化后，用公a紐I和思a I處理，再連接到與質(zhì) 粒地BRlMCS-tet所對(duì)應(yīng)的限制性位點(diǎn)即得重組質(zhì)粒地皿poD,所述地BRlMCS-tet含有丙麗 酸脫駿