一種單細(xì)胞基因組擴(kuò)增后擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量鑒定的方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種單細(xì)胞基因組擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量鑒定 的方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 在單細(xì)胞水平下對(duì)DNA進(jìn)行研宄能夠有效地避免多細(xì)胞水平研宄的諸多局限，尤 其在胚胎領(lǐng)域。由于對(duì)早期胚胎進(jìn)行染色體檢測(cè)，必須進(jìn)行單細(xì)胞水平的DNA分析。因此， 開發(fā)應(yīng)用于單個(gè)細(xì)胞研宄的技術(shù)方法，以便揭示細(xì)胞異質(zhì)性的規(guī)律，對(duì)于更好地進(jìn)行細(xì)胞 生物學(xué)研宄具有重大的意義。單細(xì)胞分析中，包括對(duì)單細(xì)胞基因組、表達(dá)譜和代謝組的研 宄。目前，微量DNA和單細(xì)胞基因組研宄已被廣泛應(yīng)用于考古學(xué)、微生物生態(tài)學(xué)、醫(yī)學(xué)檢測(cè)、 法醫(yī)學(xué)檢測(cè)、臨床診斷等領(lǐng)域。在生殖醫(yī)學(xué)中，單細(xì)胞研宄對(duì)產(chǎn)前診斷、胚胎植入前遺傳診 斷、精子和卵子的遺傳病診斷等意義尤為重大。
[0003] 目前，主要通過對(duì)單細(xì)胞基因組進(jìn)行測(cè)序來進(jìn)行單細(xì)胞基因組分析。因?yàn)椋Ｓ?的DNA分析方法例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR)、限制性片段長(zhǎng) 度多態(tài)性分析（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分 析（SSCP)、指紋技術(shù)和焚光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in Situ Hybridization，F(xiàn)ISH) 等，只能對(duì)單細(xì)胞基因組的部分區(qū)域或已知位點(diǎn)進(jìn)行研宄，且缺乏對(duì)全新物種的基因組 研宄的有效策略，而對(duì)單細(xì)胞基因組進(jìn)行測(cè)序可以有效避免這些不足。單細(xì)胞基因組的 DNA量為皮克級(jí)水平，而目前的測(cè)序技術(shù)要求起始DNA量為微克級(jí)水平，因此，必須將單細(xì) 胞基因組進(jìn)行全基因組擴(kuò)增（WGA)使之達(dá)到足夠量。然而已知的全基因組擴(kuò)增方法包括 PEP-PCR，D0P-PCR (簡(jiǎn)并寡核苷酸引物的聚合酶鏈反應(yīng)）等基于PCR的方法，以及多重鏈置 換擴(kuò)增（MDA, Multiple Displacement Amplification)，均容易受到較多因素干擾，無法 保證擴(kuò)增達(dá)到100%的成功率。而對(duì)于擴(kuò)增效率和擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量評(píng)估，目前只能依據(jù)擴(kuò)增 后條帶的均勻性及片段長(zhǎng)度來判斷，但這種方法存在很大的局限性。因此，亟需設(shè)計(jì)一種新 的單細(xì)胞基因組擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量鑒定的方法和試劑盒以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足。
[0004]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種單細(xì)胞基因組擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量鑒定的方法和試劑盒，以克 服目前現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)： 一種單細(xì)胞基因組擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量鑒定的方法，包括以下步驟： 對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行分離并裂解，得到該單細(xì)胞的全基因組DNA ; 對(duì)全基因組DNA進(jìn)行單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增，得到全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物； 采用5對(duì)基因組上保守區(qū)段的特異性引物，將其放在一個(gè)擴(kuò)增體系中，以全基因組擴(kuò) 增產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)5個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷全基因組擴(kuò) 增產(chǎn)物的質(zhì)量，結(jié)果顯示為在電泳圖上均勻分布條帶的3-5個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物為符合測(cè)序要求的 擴(kuò)增產(chǎn)物樣品； 對(duì)符合測(cè)序要求的擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建DNA測(cè)序文庫(kù)； 對(duì)所述DNA測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序。
[0007] 優(yōu)選的，單細(xì)胞全基因組的擴(kuò)增技術(shù)為多重置換擴(kuò)增MDA全基因組擴(kuò)增技術(shù)。
[0008] 優(yōu)選的，所述單細(xì)胞為人單細(xì)胞，基因組上保守區(qū)段選自DCTN6、RPL37A、URI1、 SNTA1、人13號(hào)染色體上位置82722059、SEMA3A、人16號(hào)染色體上位置86386387、RAD9A、 DIRC3、EIF2B1中的5種或多于5種。
[0009] 優(yōu)選的，所述基因組上保守區(qū)段的特異性引物序列為： URI1 引物 1 :TTCTGTTGAAGGAAAGAAGGTAGG， URI1 引物 2 :GTCTGATATTTTGGTGCACCCATTAC ; chrl3_82722059 引物 1 :ACAGAAGTCTGGGATGTGGAGGA， chrl3_82722059 引物 2 :GGGCAGCCCAAAAAGACAGACAGA ; SEMA3A 引物 1 :CCATGTTGGTCAG， SEMA3A 引物 2 :GATTCCACATTTA ; chrl6_86386387 引物 1 :TTTGTGTGTGCATCTGTAAGCATG， chrl6_86386387 引物 2 :GGGGGTCTAAGAGCTTGTAAAAAG ; DIRC3 引物 1 : TGTGGAGTGGAGGTGCCTAAAG DIRC3 引物 2 :GTCCTACCAGAATGCCAGTCC ; DCTN6 引物 1 : CTGGGATCTCTCCCTTGGGCGTAAA， DCTN6 引物 2 :TTCAGGACAGTGATGCCCCAGGAA ; RPL37A 引物 1 : GCCTGAGGCTTGGTGGTGTGTATCC， RPL37A 引物 2 :AGTGCTGGTGAAGGGTCACAGCCA ; SNTA1 引物 1 :TGGCCCAGAGTGGGAGGTCATTGT， SNTA1 引物 2 :TGTTGCCCTATCCCATGCTGGAGA ; RAD9A 引物 1 :TGATTTGGGGTGGGGTGAATGTGA， RAD9A 引物 2 :AGTGGCTCAGCATGTCAAGGCCAG ; EIF2B1 引物 1 :GGGAAGCCCAAGGGCCTGATTCTA， EIF2B1 引物 2 :TCATCCCGCAGCTCCAGTCTTCATC。
[0010] 一種單細(xì)胞基因組擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量鑒定的試劑盒，包括所述基因組上保守區(qū)段的特 異性引物，以對(duì)全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因組上保守區(qū)段檢測(cè)。
[0011] 優(yōu)選的，所述單細(xì)胞為人單細(xì)胞，基因組上保守區(qū)段選自DCTN6、RPL37A、URI1、 SNTA1、人13號(hào)染色體上位置82722059、SEMA3A、人16號(hào)染色體上位置86386387、RAD9A、 DIRC3、EIF2B1中的5種或多于5種。
[0012] 優(yōu)選的，所述基因組上保守區(qū)段的特異性引物序列為： URI1 引物 1 :TTCTGTTGAAGGAAAGAAGGTAGG， URI1 引物 2 :GTCTGATATTTTGGTGCACCCATTAC ; chrl3_82722059 引物 1 :ACAGAAGTCTGGGATGTGGAGGA， chrl3_82722059 引物 2 :GGGCAGCCCAAAAAGACAGACAGA ; SEMA3A 引物 1 :CCATGTTGGTCAG， SEMA3A 引物 2 :GATTCCACATTTA ; chrl6_86386387 引物 1 :TTTGTGTGTGCATCTGTAAGCATG， chrl6_86386387 引物 2 :GGGGGTCTAAGAGCTTGTAAAAAG ; DIRC3 引物 1 :TGTGGAGTGGAGGTGCCTAAAG DIRC3 引物 2 :GTCCTACCAGAATGCCAGTCC ; DCTN6 引物 1 :CTGGGATCTCTCCCTTGGGCGTAAA， DCTN6 引物 2 :TTCAGGACAGTGATGCCCCAGGAA ; RPL37A 引物 1 :GCCTGAGGCTTGGTGGTGTGTATCC， RPL37A 引物 2 :AGTGCTGGTGAAGGGTCACAGCCA; SNTA1 引物 1 :TGGCCCAGAGTGGGAGGTCATTGT， SNTA1 引物 2 :TGTTGCCCTATCCCATGCTGGAGA; RAD9A 引物 1 :TGATTTGGGGTGGGGTGAATGTGA， RAD9A 引物 2 :AGTGGCTCAGCATGTCAAGGCCAG; EIF2B1 引物 1 :GGGAAGCCCAAGGGCCTGATTCTA， EIF2B1 引物 2 :TCATCCCGCAGCTCCAGTCTTCATC。
[0013] 優(yōu)選的，所述試劑盒還含有用于對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增的試劑成分，所述單 細(xì)胞全基因組擴(kuò)增采用多重置換擴(kuò)增MDA或DOP-PCR。
[0014] 本發(fā)明的有益效果為：設(shè)計(jì)合理，能夠在單細(xì)胞基因組的全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序 前，對(duì)全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)和篩選，以去除未擴(kuò)增成功的樣本，保證后續(xù)單細(xì)胞基因 組測(cè)序的成功率，避免擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量不合格導(dǎo)致人力、物力浪費(fèi)。
[0015]
【附圖說明】
[0016] 下面為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例 中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本申請(qǐng)的一些 實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附 圖獲得其他的附圖。
[0017] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例所述的單細(xì)胞基因組擴(kuò)增產(chǎn)物