一種vkorc1基因擴(kuò)增的檢測(cè)引物組及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種SNP的試劑盒，具體講，涉及一種VK0RC1基因擴(kuò)增的檢測(cè)引物組 及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 華法林是臨床常用治療血栓性疾病的一種香豆素類口服抗凝藥，具有抗凝和溶 栓的雙重作用。華法林的抗凝治療指數(shù)范圍狹窄，如果劑量不足則達(dá)不到治療效果，劑量 稍過量則會(huì)引起出血，重者危及病人生命。然而，華法林血漿藥物濃度和療效存在明顯的 個(gè)體差異和種族差異，有研究表明，不同患者使用抗凝血藥物華法林的劑量可以相差20 倍，亞洲人的維持劑量比白種人要低30%~40%。因此，如何在臨床上安全、合理使用華 法林長(zhǎng)期以來是許多研究者關(guān)注的重點(diǎn)和難點(diǎn)。
[0003] 近年來，隨著藥物基因組學(xué)的發(fā)展和華法林藥理作用分子機(jī)制的闡明，單核苷酸 基因多態(tài)性在華法林用量個(gè)體差異中的作用越來越受到人們的重視。目前，已知與華法林 的藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)相關(guān)的基因達(dá)30余種，維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位1基因 (VtaminKepoxidereductasecomplexsubunit1，VK0RC1)的基因多態(tài)性是影響華法林 用量個(gè)體差異最主要的遺傳因素之一。維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位1 (VK0RC1) 使還原型維生素K表氧化，可使凝血因子II、VE、IX和X以及蛋白C和蛋白S活化而產(chǎn)生凝 血效應(yīng)。華法林是維生素K的拮抗劑（VKA)，通過抑制肝臟環(huán)氧化還原酶而產(chǎn)生抗凝作用。 因此，VK0RC1決定了華法林的抗凝效果。
[0004] 維生素K環(huán)氧化物還原酶（VK0R)是華法林作用的靶蛋白。華法林通過抑制VK0R， 使無活性的氧化型（環(huán)氧化物型）VK無法還原為有活性的還原型（氫醌型）VK而起到抗 凝作用。多個(gè)VK0RC1的SNP位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)與華法林用量個(gè)體差異相關(guān)，該基因目前主要研 究的位點(diǎn)是_1639A>G(SNPrs9923231)，攜帶-1639G的患者，其對(duì)華法林的需求量較攜 帶-1639AA的患者高。研究表明，VK0RC1-1639G/A基因多態(tài)性存在民族差異，其基因多態(tài) 性是民族之間華法林劑量差異的主要原因。
[0005] 華法林有R和S兩個(gè)亞型，其中S型抗維生素K的作用最明顯，R型在體內(nèi)基本不 起作用，S型華法林直接作用于維生素K環(huán)氧化物還原酶，使維生素K的氧化型和還原型不 能相互轉(zhuǎn)化，從而抑制維生素K的功能，同時(shí)也抑制一些凝血因子的激活。大量研究證明， VK0RC1基因多態(tài)性可影響華法林的起始使用劑量，VK0RC1GG型用藥劑量最高，GA型次之， AA型最低。華法林在不同種族、年齡、性別人群中的劑量千差萬別，很大的原因在于VK0RC1 基因的多態(tài)性。而在VK0RC1基因中，通過檢測(cè)位點(diǎn)的多態(tài)性然后再結(jié)合患者相關(guān)臨床信息 運(yùn)用藥理遺傳學(xué)的相關(guān)法則基本上可確定華法林的起始使用劑量。
[0006] 美國(guó)FDA批準(zhǔn)的基因診斷和檢測(cè)項(xiàng)目有2000項(xiàng)左右，其中1290多項(xiàng)已完全批準(zhǔn) 用于臨床，大約1000項(xiàng)正在審批過程中。實(shí)踐證明，基因多態(tài)性檢測(cè)是有效的。我國(guó)應(yīng)該 使用華法林而未使用的人群達(dá)90%左右，房顫患者僅有6. 6%正確使用華法林，其原因是 不能確定華法林使用的準(zhǔn)確劑量，不能規(guī)范監(jiān)測(cè)INR。這樣，房顫導(dǎo)致卒中患者明顯增加，臨 床統(tǒng)計(jì)顯示大約有1/3的腦卒中患者由房顫引起。倘若臨床醫(yī)生通過基因檢測(cè)的手段來確 定華法林的起始使用劑量，安全使用華法林，就會(huì)減少房顫的致殘率和致死率。
[0007] 以下是現(xiàn)在對(duì)VK0RC1的分型方法。
[0008] Taqman方法：針對(duì)SNP位點(diǎn)變異設(shè)計(jì)特異性的探針，探針標(biāo)記成本較高；采用熒光 淬滅及雙末端標(biāo)記技術(shù)，有淬滅難以徹底、本底較高的缺陷；采用酶外切活性，定量時(shí)受酶 性能的影響。
[0009] DHPLC技術(shù)和質(zhì)譜分析：分別需要用到高效液相色譜儀與質(zhì)譜儀，設(shè)備昂貴，難以 在臨床診測(cè)中推廣。
[0010] DNA芯片：由于高通量等優(yōu)點(diǎn)在SNP檢測(cè)中得到大量應(yīng)用，但其依靠野生型與突 變型基因雜交動(dòng)力學(xué)的差異對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，由于不同位點(diǎn)之間的雜交動(dòng)力學(xué)差異不 同，在進(jìn)行多位點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)時(shí)條件難以控制、可重復(fù)性差，易出現(xiàn)假陽(yáng)性假陰性結(jié)果。
[0011] 微測(cè)序：作為一種基于陣列的突變分析，目前還面臨著如何降低假陰性率和靶核 苷酸序列組成的變異等關(guān)鍵問題。
[0012] 高溫連接酶法：高溫連接酶檢測(cè)反應(yīng)（ligasedetectionreaction，LDR)是近幾 年逐漸引起人們注意的一種新型基因多態(tài)性檢測(cè)方法，該技術(shù)操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定，結(jié)果可靠。 俗稱小測(cè)序。
[0013] 限制性酶切方法（RFLP):準(zhǔn)確性較好，費(fèi)用也較低.但只能對(duì)一部分含有現(xiàn)成酶 切位點(diǎn)的多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行分型。
[0014] SNaPshot法：基于焚光標(biāo)記單堿基延伸原理的分型技術(shù)，通常用于10-30個(gè)SNP 位點(diǎn)分析。
[0015] DNA測(cè)序法：相對(duì)準(zhǔn)確，價(jià)格較貴。DNA鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)容易造成人工假相，使測(cè)序 結(jié)果出現(xiàn)偏差。
[0016] 高分辨率熔解曲線法（HRM):是近幾年興起的SNP研究工具該方法，無需設(shè)計(jì)探 針，成本低，但結(jié)果準(zhǔn)確度較低。
[0017] 擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)（Amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)):本技 術(shù)通過涉及特異性的引物，有選擇性的擴(kuò)增野生或突變模版，通過擴(kuò)增產(chǎn)物的量來確定是 否為野生型或突變型，利用PCR引物的3'端末位堿基必須與其模板DNA互補(bǔ)才能有效擴(kuò)增 的原理，設(shè)計(jì)等位基因特異性PCR擴(kuò)增引物，在嚴(yán)格的條件下，只有在引物3'堿基與模板配 對(duì)時(shí)才能出現(xiàn)PCR擴(kuò)增帶，從而檢測(cè)出突變。在不同的引物上加上3個(gè)T對(duì)擴(kuò)增出的片段 進(jìn)行區(qū)分。
[0018] 毛細(xì)管電泳（capillaryelectrophoresis，CE)又稱高效毛細(xì)管電泳（high performancecapillaryelectrophoresis，HPCE)，是一類以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直 流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離技術(shù)。毛細(xì)管電泳實(shí)際上包含電泳、色譜及其交叉內(nèi)容，它 使分析化學(xué)得以從微升水平進(jìn)入納升水平，并使單細(xì)胞分析，乃至單分子分析成為可能。
[0019] 目前國(guó)內(nèi)對(duì)VK0RC1的研究尚屬空白，更沒有成熟的檢測(cè)方法或試劑。
[0020] 有鑒于此，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0021] 本發(fā)明提供一種VK0RC1基因擴(kuò)增的檢測(cè)引物組；
[0022] 本發(fā)明提供一種VK0RC1基因擴(kuò)增的檢測(cè)試劑盒。
[0023] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用技術(shù)方案的基本構(gòu)思是：VK0RC1基因擴(kuò)增的檢 測(cè)引物組，所述VK0RC1檢測(cè)引物組包括：
[0024] VK0RC1-PD-F1 :如SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，或由SEQ ID N0:1所示的核苷 酸序列經(jīng)取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；
[0025] ￥1(01^1-?042:如3￡〇10勵(lì):2所示的核苷酸序列，或由3￡〇10勵(lì) :2所示的核苷 酸序列經(jīng)取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；
[0026] VK0RC1-PD-R :如SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列，或由SEQ ID N0:3所示的核苷 酸序列經(jīng)取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；
[0027] 所述VK0RC1-PD-R為熒光引物，其5'端標(biāo)記有熒光基團(tuán)；
[0028] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述熒光基團(tuán)選自由6-羧基熒光素、六氯-6-甲基 熒光素、VC熒光染料、四氯-6-羧基熒光素、羧基-X-羅丹明、6-羧基四甲基羅丹明、磺酰羅 丹明、6-羧基-4'，5' -二氯-2'，7' -二甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酯、花菁3、花菁5和花 菁5. 5中的至少一種。
[0029] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述VK0RC1-PD-R的熒光基團(tuán)為6-羧基熒光素。
[0030] VK0RC1基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，包括以上所述的VK0RC1基因擴(kuò)增的檢測(cè)引物組。
[0031] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，還包括含Mg2+、Taq酶及dNTPs的PCR反應(yīng)液。
[0032] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，還包括陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品；
[0033] 所述陰性質(zhì)控品為純化水；所述陽(yáng)性質(zhì)控品為滅活全血。
[0034] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述試劑盒分為陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品、VK0RC1反 應(yīng)體系；
[0035] 所述VK0RC1反應(yīng)體系包括VK0RC1PCR反應(yīng)液12. 5yL，VK0RC1引物混合液 6. 5yL，待測(cè)樣本DNA2yL，純化水4yL，共配成25yL反應(yīng)體系；
[0036] 其中所述VK0RC1引物混合液的組成為：1. 5yL的VK0RC1-PD-F1，1. 5yL的 VK0RC1-PD-F2,1. 5yL的VK0RC1-PD-R。
[0037]VK0RC1陽(yáng)性質(zhì)控品的構(gòu)建方法包括以下步驟：
[0038] (1)用無菌注射器在受檢者手臂彎曲處或手背處抽取靜脈血3~5mL，置于EDTA 抗凝管（紫蓋）內(nèi)，輕輕顛倒混勻；
[0039] (2)用天根全血試劑盒進(jìn)行基因組提取；
[0040] (3)提純的基因利用紫外分析法測(cè)定吸光度，計(jì)算濃度，最佳濃度為50ng/ml。
[0041] VK0RC1基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒的使用方法，具體過程如下：
[0042] (1)樣本處理和核酸提??；
[0043] (2)進(jìn)行PCR反應(yīng)；
[0044] (3)通過基因分析儀檢測(cè)，得到片段分析結(jié)果。
[0045] 所述的待測(cè)樣本的處理方法包括：磁珠提取法、柱提法、煮沸裂解法和十六烷基三 甲基溴化銨法，優(yōu)選柱提法。
[0046] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，步驟（1)中所述的樣本為人類基因組DNA，0D260/ 0D280 在 1. 8-2. 0,DNA總量在 3-15yg,稀釋DNA的終濃度至 50-125ng/yL。
[0047]作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，稀釋DNA的終濃度至50ng/ y L。
[0048] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，步驟（2)中PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件為：37°C保溫2分鐘 后；95°C預(yù)變性3分鐘，92~95°C，10~15秒，55