一株耐呋喃甲醛的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一株耐呋喃甲醛的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌及其制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]木質(zhì)纖維素含有70%的碳水化合物，是細(xì)菌生產(chǎn)可再生能源燃料乙醇的重要原料。然而木質(zhì)纖維素中木質(zhì)素與半纖維素以共價鍵形式結(jié)合，并將纖維素分子包埋其中，形成一種堅(jiān)固的天然屏障，使一般微生物很難進(jìn)入使其降解。因此，木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)燃料乙醇需要先經(jīng)過預(yù)處理。其中稀酸預(yù)處理是較常用而成熟的方法，但該方法處理后，會產(chǎn)生大量抑制細(xì)菌發(fā)酵的抑制產(chǎn)物，如呋喃甲醛、甲酸、乙酸等。
[0003]為了克服呋喃甲醛對細(xì)菌發(fā)酵的抑制，需要在預(yù)處理結(jié)束后對水解產(chǎn)物進(jìn)行脫毒純化以除去抑制劑。然而，這一過程不僅耗時，而且還需要復(fù)雜的設(shè)備，增加了成本。另一種方法則是制備可以耐受呋喃甲醛的菌株。
[0004]運(yùn)動發(fā)酵單胞菌是唯一一種通過ED代謝途徑厭氧發(fā)酵葡萄糖的微生物，其獨(dú)特的代謝途徑使其具有較高的乙醇發(fā)酵效率和乙醇耐受性，成為構(gòu)建產(chǎn)乙醇工程菌的優(yōu)選宿主之一。然而在現(xiàn)有研宄中，還未有對運(yùn)動發(fā)酵單胞菌呋喃甲醛耐受性提高的報道，主要原因在于目前尚未知曉對運(yùn)動發(fā)酵單胞菌做何種基因改造可以獲得耐受呋喃甲醛的突變體。
[0005]因此，亟待開發(fā)一種可以獲得耐受呋喃甲醛的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的第一個目的在于提供一株耐呋喃甲醛的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌，該耐呋喃甲醛的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌含有經(jīng)突變改造后的RpoD基因，RpoD的點(diǎn)突變?yōu)镵219E、V522G和Q649L，所述耐呋喃甲醛的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌能耐受濃度至少為3g/L的呋喃甲醛；所述耐呋喃甲醛的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的分類命名為Zymomonas.mob i I is ZM4-MF，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研宄所郵編100101)，保藏號為CGMCC N0.10616，保藏時間為2015年3月12日。
[0007]￥5226位于保守區(qū)域1.2和1.3上，064禮位于保守區(qū)域4上。本發(fā)明菌株RpoD突變后結(jié)構(gòu)-功能的關(guān)系以及對呋喃甲醛的耐受機(jī)理，尚需后續(xù)深入研宄。
[0008]本發(fā)明菌株對于呋喃甲醛的耐受性優(yōu)勢，如本發(fā)明的一個實(shí)施例所示，當(dāng)培養(yǎng)基中呋喃甲醛的濃度為3g/L時，本發(fā)明菌株的菌濃可達(dá)到0.8-1.5 (OD600),而對照菌則幾乎停止生長。
[0009]需要指出的是，本發(fā)明得到的菌株含有經(jīng)突變改造后的rpoD基因，該基因編碼的RpoD蛋白的點(diǎn)突變?yōu)镵219E、V522G和Q649L，任何在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，再對其它無關(guān)的位置進(jìn)行突變而得的菌株，均實(shí)質(zhì)上與本發(fā)明相同，仍屬本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0010]本發(fā)明的第二個目的在于提供耐呋喃甲醛的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的方法，該方法包括如下步驟:
1)突變RpoD的制備:利用 GeneMorph II Random Mutagenesis Kit對rpoD 的PCR產(chǎn)物進(jìn)行易錯聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；篩選出編碼蛋白的點(diǎn)突變在K219E、V522G和Q649L的突變rpoD基因；
2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建:對步驟I)所得物進(jìn)行純化后，用ifeMlI和Z如I處理，再用T4連接酶連接到質(zhì)粒pBBRlMCS-tet上即得重組質(zhì)粒，所述質(zhì)粒pBBRlMCS-tet含有丙酮酸脫羧化酶的啟動子和終止子；
3)將步驟2)所得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入運(yùn)動發(fā)酵單胞菌Z.mobilis ZM4中，并在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；
4)依次將步驟3)所得物在呋喃甲醛濃度為Ig/L、2 g/L和3 g/L的RM培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再將所得培養(yǎng)物涂布于呋喃甲醛濃度為3 g/L和5 y g/ml四環(huán)素的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單克隆，提取質(zhì)粒后，進(jìn)行測序。
[0011]步驟2)中，所述純化是利用E.Z.N.A?Gel Extract1n Kit，低恪點(diǎn)瓊脂糖凝膠的濃度為1%，純化過程嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書操作說明進(jìn)行。
[0012]步驟3 )和步驟4)中，所述培養(yǎng)基為RM培養(yǎng)基。
[0013]步驟3 )中，所述轉(zhuǎn)化為電轉(zhuǎn)化。
[0014]步驟3中，在所述培養(yǎng)時，培養(yǎng)方式為:先于RM固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，再于RM液體培養(yǎng)基中在30 °C下靜置過夜培養(yǎng)。
[0015]本發(fā)明的第三個目的在于提供所得耐呋喃甲醛的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌在乙醇生產(chǎn)上的應(yīng)用。如本發(fā)明的一個實(shí)施例所示，利用本發(fā)明菌株，在發(fā)酵54h后，乙醇的產(chǎn)量為9.8g/L ;而利用對照菌在發(fā)酵54h后，乙醇的產(chǎn)量僅為6.9g/L。本發(fā)明的乙醇產(chǎn)量比利用對照菌發(fā)酵高出42%。
[0016]本發(fā)明的有益效果:
1、本發(fā)明所得菌株具有優(yōu)良的耐受呋喃甲醛的能力，能耐受濃度至少為3g/L的呋喃甲醛；
2、本發(fā)明的制備方法工藝要求不苛刻，易于操作；
3、本發(fā)明菌株在乙醇的生產(chǎn)上具有巨大應(yīng)用前景，能將乙醇的產(chǎn)量提高至少40%以上。
【附圖說明】
[0017]圖1為在不同呋喃甲醛濃度下的RM液體培養(yǎng)基中，本發(fā)明菌株和對照菌株的生長情況；其中Og/1 furfural代表呋喃甲醛的濃度為Og/1 ；lg/l furfural代表呋喃甲醛的濃度為lg/1 ;2g/l furfural代表呋喃甲醛的濃度為2g/l ；3g/l furfural代表呋喃甲醛的濃度為3g/l ；
圖2為本發(fā)明菌株與對照菌株在RM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時的生長曲線；a中呋喃甲醛的濃度為Og/1 ；b中呋喃甲醛的濃度為2g/l ；c中呋喃甲醛的濃度為3g/l ；ZM4-rpoD意為對照菌株；ZM4-MF意為本發(fā)明菌株；
圖3為呋喃甲醛對本發(fā)明菌株和對照菌株的生長情況、葡萄糖攝取情況及乙醇生長情況的影響結(jié)果；其中，Cell growth(0D600)意為細(xì)菌培養(yǎng)液在0D600的吸光度；glucoseand ethanol (g/1)意為葡萄糖與乙醇的濃度(g/1) ;Growth of ZM4_rpoD意為對照菌株的生長情況；Growth of ZM4-MF意為本發(fā)明菌株的生長情況；Glucose concentrat1nof ZM4-ropD意為對照菌株的葡萄糖濃度；Glucose concentrat1n of ZM4-MF意為本發(fā)明菌株的葡萄糖濃度；Ethanol of ZM4_ropD意為對照菌株的乙醇產(chǎn)量情況；Ethanol ofZM4-MF意為本發(fā)明菌株的乙醇產(chǎn)量情況；
圖4為在呋喃甲醛濃度為3g/L的情況下，本發(fā)明菌株和對照菌株的PDC和ADH活性結(jié)果；其中，Enzyme activity (U/g protein)意為酶活(U/g蛋白質(zhì));ZM4_rpoD意為對照菌株；ZM4-MF意為本發(fā)明菌株；PDC at 24h意為培養(yǎng)24h后PDC的酶活；PDC at 48h意為培養(yǎng)48h后TOC的酶活；ADH at 24h意為培養(yǎng)24h后ADH的酶活；ADH at 48h意為培養(yǎng)48h后ADH的酶活。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只是用于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員根據(jù)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
所做出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0019]
[0020]實(shí)施例1
重組質(zhì)粒的構(gòu)建
利用 GeneMorph II Random Mutagenesis Kit 對 RpoD 的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行易錯聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，篩選出點(diǎn)突變?yōu)镵219E、V522G和Q649L的突變RpoD基因。將反應(yīng)產(chǎn)物利用E.Z.N.A?Gel Extract1n Kit進(jìn)行純化，低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠的濃度為1%，用BanR I和Z如I處理，再連接到與質(zhì)粒pBBRlMCS-tet所對應(yīng)的限制性位點(diǎn)即得重組質(zhì)粒，所述pBBRlMCS-tet含有丙酮酸脫羧化酶的啟動子和終止子。
[0021]對照質(zhì)粒的構(gòu)建
將 RpoD 的 PCR 產(chǎn)物利用 E.Z.N.A?Gel Extract1n Kit 進(jìn)行純化后，用 BanR I和Z如I處理，再連接到與質(zhì)粒pBBRlMCS-tet所對應(yīng)的限制性位點(diǎn)即得對照質(zhì)粒，所述pBBRlMCS-tet含有丙酮酸脫羧化酶的啟動子和終止子。
[0022]實(shí)施例2
耐呋喃甲醛的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌(本發(fā)明菌株)的制備:
將實(shí)施例1中所得的重組質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化的方式，轉(zhuǎn)化入z.mobilis ZM4中，將經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌鋪于含有5 μ g/ml四環(huán)素的RM瓊脂固體平板培養(yǎng)基上，刮取單克隆置于RM液體培養(yǎng)基中，在30°C下靜置培養(yǎng)過夜。
[0023]按10% (v/v)將過夜培養(yǎng)菌液依次加入到呋喃甲醛濃度為lg/L、2g/L和3g/L的1ml的RM液體培養(yǎng)基中進(jìn)