一種用于檢測人源性manf基因表達(dá)水平的引物探針組合及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明針對人源性manf基因的mRNA，設(shè)計的特異性引物探針組合，可通過熒光定量PCR相對定量方法對manf基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測；本發(fā)明的特異性引物探針組合可特異性擴增人源性manf基因，避免鼠同源性基因的干擾，并可在同一反應(yīng)體系中檢測內(nèi)參基因，試劑使用方便，只需加入相關(guān)檢測模板即可，不需要繁瑣的操作步驟，整個檢測只需1.5h即可完成，大大提高了人源性manf基因的檢測效率。
【專利說明】
一種用于檢測人源性manf基因表達(dá)水平的引物探針組合及其 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種引物探針組合，尤其涉及一種用于檢測人源性manf基因表達(dá)水平 的特異性引物探針組合及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)營養(yǎng)因子在脊椎動物神經(jīng)元生存及分化中具有重要作用而被用于神經(jīng)保護(hù) 及神經(jīng)再生研究。中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營 derived Neurotrophic Factor，MANF)是在2003年首次體外培養(yǎng)的大鼠中腦I型星形膠質(zhì) 細(xì)胞中分離到的一種高度保守的神經(jīng)營養(yǎng)因子，分子量為20kD。該蛋白通過經(jīng)典內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高 爾基體通路分泌?，F(xiàn)已證實MANF基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)及外周組織中廣泛表達(dá)，其腦內(nèi)分布 以大腦皮質(zhì)、海馬及小腦浦肯野細(xì)胞中相對較高，而膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)水平低。研究表明腦缺 血損傷和神經(jīng)細(xì)胞中多種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可上調(diào)MANF的表達(dá)，體外實驗證實MANF蛋白對多巴胺 能神經(jīng)元具有保護(hù)作用，體內(nèi)實驗亦顯示MANF蛋白對6-OHDA引起的多巴胺能神經(jīng)元的損傷 具有預(yù)防和治療作用。由于MANF蛋白對神經(jīng)元損傷的保護(hù)和治療作用，許多研究將其應(yīng)用 于治療神經(jīng)元損傷性疾病，以阻止疾病的進(jìn)展或促進(jìn)疾病的恢復(fù)。帕金森?。≒arkinson Disea Se，PD)是一種椎體外系進(jìn)行性神經(jīng)退化性疾病，病理學(xué)主要表現(xiàn)為黑質(zhì)多巴胺能神 經(jīng)元和紋狀體多巴胺能神經(jīng)纖維的數(shù)量顯著下降，已有不少研究者采用MANF蛋白對動物 模型進(jìn)行治療的研究。
[0003] MANF作為一種分泌型蛋白，將其用于帕金森疾病的治療模型，由于血腦屏障的存 在，合適的給藥方式以及如何進(jìn)行驗證是需要考慮的問題。腺相關(guān)病毒(adeno-associated vir US，AAV)載體向中樞神經(jīng)系統(tǒng)遞送基因時不影響人體正?；虻墓δ?，而且能夠在神經(jīng) 組織高效表達(dá)異源蛋白質(zhì)，從而成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療中的首選載體。已有學(xué)者 嘗試采用AAV7將MANF基因?qū)氪笫竽X皮層，初步結(jié)果顯示基因?qū)牒驧ANF的表達(dá)水平顯著 提高，并且能夠減輕缺血性腦損傷導(dǎo)致的神經(jīng)功能缺損。但導(dǎo)入基因長期不受控制地過表 達(dá)也可能會導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性過度增加或促進(jìn)細(xì)胞過度增值，從而增加癲癇及腫瘤發(fā)生 的風(fēng)險。為了保證AAV-MANF基因治療的長期安全性，可建立可調(diào)控的基因表達(dá)系統(tǒng)，例如采 用耐受性好并可通過血腦屏障的雷帕霉素調(diào)控基因表達(dá)，以隨時調(diào)節(jié)甚至關(guān)閉基因表達(dá)。
[0004] 目如manf基因表達(dá)的檢測方法有多種，均以基因表達(dá)的廣物mRNA或蛋白為檢測目 標(biāo)，以mRNA為檢測模板的檢測方法有傳統(tǒng)的Northern blot方法、半定量反轉(zhuǎn)錄PCR法以及 熒光定量PCR方法等，以蛋白質(zhì)為檢測底物的檢測方法有免疫組化法、ELISA法等。在以上所 有檢測方法中，以蛋白為檢測目標(biāo)的方法操作比較繁瑣，耗時;傳統(tǒng)的Northern blot方法 操作復(fù)雜，需要用到同位素，而半定量反轉(zhuǎn)錄PCR需要電泳檢測，準(zhǔn)確度不夠高。熒光定量 PCR法是一種靈敏度較高的檢測方法，操作簡單，熒光定量PCR相對定量方法通過與表達(dá)水 平相對穩(wěn)定的內(nèi)參基因比較來反映目的基因的表達(dá)水平，是一種簡單有效的檢測基因表達(dá) 水平的方法，整個PCR反應(yīng)過程只需1.5小時即可完成。但現(xiàn)有技術(shù)中缺乏高效的針對檢測 人源性manf基因表達(dá)水平的特異性引物探針組合。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題提出的一種高效的用于檢測人源性manf基 因表達(dá)水平的特異性引物探針組合及其方法。
[0006] 為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施為：
[0007] 設(shè)計一種用于檢測人源性manf基因表達(dá)水平的特異性引物探針組合，包括：
[0008] 根據(jù)NCBI公布的human MANF mRNA序列（序列號:NM_006010.4)設(shè)計manf基因檢測 引物探針組合：
[0009]上游引物 F-manf 序列為：5 ' -AAGAAGGACAGCCAGATATGTGA-3 '
[0010]下游引物R-manf 序列為：5 ' -CACAGCCTTTGCATGTCTCC-3 '
[0011 ]探針 p-manf?序列為:5 ' -ACAGTGGACCTGAAGAAGCTCCGA-3，
[0012] 選擇beta-act in作為內(nèi)參，根據(jù)NCBI公布的beta act in的mRNA序列（序列號:NM_ 031144.3)設(shè)計beta-act in內(nèi)參基因引物探針組合：
[0013] 上游引物 F-actinb 序列為:5 ' -TATCGCCGCGCTCGTCGTC-3 '
[0014] 下游引物 R-act inb 序列為：5 ' -CCTCGTCGCCCACATAGGA-3 '
[0015]
[0016]為了進(jìn)一步優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括：
[0017] 優(yōu)選地，上述探針p-manf和探針p-act inb由不同的檢測焚光基團(tuán)標(biāo)記。
[0018] 優(yōu)選地，上述探針P-manf的焚光基團(tuán)為Fam，淬滅基團(tuán)為BHQ1，上述探針P-act inb 的熒光基團(tuán)為Joe，淬滅基團(tuán)為BHQ1。
[0019] 另一方面，本發(fā)明還提供一種檢測人源性manf基因表達(dá)水平的方法，使用如上述 的特異性引物探針組合而進(jìn)行;兩種探針組合分別采用不同的檢測熒光標(biāo)記，將兩套引物 探針共用于一個PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行二重?zé)晒釶CR檢測，即同一個反應(yīng)體系中同時檢測目的 manf基因和內(nèi)參基因。
[0020] 同時，本發(fā)明還提供一種用于檢測人源性manf基因表達(dá)水平的試劑盒，包含有上 述的特異性引物探針組合。
[0021 ]優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒還包括聚合酶、dNTP和緩沖液;更優(yōu)選地，上述聚合酶為 熱穩(wěn)定性聚合酶。
[0022]本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果:本發(fā)明針對人源 性manf基因的mRNA，設(shè)計的特異性引物探針組合，可通過焚光定量PCR相對定量方法對manf 基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測;本發(fā)明的特異性引物探針組合可特異性擴增人源性manf基因， 避免鼠同源性基因的干擾，并可在同一反應(yīng)體系中檢測內(nèi)參基因，試劑使用方便，只需加入 相關(guān)檢測模板即可，不需要繁瑣的操作步驟，整個檢測只需1.5h即可完成，大大提高了人源 性manf基因的檢測效率。
【附圖說明】
[0023]圖1為實施例二中瞬時轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞manf基因 mRNA表達(dá)水平比較 [0024]圖2為實施例四中實驗組manf基因表達(dá)檢測結(jié)果
[0025]圖3為實施例四中對照組manf基因表達(dá)檢測結(jié)果
【具體實施方式】
[0026]本發(fā)明提供了一種用于檢測人源性manf基因表達(dá)水平的特異性引物探針組合，包 括：
[0027] manf基因檢測引物探針組合：
[0028] 上游引物 F-manf 序列為：5 ' -AAGAAGGACAGCCAGATATGTGA-3 '
[0029] 下游引物R-manf 序列為：5 ' -CACAGCCTTTGCATGTCTCC-3 '
[0030]探針 P-manf 序列為：5 ' -ACAGTGGACCTGAAGAAGCTCCGA-3 '
[0031] beta-actin內(nèi)參基因引物探針組合：
[0032] 上游引物 F-actinb 序列為：5 ' -TATCGCCGCGCTCGTCGTC-3 '
[0033] 下游引物R-actinb 序列為：5 ' -CCTCGTCGCCCACATAGGA-3 '
[0034] 探針P-actinb序列為：5' -CAACGGCTCCGGCATGTGCAAG-3'。
[0035] 利用本發(fā)明的特異性引物探針組合和方法檢測人源性manf基因表達(dá)水平時，基本 操作為：
[0036] 步驟1.組織或細(xì)胞RNA提取
[0037] 采用商品化試劑盒提取細(xì)胞或組織RNA，并測定濃度，控制提取質(zhì)量0D260/280~ 2.0〇
[0038] 步驟2.CDNA反轉(zhuǎn)錄
[0039] 取大約1微克RNA采用商品化試劑盒進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄。。
[0040] 步驟3.熒光定量PCR反應(yīng)
[0041 ] 熒光PCR反應(yīng)體系：
[0042] 1XPCR 緩沖液 dNTP 各 0. 2inM 各上游引物（F-manf.，. F-ac.t.inb) 各():·1.~ΙμΜ 各下游引物（R-腿nf:，. R-aetinb) 各().1 ~1 .μ Μ
[0043] 各探針.(P-manf，P-actinb) 各()·1.~0. 5μΜ Taq 酶 0. 5 ~2:· 0U 模板（1:5稀釋的cDNA) 5μ] 總體積 2:5 μ 1
[0044] 熒光定量PCR反應(yīng)條件：95 °C lOmin，然后再運行40個循環(huán)（具體95 °C 15s，60 °C lmin)，退火時檢測焚光信號。
[0045] 步驟4.檢測結(jié)果分析
[0046] 根據(jù)系統(tǒng)自動基線和對數(shù)期閾值設(shè)置獲得各個反應(yīng)的CT值。
[0047] 計算2^^1直，即實驗組manf基因 mRNA表達(dá)水平與對照組比較的倍數(shù)。
[0048] Λ ACT = (CTmanf (實驗組)-CTact in (實驗組））-(CTmanf (對照組)-CTac t in (對照 組)）
[0049] 下面通過具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)和具體的介紹，以使更好的理解本發(fā)明， 但是下述實施例并不限制本發(fā)明范圍。
[0050] 實施例一檢測人源性manf基因表達(dá)水平的方法 [0051 ] 步驟1.組織或細(xì)胞RNA提取
[0052] 采用商品化試劑盒提取細(xì)胞或組織RNA，并測定濃度，控制提取質(zhì)量0D260/280~ 2.0。本實施例采用天根總RNA提取試劑盒或OMEGA totalRNA kitl提取細(xì)胞或組織RNA，具 體操作按說明書進(jìn)行。紫外分光光度計測定RNA濃度。
[0053] 步驟2.cDNA反轉(zhuǎn)錄
[0054]取大約1微克RNA采用商品化試劑盒進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄。本實施例采用Thermo Scientific的商品化試劑盒RevertAid First strand cDNA synthesis kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄， 具體操作按說明書進(jìn)行。
[0055] 步驟3.熒光定量PCR反應(yīng) [0056] 熒光PCR反應(yīng)體系：
[0057] 1XPCR 緩沖液 dNTP 各 0· 2mM 各上游引物（F-manf, F-actinb) 各 0.1~1 μ Μ 各Τ 游引物（Rianf，R-actinb) 各 0,11 μ Μ
[0058] 各探針.(Ρ-脆nf，P-actinb) 各 0.1 ~0,5 UM Tag 酶 0· :5.~.2, 〇U 模板（1:5稀釋的cDNA) 5μ1 總體積 25 μ 1
[0059] 熒光定量PCR反應(yīng)條件：95 °C lOmin，然后再運行40個循環(huán)（具體95 °C 15s，60 °C lmin)，退火時檢測焚光信號。
[0060] 本實施例中采用康為世紀(jì)的GoldstarTaq HS酶和緩沖液以及超純dNTP，反應(yīng)體系 采用25微升。熒光定量PCR儀采用ABI7500。
[0061] 具體的manf基因檢測引物探針組合設(shè)計為：
[0063] beta-actin內(nèi)參基因引物探針組合如下：
[0065] 步驟4.檢測結(jié)果分析
[0066] 根據(jù)系統(tǒng)自動基線和對數(shù)期閾值設(shè)置獲得各個反應(yīng)的CT值。
[0067] 計算2^^1直，即實驗組manf基因 mRNA表達(dá)水平與對照組比較的倍數(shù)。
[0068] Λ ACT = (CTmanf (實驗組)-CTact in (實驗組））-(CTmanf (對照組)-CTac t in (對照 組)）
[0069] 實施例二瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞中人源性manf基因表達(dá)水平分析
[0070]采用含有雷帕霉素調(diào)控序列的prrl-manf質(zhì)粒體外瞬時轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。將293細(xì)胞 按照3.6 X 106/盤的密度接種于100謹(jǐn)dish;第二日配制M40和prrl-manf表達(dá)質(zhì)粒的預(yù)混 物，按照M40瞬轉(zhuǎn)的方案進(jìn)行操作，同樣配制M40和prrl-gfp表達(dá)質(zhì)粒的預(yù)混物進(jìn)行瞬轉(zhuǎn)作 為對照;第三日換液，更換DMEM培養(yǎng)基，并加入1 X雷帕霉素 (LP)誘導(dǎo)manf基因表達(dá)，陰性對 照組細(xì)胞加入等量PBS;分別于48h和72小時收集細(xì)胞，提取RNA，檢測manf基因表達(dá)水平(使 用實施例一中操作步驟和引物探針組合）。檢測結(jié)果(見附圖1)表明經(jīng)prrl-manf質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 細(xì)胞的manf基因表達(dá)水平較陰性對照組高，經(jīng)雷帕霉素誘導(dǎo)的manf基因表達(dá)水平較未經(jīng)誘 導(dǎo)的細(xì)胞高，誘導(dǎo)72h表達(dá)水平高于誘導(dǎo)48小時。
[0071]實施例三病毒感染細(xì)胞中人源性manf基因表達(dá)水平分析 [0072]采用含有雷帕霉素調(diào)控序列的AAV8-MANF包裝病毒體外感染293細(xì)胞。24孔板中接 種293細(xì)胞，接種密度3X10 5/ml。培養(yǎng)24h后細(xì)胞密度約為50%-60%，使用108v.g/ml和 106v. g/ml兩個滴度的AAV8-MANF病毒進(jìn)行感染，并設(shè)不加病毒陰性對照。感染24小時后換 液，加入雷帕霉素(Rapa)，分別使用10倍和1倍工作濃度的雷帕霉素誘導(dǎo)manf基因表達(dá)，同 樣設(shè)置不加雷帕霉素陰性對照組。雷帕霉素誘導(dǎo)24小時后吸去上清，PBS清洗三遍，收集細(xì) 胞，提取RNA，cDNA反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR檢測manf基因表達(dá)水平(操作同實施例一），并 與未加病毒感染的細(xì)胞組進(jìn)行比較。檢測結(jié)果(見表1)表明，兩種不同滴度含有雷帕霉素調(diào) 控序列的AAV8-MANF病毒感染細(xì)胞，經(jīng)雷帕霉素誘導(dǎo)后manf基因表達(dá)水平均升高，采用 10 8v.g/ml滴度病毒感染時升高更明顯。
[0073]表1.雷帕霉素誘導(dǎo)病毒感染細(xì)胞中manf基因表達(dá)水平
[0075]實施例四動物模型中人源性manf基因表達(dá)水平分析
[0076]采用SD大鼠建立動物模型，在立體定位系統(tǒng)引導(dǎo)下在大鼠中腦黑質(zhì)部位注射帶有 雷帕霉素調(diào)控序列的AAV8-MANF病毒，3周后分別腹腔注射雷帕霉素或PBS，再經(jīng)過3周取大 鼠注射部位腦組織。采用商品化試劑盒提取RNA，具體操作按照說明書進(jìn)行，并測定RNA濃 度。實驗組和對照組動物組織RNA分別取lyg采用商品化試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行熒光 定量PCR反應(yīng)檢測人源性manf基因表達(dá)水平。有代表性的實驗組動物的manf基因檢測結(jié)果 見附圖2,對照組動物manf基因檢測結(jié)果見附圖3。檢測結(jié)果表明，注射AAV8-MANF病毒的動 物經(jīng)雷帕霉素誘導(dǎo)后manf基因表達(dá)水平明顯高于對照組，約為對照組表達(dá)量的15倍(見表 2) 〇
[0077] 表2.動物模型中manf基因表達(dá)水平比較
[0079] 通過上述的實施例可以知道，本發(fā)明的特異性引物探針組合及相應(yīng)的方法，可以 特異性擴增人源性manf基因，避免鼠同源性基因的干擾，并可在同一反應(yīng)體系中檢測內(nèi)參 基因，檢測過程fg]單、尚效，大大提尚了人源性manf基因的檢測效率。
[0080] 以上對本發(fā)明的具體實施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限 制于以上描述的具體實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和 替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種用于檢測人源性manf基因表達(dá)水平的特異性引物探針組合，其特征在于，包括： manf基因檢測引物探針組合： 上游引物 F-manf 序列為：5 ' -AAGAAGGACAGCCAGATATGTGA-3， 下游引物 R-manf 序列為：5 ' -CACAGCCTTTGCATGTCTCC-3 ' 探針 P-manf 序列為:5 ' -ACAGTGGACCTGAAGAAGCTCCGA-3， beta-act in內(nèi)參基因引物探針組合： 上游引物 F-actinb 序列為：5 ' -TATCGCCGCGCTCGTCGTC-3 ' 下游引物 R-actinb 序列為:5 ' -CCTCGTCGCCCACATAGGA-3 ' 探針P-actinb序列為：5 ' -CAACGGCTCCGGCATGTGCAAG-3 '。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性引物探針組合，其特征在于，所述探針P-manf和探針P-actinb由不同的檢測焚光基團(tuán)標(biāo)記。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的特異性引物探針組合，其特征在于，所述探針P-manf的熒光基 團(tuán)為Fam，淬滅基團(tuán)為BHQ1，所述探針P-actinb的熒光基團(tuán)為Joe，淬滅基團(tuán)為BHQ1。4. 一種檢測人源性manf基因表達(dá)水平的方法，其特征在于，使用如權(quán)利要求1-3任意一 項所述的特異性引物探針組合而進(jìn)行。5. -種用于檢測人源性manf基因表達(dá)水平的試劑盒，其特征在于，包含有如權(quán)利要求 1-3任意一項所述的特異性引物探針組合。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，還包括聚合酶、dNTP和緩沖液。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述聚合酶為熱穩(wěn)定性聚合酶。
【文檔編號】C12Q1/68GK105969840SQ201510848878
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2015年11月27日
【發(fā)明人】靳令經(jīng), 蔣明, 于麗華, 房健民
【申請人】上海市同濟(jì)醫(yī)院, 同濟(jì)大學(xué)蘇州研究院