一種用于檢測car-t轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的引物、探針和方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于檢測CAR?T轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的引物、探針和方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的檢測CAR?T轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列為：GCTGTAGCTGCCGATTTCC，所述下游引物的序列為：TCGTCCTAGATTGAGCTCGTTA。本發(fā)明提供的引物和探針用于Real?Time PCR檢測的特異性好，能夠準(zhǔn)確檢測CAR?T的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，提高了檢測效率，為其在免疫細(xì)胞治療技術(shù)的療效檢測提供有力的支持。
【專利說明】
-種用于檢測CAR-T轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的引物、探針和方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種用于檢測CAR-T轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的引物、探針和 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 嵌合抗原受體 T細(xì)胞免疫療法（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，CAR-T)，作為腫瘤免疫細(xì)胞治療的前言技術(shù)，在急性白血病和非霍奇金淋 己瘤的治療上有著顯著的療效。CAR-T的基本原理就是利用病人自身的T細(xì)胞，嵌合抗原受 體修飾后，可W特異性地識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原，使效應(yīng)T細(xì)胞的祀向性、殺傷活性和持久性均 較常規(guī)應(yīng)用的免疫細(xì)胞高，并可克服腫瘤局部免疫抑制微環(huán)境并打破宿主免疫耐受狀態(tài)。
[0003] 作為一種腫瘤疾病的療法，CAR-T在注射到患者體內(nèi)實(shí)現(xiàn)免疫治療之前，需要有效 的質(zhì)控手段，判斷CAR-T是否達(dá)到治療要求，即需要對CAR-T轉(zhuǎn)導(dǎo)效率進(jìn)行檢測?，F(xiàn)有的檢測 方法包括ReaI-Time PCR法，流式細(xì)胞術(shù)等。
[0004] 中國專利申請201610079872.0公開了檢測CAR-T細(xì)胞的捕獲探針、該細(xì)胞含量的 檢測方法;捕獲探針包括能夠結(jié)合在CAR-T細(xì)胞的配體，W及結(jié)合在該配體上的巧光分子， 通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行CAR-T細(xì)胞的檢測。
[0005] Real-Time PCR法由于操作簡便、精確且成本較低，被作為檢測CAR-T轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的 常用方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種用于檢測CAR-T轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的引物、 探針和方法，引物和探針針對CAR-T基因序列中的保守序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，結(jié)合本發(fā)明提供的方 法，可W實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的定量檢測，操作方便，準(zhǔn)確性好，克服了現(xiàn)有技術(shù)對CAR-T檢測特異 性低、準(zhǔn)確性低且易產(chǎn)生假陽性的問題。
[0007] 本發(fā)明提供一種用于檢測CAR-T轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的引物，包括上游引物和下游引物;上游 引物的序列為：GCTGTAGCTGCCGATTTCC，即SEQ ID N0:1，下游引物的序列為： TCGTCCTAGATTGAGCTCGTTA，即SEQ ID N0:2。
[0008] 相應(yīng)地，本發(fā)明還提供一種與上述引物配合使用的探針，所述探針的序列為： ACTCTCAGTTCACATC，即SEQ ID N0:3。
[0009] 本發(fā)明提供的引物和探針針對CAR-T基因序列中的保守序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，用于Real-Time PCR 檢測的特異性好，能夠準(zhǔn)確檢測 CAR-T 的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，提高了檢測效率，為其在免疫 細(xì)胞治療技術(shù)的療效檢測提供有力的支持。上游引物和下游引物均無引物二聚體，且上游 引物和下游引物的退火溫度差距較小。
[0010] 優(yōu)選地，所述探針的5'端標(biāo)記有巧光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有巧光澤滅基團(tuán)。
[0011] 更優(yōu)選地，所述巧光報(bào)告基團(tuán)選自VIC;所述巧光澤滅基團(tuán)為MGB。
[0012] 此外，本發(fā)明還提供一種用于檢測CAR-T轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法，包括如下步驟：
[001引 SlDNA模板的制作:無菌環(huán)境中，取培養(yǎng)的CAR-T細(xì)胞，提取DNA;
[0014] S2系列標(biāo)準(zhǔn)品的制作:使用質(zhì)粒CART-19scFv作為標(biāo)準(zhǔn)品母液，提取感染前T淋己 細(xì)胞DNA，用來稀釋CART-19scFv質(zhì)粒，制成系列標(biāo)準(zhǔn)品；系列標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)分別為1.590E +08、1.590E+07、1.590E+06、1.590E+05、1.590E+04、1.590E+03、1.590E+02、1.590E+01;
[0015] S3Real-Time PCR檢測：配制反應(yīng)體系，該反應(yīng)體系包括權(quán)利要求1所述的引物W 及權(quán)利要求2至4任一項(xiàng)所述的探針，對DNA模板進(jìn)行Real-Time PCR擴(kuò)增反應(yīng)，收集巧光信 號，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出CAR-T基因拷貝數(shù)和CAR-T轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
[0016] 優(yōu)選地，所述Real-Time PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：95°C15min;94°C5s，62°C 10s，72 °C 20s，共 40 個(gè)循環(huán);72 °C 300s。
[0017] 優(yōu)選地，所述步驟SI中的培養(yǎng)天數(shù)為10~14天。按現(xiàn)有培養(yǎng)方法，通過10~14天的 培養(yǎng)，得到對數(shù)生長期的細(xì)胞，即最終的CAR-T產(chǎn)物。
[001引 CART-19scFv質(zhì)粒的構(gòu)建方法為:將CAR重組基因全序列合成，通過Asisl/Nsil雙 酶切連入慢病毒質(zhì)粒載體pLent-EFla中，得到CART-19scFv質(zhì)粒。CART-19scFv質(zhì)粒的譜圖 如圖1所示。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果包括:本發(fā)明提供的引物和探針針對CAR-T基 因序列中的保守序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，用于Real-Time PCR檢測的特異性好，能夠準(zhǔn)確檢測CAR-T 的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，提高了檢測效率，為其在免疫細(xì)胞治療技術(shù)的療效檢測提供有力的支持。本發(fā) 明提供的Real-Time PCR檢測方法簡單，可W實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的定量檢測，操作方便，準(zhǔn)確性 好。
【附圖說明】
[0020] 圖 1 CART-19scFv 質(zhì)粒的譜圖。
[0021] 圖2本發(fā)明引物組的擴(kuò)增曲線。
[0022] 圖3對比引物組的擴(kuò)增曲線。
[0023] 圖4本發(fā)明引物組檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0024] 圖5本發(fā)明實(shí)施例二中包含樣品的擴(kuò)增曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0026] 本發(fā)明中設(shè)及的材料可通過市售或本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)獲得。如:DNA提取試劑盒購 自美國Axygen公司，Super Real Real PreMix購自天根生化科技(北京)有限公司，等。
[0027] 實(shí)施例一引物和探針
[0028] 用于檢測CAR-T轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的引物，包括上游引物和下游引物，上游引物的序列為： GCTGTAGCTGCCGATTTCC，即沈Q ID NO: 1;下游引物的序列為：TCGTCCTAGATTGAGCTCGTTA，即 沈Q ID N0:2。
[00巧]與上述引物配合使用的探針，所述探針的序列為:ACTCTCAGTTCACATC，即SEQ ID N0:3。探針的5'端標(biāo)記有巧光報(bào)告基團(tuán)VIC，3'端標(biāo)記有巧光澤滅基團(tuán)MGB。設(shè)計(jì)的引物交由 通用生物系統(tǒng)(安徽)公司合成，探針交由Life Technology公司合成。
[0030] 本發(fā)明同時(shí)設(shè)計(jì)了對比引物組:上游引物的序列為:TGCCGATTTCCAGAAGAAG，即沈Q ID N0:4,下游引物的序列為:GCGCTCCTGCTGAACTTC，即沈Q ID N0:5。
[0031] 實(shí)施例二 Real-Time PCR檢測
[0032] 用于檢測CAR-T轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法，包括如下步驟：
[0033] Sl DNA模板的制作:無菌環(huán)境中，取培養(yǎng)11天的CAR-T細(xì)胞，使用DNA提取試劑盒提 取DNA;使用培養(yǎng)后的CAR-T細(xì)胞數(shù)量為4*10 6個(gè);提取的DNA使用化no化OP儀器進(jìn)行DNA濃度 和純度分析，測得樣品DNA濃度為69ngAil。
[0034] S2系列標(biāo)準(zhǔn)品的制作:使用質(zhì)粒CART-19scFv作為標(biāo)準(zhǔn)品母液，質(zhì)粒CART-19scFv 的濃度為1.47iig/mL，提取感染前淋己細(xì)胞DNA，用來稀釋CART-19scFv質(zhì)粒，制成系列標(biāo)準(zhǔn) 品；系列標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)分別為 1.590E+08、1.590E+07、1.590E+06、1.590E+05、1.590E+04、 1.590E+03、1.590E+02、1.5犯+01;
[0035] S3 Real-Time PCR檢測:配制反應(yīng)體系如表1所示，擴(kuò)增反應(yīng)的條件如表2所示，對 DNA模板進(jìn)行Real-Time PCR擴(kuò)增反應(yīng)，收集巧光信號，使用本發(fā)明提供的引物組（SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2)的擴(kuò)增曲線如圖2所示，使用對比引物組(SEQ ID N0:4和沈Q ID NO: 5)的擴(kuò)增曲線如圖3所示。通過對比圖2和圖3可知，本發(fā)明提供的引物組的擴(kuò)增曲線效果更 好，引物與探針匹配良好。WCq值為縱坐標(biāo)，^Starting Quantity的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制本 發(fā)明引物組的檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。
[0036] 表1反應(yīng)體系
[Qm7l
[C
[C
[0040]本發(fā)明提供的Real-Time PCR檢測方法實(shí)現(xiàn)了CAR-T轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的定量檢測，檢測的 單位為Copies/lOOng genomic DNA(每IOOng基因組中含的CAR-T基因拷貝數(shù)）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲 線，對樣品的CAR-T拷貝數(shù)進(jìn)行定量，換算出每IOOng基因組中含的CAR-T基因拷貝數(shù)，W此 得出轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。此樣品為由90ng基因組DNA擴(kuò)增得出，樣品DNA為從4.OX IO6個(gè)細(xì)胞中得到 的6.90ug基因組DNA取出，計(jì)算得樣品（Cq值為26.34)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為0.55拷貝數(shù)/個(gè)細(xì)胞，陰 性對照的Cq值為39.80dCAR-T產(chǎn)品轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的判斷標(biāo)準(zhǔn)為含0.2拷貝數(shù)/個(gè)細(xì)胞，作為判斷 CAR-T產(chǎn)品是否達(dá)到免疫治療的要求的判斷標(biāo)準(zhǔn)。
[0041] W上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于運(yùn)些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可W做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的 保護(hù)犯i圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測CAR-T轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的引物，其特征在于:包括上游引物和下游引物;所述 上游引物的序列為：GCTGTAGCTGCCGATTTCC，SP SEQ ID NO: 1;所述下游引物的序列為： TCGTCCTAGATTGAGCTCGTTA，SPSEQ ID N0:2。2. -種與權(quán)利要求1所述的引物配合使用的探針，其特征在于：所述探針的序列為： ACTCTCAGTTCACATCCTC，即SEQ ID N0:3。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的探針，其特征在于:所述探針的5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3' 端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的探針，其特征在于:所述熒光報(bào)告基團(tuán)選自VIC;所述熒光淬滅 基團(tuán)為MGB。5. -種用于檢測CAR-T轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法，其特征在于:包括如下步驟： SI DNA模板的制作:無菌環(huán)境中，取培養(yǎng)后的CAR-T細(xì)胞，提取DNA; S2系列標(biāo)準(zhǔn)品的制作:使用質(zhì)粒CART-19scFV作為標(biāo)準(zhǔn)品母液，提取感染前T淋巴細(xì)胞 DNA，用來稀釋CART-19s cFv質(zhì)粒，制成系列標(biāo)準(zhǔn)品； S3 Real-Time PCR檢測：配制反應(yīng)體系，該反應(yīng)體系包括權(quán)利要求1所述的引物以及權(quán) 利要求2至4任一項(xiàng)所述的探針，對DNA模板進(jìn)行Real-Time PCR擴(kuò)增反應(yīng)，收集熒光信號，繪 制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出CAR-T基因拷貝數(shù)和CAR-T轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于檢測CAR-T轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法，其特征在于:所述Real-Time PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的條件為:95°(：151^11;941€58,62°(：1〇8,721€2〇8，共40個(gè)循環(huán) ；721€30〇8。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于檢測CAR-T轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法，其特征在于:所述步驟S1中 的培養(yǎng)天數(shù)為10~14天。
【文檔編號】C12N15/11GK105861733SQ201610424108
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月14日
【發(fā)明人】孫秀蓮, 李欣, 徐鴻
【申請人】宜明細(xì)胞生物科技有限公司