本發(fā)明屬于體外核酸檢測(cè)領(lǐng)域,尤其涉及一種用于檢測(cè)樣品中牛凸隆病毒(Porcine Torovirus,PToV)的熒光RT-PCR引物和探針和試劑盒及檢測(cè)方法,可用于?;钚蠛腿馄窓z疫時(shí)牛凸隆病毒的快速診斷和流行病學(xué)研究。
背景技術(shù):
凸隆病毒(Torovirus)作為套式病毒目(Nidovirairs)冠狀病毒科(Coronaviridae)家族的重要成員,包括馬凸隆病毒(Equine Torovirus,EToV,最初稱為伯爾尼病毒)、牛凸隆病毒(Bovine Torovirus,BToV,最初稱為布雷達(dá)病毒)、豬凸隆病毒(Porcine Torovirus,PToV)和人凸隆病毒(Human Torovirus,HToV)等四種標(biāo)準(zhǔn)型。凸隆病毒有囊膜病毒,表現(xiàn)為圓形,橢圓形、線形或者腎形,也有呈現(xiàn)桿狀和小圓盤狀的記載,最大直徑為120~140nm,基因組為單股正鏈RNA,全長(zhǎng)28,473kb。該病毒感染人和動(dòng)物,主要引起消化道和呼吸道疾病。自1982年,美國(guó)愛(ài)荷華州爆發(fā)一場(chǎng)由牛凸隆病毒引發(fā)的嚴(yán)重腹瀉以來(lái),迄今已有30余年的歷史,期間瑞士、英國(guó)、德國(guó)、南非、巴西、印度、加拿大、荷蘭、澳大利亞、日本、韓國(guó)等全球不同國(guó)家和地區(qū)均有報(bào)道由凸隆病毒感染馬、牛、豬、人等引起的腹瀉事件,相關(guān)流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),該病毒在世界范圍內(nèi)流行,在宿主間呈現(xiàn)高水平的陽(yáng)性率,目前我國(guó)還沒(méi)有關(guān)于牛凸隆病毒相關(guān)研究的報(bào)道,及時(shí)研發(fā)出檢測(cè)牛凸隆病毒快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)試劑盒對(duì)于防止外境相關(guān)病毒的侵入具有重大意義。
凸隆病毒是腸道病原體,可以感染各年齡的易感動(dòng)物,包括豬、牛、馬、人等,主要引起被感染動(dòng)物的胃腸炎。目前被報(bào)道的檢測(cè)手段包括抗原捕獲-沒(méi)聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和免疫電鏡(IEM)。ELISA方法雖然是一個(gè)快速且廉價(jià)方法,但是由于目前凸隆病毒不能在細(xì)胞中培養(yǎng),導(dǎo)致在以發(fā)病動(dòng)物的排泄物或腸道內(nèi)容物作為抗原來(lái)源時(shí),實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生較高背景,大大降低了ELISA方法的特意性和敏感性。
四川農(nóng)業(yè)大學(xué)于2012年申請(qǐng)了專利《一種豬環(huán)曲病毒RT-PCR檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法》,申請(qǐng)?zhí)枺?01210398440.8,該專利采用RT-PCR方法,擴(kuò)增需要采用凝膠電泳技術(shù)才能觀察結(jié)果,實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng),操作復(fù)雜,同時(shí)采取開(kāi)蓋處理容易產(chǎn)生氣溶膠污染,并不適合開(kāi)發(fā)快速,便捷產(chǎn)品。
IEM方法是一個(gè)流行病學(xué)診斷中非常重要的方法,但是由于其需要高度精密設(shè)備和較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間,加之檢測(cè)成本較高,所以很難做到大范圍推廣和商業(yè)化。
實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù),通過(guò)引入特異性探針和熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)使PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增及分析的全過(guò)程可以在單管內(nèi)封閉完成,并且可以對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及自動(dòng)分析結(jié)果,具有實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便等特點(diǎn),是一種先進(jìn)的分子檢測(cè)技術(shù)。目前還沒(méi)有基于實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)建立的牛凸隆病毒核酸檢測(cè)方法及試劑盒。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明目的之一是提供一種用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)檢測(cè)牛凸隆病毒的熒光RT-PCR引物和熒光探針。其是針對(duì)于牛凸隆病毒多聚蛋白(M蛋白)基因編碼區(qū)的特異保守區(qū)域?yàn)榘袠?biāo)區(qū)域,設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物及熒光探針。
本發(fā)明目的之二是提供一種包括上述熒光RT-PCR引物和熒光探針的試劑盒。
本發(fā)明的目的之三是提供一種使用上述熒光RT-PCR引物和熒光探針對(duì)牛凸隆病毒的檢測(cè)方法,該檢測(cè)方法可以快速、定性檢測(cè)樣本中的牛凸隆病毒。
為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
一種用于檢測(cè)牛凸隆病毒的熒光RT-PCR引物和熒光探針,其特征在于,所述熒光RT-PCR引物和熒光探針為針對(duì)牛凸隆病毒多聚蛋白(M蛋白)的保守序列設(shè)計(jì)的牛凸隆病毒特異性正向、反向引物和熒光探針。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn),所述牛凸隆病毒正向、反向引物和熒光探針序列分別是:
正向引物:5'-GCAATAAACCAYTAACAGCTGCTC-3'
反向引物:5'-CTTTAGCGGCGCTGGTAGTAG-3'
熒光探針:5'-TGCTGCGTTGCGGATTTGTGTTGG-3';
所述熒光探針中的3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán),5’端分別標(biāo)記有不同的熒光報(bào)告基團(tuán)。
上述引物和探針的衍生序列也為本發(fā)明的保護(hù)范圍,所述衍生序列包括引物序列的互補(bǔ)鏈序列,同時(shí)還可以向5'端和3'端方向延伸一至十個(gè)堿基或刪減一至十個(gè)堿基得到的序列。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中,所述熒光報(bào)告基團(tuán)選自FAM、JOE或ROX、TET、TAMRA、HEX、VIC、CY3、CY5或Texas Red;所述熒光淬滅基團(tuán)選自BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、Lowa BlackTM RQ或Lowa BlackTM FQ。
一種TaqMan探針?lè)晒釸T-PCR檢測(cè)牛凸隆病毒的試劑盒,其包含RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、內(nèi)標(biāo)溶液、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品,其中RT-PCR反應(yīng)液含有dATP、dUTP、dGTP、dCTP四種核苷酸、內(nèi)標(biāo)正向、反向引物、內(nèi)標(biāo)探針和上述檢測(cè)牛凸隆病毒的牛凸隆病毒特異性正向、反向引物和熒光探針、含有鎂離子的緩沖液。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中,所述內(nèi)標(biāo)正向、反向引物和內(nèi)標(biāo)探針序列分別是:
內(nèi)標(biāo)正向引物:5'-GCCTCCTGGTCTGTGATCCTC-3'
內(nèi)標(biāo)反向引物:5'-GAAGTGGGCACATCCATAGAGC-3'
內(nèi)標(biāo)探針:5'-TTCTTGACACCCTGCATCCATTACCTCC-3';
所述內(nèi)標(biāo)探針的5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán),3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中,所述熒光報(bào)告基團(tuán)選自FAM、NEX、ROX、TET、TAMRA、JOE、VIC、CY3、CY5或Texas Red;所述熒光淬滅基團(tuán)選自BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、Lowa BlackTM RQ或Lowa BlackTM FQ。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中,所述的酶混合液為包含有熱啟動(dòng)的Taq DNA聚合酶、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑(RNasin)的緩沖液。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中,所述的陽(yáng)性質(zhì)控品為含有插入牛凸隆病毒特異型保守序列的pUC57載體質(zhì)粒的無(wú)菌TE緩沖液,所述陽(yáng)性質(zhì)控品的濃度為1.0×106copies/ml。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中,所述的陽(yáng)性質(zhì)控品為含有插入牛凸隆病 毒特異型保守序列的pUC57載體質(zhì)粒的無(wú)菌TE緩沖液是將含有插入牛凸隆病毒特異型保守序列的pUC57載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中增殖后經(jīng)提取純化用分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度后用無(wú)菌TE緩沖液稀釋后得到。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中,所述牛凸隆病毒特異型保守序列為:
TGCAATAAACCACTAACAGCTGCTCAGGTTGCTGCGTTGCGGATTTGTGTTGGTGGACAATGGTTTGCCTATTCGCGATCAACTACTACCAGCGCCGCTAAAGT。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中,所述的無(wú)菌TE緩沖液采用DEPC水配制。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中,所述的內(nèi)標(biāo)溶液為含有插入人RNP基因特異型保守序列的pUC57載體質(zhì)粒質(zhì)粒。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中,所述的人RNP基因特異型保守序列為:
GAAGTGGGCACATCCATAGAGCACCCCAGGGAGGCAGAGGAGGTAATGGATGCAGGGTGTCAAGAATCGGCAGGGCCTGAGAGGATCACAGACCAGGAGGC。
本試劑盒保存于-20℃,盡量減少反復(fù)凍融。
一種用于非診斷、治療目的的檢測(cè)牛凸隆病毒的熒光RT-PCR方法,包括以下步驟:
(1)樣本RNA的提?。核鰳颖綬NA可以采用深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)病毒RNA磁珠提取試劑盒,按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行提??;
(2)以待檢測(cè)樣本RNA為模板,采用上述的RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、內(nèi)標(biāo)溶液與待檢測(cè)樣本RNA一起配制RT-PCR反應(yīng)體系,對(duì)RNA模板進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)條件為:第一階段:50℃15min,95℃2min,1個(gè)循環(huán);第二階段:95℃10s,60℃30s,40個(gè)循環(huán);第二階段每個(gè)循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號(hào);所述熒光探針和內(nèi)標(biāo)探針?lè)謩e對(duì)應(yīng)兩個(gè)熒光檢測(cè)通道,分別為目標(biāo)熒光通道和內(nèi)標(biāo)熒光通道;
(3)反應(yīng)結(jié)束后,讀取并記錄檢測(cè)通道擴(kuò)增曲線及擴(kuò)增循環(huán)數(shù)Ct,根據(jù)擴(kuò)增曲線和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的判斷:當(dāng)FAM通道和NEX通道均有擴(kuò)增曲線,且Ct值均≤37,可判定牛凸隆病毒陽(yáng)性;當(dāng)FAM通道無(wú)擴(kuò)增曲線,且Ct值顯示為Undet或No Ct,NEX通道有擴(kuò)增曲線,且Ct值均≤37時(shí)可判定牛凸隆病毒陰性;當(dāng)FAM通道有擴(kuò)增曲線,但37<Ct值≤40,NEX通道有擴(kuò)增曲線,且Ct值均≤37時(shí)建議重復(fù)一次實(shí)驗(yàn),如果結(jié)果同上,可判定為陽(yáng) 性,如果無(wú)擴(kuò)增,可判定為陰性;當(dāng)FAM通道和NEX通道均無(wú)擴(kuò)增曲線,且Ct值顯示為Undet或No Ct,實(shí)驗(yàn)無(wú)效、建議更換一批試劑重新實(shí)驗(yàn)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中,所述RT-PCR反應(yīng)體系中,RT-PCR反應(yīng)液18μl、酶混合液1μl、內(nèi)標(biāo)溶液1μl、RNA模板5μl。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中,步驟(3)中的分析條件設(shè)置如下:根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)基線(Baseline)的Start值、Stop值以及閾值(Threshold)的Value值(用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整,Start值可以在3-15、end值可以在5-20,調(diào)整陰性對(duì)照的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線),使儀器給出正確的結(jié)果。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中,步驟(3)中的質(zhì)量控制條件如下:
1).陰性對(duì)照:FAM通道無(wú)擴(kuò)增曲線,NEX通道有擴(kuò)增曲線,且Ct值均≤32;
2).陽(yáng)性對(duì)照:FAM通道和NEX通道均有擴(kuò)增曲線,且Ct值均≤32;
以上兩個(gè)要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足,否則,本次實(shí)驗(yàn)無(wú)效,需要重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
Ct值(cycle threshold,Ct)的定義為:每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。閾值的設(shè)定一般是將其設(shè)定為恰好可以覆蓋住陰性對(duì)照和空白對(duì)照的熒光值處,因此可以很好的去除反應(yīng)管熒光值即背景。
本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)快速、特異的單管檢測(cè)樣本中是否含有牛凸隆病毒,與其它檢測(cè)技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn):
1、全封閉反應(yīng),實(shí)時(shí)監(jiān)控?zé)晒鈹?shù)據(jù),無(wú)需后續(xù)處理,避免污染,保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性。
2、快速,操作簡(jiǎn)單,全程3個(gè)小時(shí)即可出診斷結(jié)果,大大縮短檢測(cè)時(shí)間。
3、實(shí)現(xiàn)單管雙重檢測(cè),同時(shí)引入了內(nèi)標(biāo)質(zhì)控,提高了檢測(cè)人員的檢測(cè)效率,監(jiān)控抽提效率和排除抑制劑干擾。
4、探針?lè)晒舛縋CR技術(shù)特有的優(yōu)勢(shì),即特異性更強(qiáng)、靈敏度更高,完全滿足牛凸隆病毒流行病學(xué)診斷和疫情監(jiān)控,為降低病死率以及控制疫情爭(zhēng)取時(shí)間。
附圖說(shuō)明
圖1為牛凸隆病毒檢測(cè)試劑盒的FAM通道線性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。圖中S1-S7表示濃度為1.0×109copies/ml、1.0×108copies/ml、1.0×107copies/ml、1.0×106copies/ml、1.0×105copies/ml、1.0×104copies/ml、1.0×103copies/ml的陽(yáng)性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線,各3個(gè)重復(fù)數(shù)據(jù),CK為陰性質(zhì)控品,橫坐標(biāo)cycle表示擴(kuò)增循環(huán)數(shù),縱坐標(biāo)△Rn表示熒光強(qiáng)度。通過(guò)該圖可以說(shuō)明該試劑盒的在1.0×109copies/ml至1.0×103copies/ml之間具有很好的線性關(guān)系。
圖2為牛凸隆病毒核酸檢測(cè)試劑盒的FAM通道標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。該試劑盒擬合的線性方程為:Y=-3.4412x+44.938,相關(guān)系數(shù)R2=0.99991,其中Y代表Ct值,x代表陽(yáng)性參考品的對(duì)數(shù)值
圖3為牛凸隆病毒檢測(cè)試劑盒的檢出限實(shí)驗(yàn)示意圖。其中S6-S8分別為1.0×104copies/ml、1.0×103copies/ml、1.0×102copies/ml,各20次重復(fù)數(shù)據(jù),該圖說(shuō)明該試劑盒的檢測(cè)限達(dá)到5copies/反應(yīng)。
圖4為牛凸隆病毒檢測(cè)試劑盒的精密度實(shí)驗(yàn)示意圖。其中S4和S6分別為1.0×106copies/ml、1.0×104copies/ml,各10次重復(fù)數(shù)據(jù)。
圖5為牛凸隆病毒檢測(cè)試劑盒的特異性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。圖中橫坐標(biāo)cycle表示擴(kuò)增循環(huán)數(shù),縱坐標(biāo)△Rn表示熒光強(qiáng)度,CK代表陰性質(zhì)控品,A代表BToV陽(yáng)性質(zhì)控品FAM通道擴(kuò)增曲線,B代表內(nèi)標(biāo)陽(yáng)性質(zhì)控品NEX通道擴(kuò)增曲線,特異性參考品分別為牛輪狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛細(xì)小病毒、布魯氏桿菌、牛結(jié)核分支桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌、糞腸球菌。這8種特異性參考品均未有典型的“S”型擴(kuò)增曲線,說(shuō)明該試劑盒特異性良好。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明具有用于檢測(cè)牛凸隆病毒的熒光RT-PCR引物和熒光探針的試劑盒及檢測(cè)方法采用Taqman探針?lè)晒釶CR檢測(cè)技術(shù),快速檢測(cè)樣品中牛凸隆病毒特有序列,從而判斷樣品中是否存在牛凸隆病毒。下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明,本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特色將會(huì)隨著描述而更加清楚。這些實(shí)施例僅是示范性,并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該 理解的是,凡是利用本發(fā)明內(nèi)容所做的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換,直接或間接運(yùn)用于其他相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域,均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。試劑盒在檢測(cè)牛凸隆病毒的使用方法即檢測(cè)方法,下面以試劑盒為例進(jìn)行線性實(shí)驗(yàn)、最低檢出限實(shí)驗(yàn)、精密度實(shí)驗(yàn)和特異性實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例1試劑盒的線性實(shí)驗(yàn)
目標(biāo)靶標(biāo)探針標(biāo)記為FAM熒光基團(tuán),該試劑盒的FAM通道的線性參比品,由含有牛凸隆病毒目的片段的質(zhì)粒組成,采用TE緩沖液將陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行10倍的梯度稀釋得到下列梯度溶液(S1:1.0×109copies/ml、S2:1.0×108copies/ml、S3:1.0×107copies/ml、S4:1.0×106copies/ml、S5:1.0×105copies/ml、S6:1.0×104copies/ml、S7:1.0×103copies/ml)作為的線性參比品,通過(guò)該實(shí)驗(yàn)表明該試劑盒的在1.0×109copies/ml至1.0×103copies/ml之間具有很好的線性關(guān)系,同時(shí)該試劑盒擬合的線性方程為:Y=-3.4412x+44.938,相關(guān)系數(shù)R2=0.99991,其中Y代表Ct值,x代表陽(yáng)性參考品的對(duì)數(shù)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果參考圖1,標(biāo)準(zhǔn)曲線參考圖2。
實(shí)施例2試劑盒的最低檢出限實(shí)驗(yàn)
該實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證試劑盒的最低檢出限,采用線性參比品中的S6:1.0×104copies/ml、S7:1.0×103copies/ml、S8:1.0×102copies/ml等濃度的陽(yáng)性質(zhì)粒作為檢出限參比品,每個(gè)濃度進(jìn)行20個(gè)重復(fù)樣品,其中檢出限參比品S6和S7全部表現(xiàn)為擴(kuò)增曲線,為陽(yáng)性數(shù)據(jù),S8參比品僅有9個(gè)樣品擴(kuò)增出S型曲線,不滿足要求,因此通過(guò)該實(shí)驗(yàn)表明該試劑盒的檢出限為1.0×103copies/ml,即達(dá)到5copies/反應(yīng),實(shí)驗(yàn)結(jié)果參考圖3。
實(shí)施例3試劑盒的精密度實(shí)驗(yàn)
該實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證試劑盒的批內(nèi)精密度,采用線性參比品中的S4:1.0×106copies/ml、S6:1.0×104copies/ml等兩個(gè)高低濃度的陽(yáng)性質(zhì)粒作為精密度參比品,各做10個(gè)重復(fù)樣本,結(jié)果兩個(gè)濃度數(shù)據(jù)變異系數(shù)均小于5%,實(shí)驗(yàn)結(jié)果參考圖4。
實(shí)施例4試劑盒的特異性實(shí)驗(yàn)
該實(shí)驗(yàn)選擇與牛凸隆病毒具有相同感染感染部位的常見(jiàn)病原體作為特異性參考品,采用的是滅活陽(yáng)性樣本。特異性參考品分別為牛輪狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛細(xì)小病毒、布魯氏桿菌、牛結(jié)核分支桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌、糞腸球菌。利用深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司研發(fā)的通用性病毒DNA/RNA提取試劑盒提取以上滅活樣本中的RNA作為模板進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明這8種特異性參考品均未有典型的“S”型擴(kuò)增曲線,說(shuō)明該試劑盒特異性良好,實(shí)驗(yàn)結(jié)果參考圖5。