本發(fā)明屬于體外核酸檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于檢測(cè)樣品中牛凸隆病毒(Porcine Torovirus,PToV)的熒光RT-PCR引物和探針和試劑盒及檢測(cè)方法，可用于?；钚蠛腿馄窓z疫時(shí)牛凸隆病毒的快速診斷和流行病學(xué)研究。

背景技術(shù)：

凸隆病毒(Torovirus)作為套式病毒目(Nidovirairs)冠狀病毒科(Coronaviridae)家族的重要成員，包括馬凸隆病毒(Equine Torovirus，EToV，最初稱為伯爾尼病毒)、牛凸隆病毒(Bovine Torovirus，BToV，最初稱為布雷達(dá)病毒)、豬凸隆病毒(Porcine Torovirus，PToV)和人凸隆病毒(Human Torovirus，HToV)等四種標(biāo)準(zhǔn)型。凸隆病毒有囊膜病毒，表現(xiàn)為圓形，橢圓形、線形或者腎形，也有呈現(xiàn)桿狀和小圓盤狀的記載，最大直徑為120～140nm，基因組為單股正鏈RNA，全長(zhǎng)28,473kb。該病毒感染人和動(dòng)物，主要引起消化道和呼吸道疾病。自1982年，美國(guó)愛(ài)荷華州爆發(fā)一場(chǎng)由牛凸隆病毒引發(fā)的嚴(yán)重腹瀉以來(lái)，迄今已有30余年的歷史，期間瑞士、英國(guó)、德國(guó)、南非、巴西、印度、加拿大、荷蘭、澳大利亞、日本、韓國(guó)等全球不同國(guó)家和地區(qū)均有報(bào)道由凸隆病毒感染馬、牛、豬、人等引起的腹瀉事件，相關(guān)流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，該病毒在世界范圍內(nèi)流行，在宿主間呈現(xiàn)高水平的陽(yáng)性率，目前我國(guó)還沒(méi)有關(guān)于牛凸隆病毒相關(guān)研究的報(bào)道，及時(shí)研發(fā)出檢測(cè)牛凸隆病毒快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)試劑盒對(duì)于防止外境相關(guān)病毒的侵入具有重大意義。

凸隆病毒是腸道病原體，可以感染各年齡的易感動(dòng)物，包括豬、牛、馬、人等，主要引起被感染動(dòng)物的胃腸炎。目前被報(bào)道的檢測(cè)手段包括抗原捕獲-沒(méi)聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和免疫電鏡(IEM)。ELISA方法雖然是一個(gè)快速且廉價(jià)方法，但是由于目前凸隆病毒不能在細(xì)胞中培養(yǎng)，導(dǎo)致在以發(fā)病動(dòng)物的排泄物或腸道內(nèi)容物作為抗原來(lái)源時(shí)，實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生較高背景，大大降低了ELISA方法的特意性和敏感性。

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)于2012年申請(qǐng)了專利《一種豬環(huán)曲病毒RT-PCR檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法》，申請(qǐng)?zhí)枺?01210398440.8，該專利采用RT-PCR方法，擴(kuò)增需要采用凝膠電泳技術(shù)才能觀察結(jié)果，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，操作復(fù)雜，同時(shí)采取開(kāi)蓋處理容易產(chǎn)生氣溶膠污染，并不適合開(kāi)發(fā)快速，便捷產(chǎn)品。

IEM方法是一個(gè)流行病學(xué)診斷中非常重要的方法，但是由于其需要高度精密設(shè)備和較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間，加之檢測(cè)成本較高，所以很難做到大范圍推廣和商業(yè)化。

實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，通過(guò)引入特異性探針和熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)使PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增及分析的全過(guò)程可以在單管內(nèi)封閉完成，并且可以對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及自動(dòng)分析結(jié)果，具有實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，是一種先進(jìn)的分子檢測(cè)技術(shù)。目前還沒(méi)有基于實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)建立的牛凸隆病毒核酸檢測(cè)方法及試劑盒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的之一是提供一種用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)檢測(cè)牛凸隆病毒的熒光RT-PCR引物和熒光探針。其是針對(duì)于牛凸隆病毒多聚蛋白(M蛋白)基因編碼區(qū)的特異保守區(qū)域?yàn)榘袠?biāo)區(qū)域，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物及熒光探針。

本發(fā)明目的之二是提供一種包括上述熒光RT-PCR引物和熒光探針的試劑盒。

本發(fā)明的目的之三是提供一種使用上述熒光RT-PCR引物和熒光探針對(duì)牛凸隆病毒的檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法可以快速、定性檢測(cè)樣本中的牛凸隆病毒。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種用于檢測(cè)牛凸隆病毒的熒光RT-PCR引物和熒光探針，其特征在于，所述熒光RT-PCR引物和熒光探針為針對(duì)牛凸隆病毒多聚蛋白(M蛋白)的保守序列設(shè)計(jì)的牛凸隆病毒特異性正向、反向引物和熒光探針。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述牛凸隆病毒正向、反向引物和熒光探針序列分別是：

正向引物：5'-GCAATAAACCAYTAACAGCTGCTC-3'

反向引物：5'-CTTTAGCGGCGCTGGTAGTAG-3'

熒光探針：5'-TGCTGCGTTGCGGATTTGTGTTGG-3'；

所述熒光探針中的3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，5’端分別標(biāo)記有不同的熒光報(bào)告基團(tuán)。

上述引物和探針的衍生序列也為本發(fā)明的保護(hù)范圍，所述衍生序列包括引物序列的互補(bǔ)鏈序列，同時(shí)還可以向5'端和3'端方向延伸一至十個(gè)堿基或刪減一至十個(gè)堿基得到的序列。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述熒光報(bào)告基團(tuán)選自FAM、JOE或ROX、TET、TAMRA、HEX、VIC、CY3、CY5或Texas Red；所述熒光淬滅基團(tuán)選自BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、Lowa Black^TM RQ或Lowa Black^TM FQ。

一種TaqMan探針?lè)晒釸T-PCR檢測(cè)牛凸隆病毒的試劑盒，其包含RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、內(nèi)標(biāo)溶液、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品,其中RT-PCR反應(yīng)液含有dATP、dUTP、dGTP、dCTP四種核苷酸、內(nèi)標(biāo)正向、反向引物、內(nèi)標(biāo)探針和上述檢測(cè)牛凸隆病毒的牛凸隆病毒特異性正向、反向引物和熒光探針、含有鎂離子的緩沖液。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述內(nèi)標(biāo)正向、反向引物和內(nèi)標(biāo)探針序列分別是：

內(nèi)標(biāo)正向引物：5'-GCCTCCTGGTCTGTGATCCTC-3'

內(nèi)標(biāo)反向引物：5'-GAAGTGGGCACATCCATAGAGC-3'

內(nèi)標(biāo)探針：5'-TTCTTGACACCCTGCATCCATTACCTCC-3'；

所述內(nèi)標(biāo)探針的5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述熒光報(bào)告基團(tuán)選自FAM、NEX、ROX、TET、TAMRA、JOE、VIC、CY3、CY5或Texas Red；所述熒光淬滅基團(tuán)選自BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、Lowa Black^TM RQ或Lowa Black^TM FQ。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述的酶混合液為包含有熱啟動(dòng)的Taq DNA聚合酶、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑(RNasin)的緩沖液。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述的陽(yáng)性質(zhì)控品為含有插入牛凸隆病毒特異型保守序列的pUC57載體質(zhì)粒的無(wú)菌TE緩沖液，所述陽(yáng)性質(zhì)控品的濃度為1.0×10⁶copies/ml。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述的陽(yáng)性質(zhì)控品為含有插入牛凸隆病 毒特異型保守序列的pUC57載體質(zhì)粒的無(wú)菌TE緩沖液是將含有插入牛凸隆病毒特異型保守序列的pUC57載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中增殖后經(jīng)提取純化用分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度后用無(wú)菌TE緩沖液稀釋后得到。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述牛凸隆病毒特異型保守序列為：

TGCAATAAACCACTAACAGCTGCTCAGGTTGCTGCGTTGCGGATTTGTGTTGGTGGACAATGGTTTGCCTATTCGCGATCAACTACTACCAGCGCCGCTAAAGT。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述的無(wú)菌TE緩沖液采用DEPC水配制。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述的內(nèi)標(biāo)溶液為含有插入人RNP基因特異型保守序列的pUC57載體質(zhì)粒質(zhì)粒。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述的人RNP基因特異型保守序列為：

GAAGTGGGCACATCCATAGAGCACCCCAGGGAGGCAGAGGAGGTAATGGATGCAGGGTGTCAAGAATCGGCAGGGCCTGAGAGGATCACAGACCAGGAGGC。

本試劑盒保存于-20℃，盡量減少反復(fù)凍融。

一種用于非診斷、治療目的的檢測(cè)牛凸隆病毒的熒光RT-PCR方法，包括以下步驟：

(1)樣本RNA的提?。核鰳颖綬NA可以采用深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)病毒RNA磁珠提取試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行提??；

(2)以待檢測(cè)樣本RNA為模板，采用上述的RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、內(nèi)標(biāo)溶液與待檢測(cè)樣本RNA一起配制RT-PCR反應(yīng)體系，對(duì)RNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：第一階段：50℃15min，95℃2min，1個(gè)循環(huán)；第二階段：95℃10s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)；第二階段每個(gè)循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號(hào)；所述熒光探針和內(nèi)標(biāo)探針?lè)謩e對(duì)應(yīng)兩個(gè)熒光檢測(cè)通道，分別為目標(biāo)熒光通道和內(nèi)標(biāo)熒光通道；

(3)反應(yīng)結(jié)束后，讀取并記錄檢測(cè)通道擴(kuò)增曲線及擴(kuò)增循環(huán)數(shù)Ct，根據(jù)擴(kuò)增曲線和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的判斷：當(dāng)FAM通道和NEX通道均有擴(kuò)增曲線，且Ct值均≤37，可判定牛凸隆病毒陽(yáng)性；當(dāng)FAM通道無(wú)擴(kuò)增曲線，且Ct值顯示為Undet或No Ct，NEX通道有擴(kuò)增曲線，且Ct值均≤37時(shí)可判定牛凸隆病毒陰性；當(dāng)FAM通道有擴(kuò)增曲線，但37＜Ct值≤40，NEX通道有擴(kuò)增曲線，且Ct值均≤37時(shí)建議重復(fù)一次實(shí)驗(yàn)，如果結(jié)果同上，可判定為陽(yáng) 性，如果無(wú)擴(kuò)增，可判定為陰性；當(dāng)FAM通道和NEX通道均無(wú)擴(kuò)增曲線，且Ct值顯示為Undet或No Ct，實(shí)驗(yàn)無(wú)效、建議更換一批試劑重新實(shí)驗(yàn)。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述RT-PCR反應(yīng)體系中，RT-PCR反應(yīng)液18μl、酶混合液1μl、內(nèi)標(biāo)溶液1μl、RNA模板5μl。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，步驟(3)中的分析條件設(shè)置如下：根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)基線(Baseline)的Start值、Stop值以及閾值(Threshold)的Value值(用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整，Start值可以在3-15、end值可以在5-20，調(diào)整陰性對(duì)照的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線)，使儀器給出正確的結(jié)果。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，步驟(3)中的質(zhì)量控制條件如下：

1).陰性對(duì)照：FAM通道無(wú)擴(kuò)增曲線，NEX通道有擴(kuò)增曲線，且Ct值均≤32；

2).陽(yáng)性對(duì)照：FAM通道和NEX通道均有擴(kuò)增曲線，且Ct值均≤32；

以上兩個(gè)要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則，本次實(shí)驗(yàn)無(wú)效，需要重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

Ct值(cycle threshold，Ct)的定義為：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。閾值的設(shè)定一般是將其設(shè)定為恰好可以覆蓋住陰性對(duì)照和空白對(duì)照的熒光值處，因此可以很好的去除反應(yīng)管熒光值即背景。

本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)快速、特異的單管檢測(cè)樣本中是否含有牛凸隆病毒，與其它檢測(cè)技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、全封閉反應(yīng)，實(shí)時(shí)監(jiān)控?zé)晒鈹?shù)據(jù)，無(wú)需后續(xù)處理，避免污染，保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

2、快速，操作簡(jiǎn)單，全程3個(gè)小時(shí)即可出診斷結(jié)果，大大縮短檢測(cè)時(shí)間。

3、實(shí)現(xiàn)單管雙重檢測(cè)，同時(shí)引入了內(nèi)標(biāo)質(zhì)控，提高了檢測(cè)人員的檢測(cè)效率，監(jiān)控抽提效率和排除抑制劑干擾。

4、探針?lè)晒舛縋CR技術(shù)特有的優(yōu)勢(shì)，即特異性更強(qiáng)、靈敏度更高，完全滿足牛凸隆病毒流行病學(xué)診斷和疫情監(jiān)控，為降低病死率以及控制疫情爭(zhēng)取時(shí)間。

附圖說(shuō)明

圖1為牛凸隆病毒檢測(cè)試劑盒的FAM通道線性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。圖中S1-S7表示濃度為1.0×10⁹copies/ml、1.0×10⁸copies/ml、1.0×10⁷copies/ml、1.0×10⁶copies/ml、1.0×10⁵copies/ml、1.0×10⁴copies/ml、1.0×10³copies/ml的陽(yáng)性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線，各3個(gè)重復(fù)數(shù)據(jù)，CK為陰性質(zhì)控品，橫坐標(biāo)cycle表示擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)△Rn表示熒光強(qiáng)度。通過(guò)該圖可以說(shuō)明該試劑盒的在1.0×10⁹copies/ml至1.0×10³copies/ml之間具有很好的線性關(guān)系。

圖2為牛凸隆病毒核酸檢測(cè)試劑盒的FAM通道標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。該試劑盒擬合的線性方程為：Y＝-3.4412x+44.938，相關(guān)系數(shù)R2＝0.99991，其中Y代表Ct值，x代表陽(yáng)性參考品的對(duì)數(shù)值

圖3為牛凸隆病毒檢測(cè)試劑盒的檢出限實(shí)驗(yàn)示意圖。其中S6-S8分別為1.0×10⁴copies/ml、1.0×10³copies/ml、1.0×10²copies/ml，各20次重復(fù)數(shù)據(jù)，該圖說(shuō)明該試劑盒的檢測(cè)限達(dá)到5copies/反應(yīng)。

圖4為牛凸隆病毒檢測(cè)試劑盒的精密度實(shí)驗(yàn)示意圖。其中S4和S6分別為1.0×10⁶copies/ml、1.0×10⁴copies/ml，各10次重復(fù)數(shù)據(jù)。

圖5為牛凸隆病毒檢測(cè)試劑盒的特異性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。圖中橫坐標(biāo)cycle表示擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)△Rn表示熒光強(qiáng)度，CK代表陰性質(zhì)控品，A代表BToV陽(yáng)性質(zhì)控品FAM通道擴(kuò)增曲線，B代表內(nèi)標(biāo)陽(yáng)性質(zhì)控品NEX通道擴(kuò)增曲線，特異性參考品分別為牛輪狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛細(xì)小病毒、布魯氏桿菌、牛結(jié)核分支桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌、糞腸球菌。這8種特異性參考品均未有典型的“S”型擴(kuò)增曲線，說(shuō)明該試劑盒特異性良好。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明具有用于檢測(cè)牛凸隆病毒的熒光RT-PCR引物和熒光探針的試劑盒及檢測(cè)方法采用Taqman探針?lè)晒釶CR檢測(cè)技術(shù)，快速檢測(cè)樣品中牛凸隆病毒特有序列，從而判斷樣品中是否存在牛凸隆病毒。下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特色將會(huì)隨著描述而更加清楚。這些實(shí)施例僅是示范性，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該 理解的是，凡是利用本發(fā)明內(nèi)容所做的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，直接或間接運(yùn)用于其他相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。試劑盒在檢測(cè)牛凸隆病毒的使用方法即檢測(cè)方法，下面以試劑盒為例進(jìn)行線性實(shí)驗(yàn)、最低檢出限實(shí)驗(yàn)、精密度實(shí)驗(yàn)和特異性實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例1試劑盒的線性實(shí)驗(yàn)

目標(biāo)靶標(biāo)探針標(biāo)記為FAM熒光基團(tuán)，該試劑盒的FAM通道的線性參比品，由含有牛凸隆病毒目的片段的質(zhì)粒組成，采用TE緩沖液將陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行10倍的梯度稀釋得到下列梯度溶液(S1：1.0×10⁹copies/ml、S2：1.0×10⁸copies/ml、S3：1.0×10⁷copies/ml、S4：1.0×10⁶copies/ml、S5：1.0×10⁵copies/ml、S6：1.0×10⁴copies/ml、S7：1.0×10³copies/ml)作為的線性參比品，通過(guò)該實(shí)驗(yàn)表明該試劑盒的在1.0×10⁹copies/ml至1.0×10³copies/ml之間具有很好的線性關(guān)系，同時(shí)該試劑盒擬合的線性方程為：Y＝-3.4412x+44.938，相關(guān)系數(shù)R2＝0.99991，其中Y代表Ct值，x代表陽(yáng)性參考品的對(duì)數(shù)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果參考圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線參考圖2。

實(shí)施例2試劑盒的最低檢出限實(shí)驗(yàn)

該實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證試劑盒的最低檢出限，采用線性參比品中的S6：1.0×10⁴copies/ml、S7：1.0×10³copies/ml、S8：1.0×10²copies/ml等濃度的陽(yáng)性質(zhì)粒作為檢出限參比品，每個(gè)濃度進(jìn)行20個(gè)重復(fù)樣品，其中檢出限參比品S6和S7全部表現(xiàn)為擴(kuò)增曲線，為陽(yáng)性數(shù)據(jù)，S8參比品僅有9個(gè)樣品擴(kuò)增出S型曲線，不滿足要求，因此通過(guò)該實(shí)驗(yàn)表明該試劑盒的檢出限為1.0×10³copies/ml，即達(dá)到5copies/反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果參考圖3。

實(shí)施例3試劑盒的精密度實(shí)驗(yàn)

該實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證試劑盒的批內(nèi)精密度，采用線性參比品中的S4：1.0×10⁶copies/ml、S6：1.0×10⁴copies/ml等兩個(gè)高低濃度的陽(yáng)性質(zhì)粒作為精密度參比品，各做10個(gè)重復(fù)樣本，結(jié)果兩個(gè)濃度數(shù)據(jù)變異系數(shù)均小于5％，實(shí)驗(yàn)結(jié)果參考圖4。

實(shí)施例4試劑盒的特異性實(shí)驗(yàn)

該實(shí)驗(yàn)選擇與牛凸隆病毒具有相同感染感染部位的常見(jiàn)病原體作為特異性參考品，采用的是滅活陽(yáng)性樣本。特異性參考品分別為牛輪狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛細(xì)小病毒、布魯氏桿菌、牛結(jié)核分支桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌、糞腸球菌。利用深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司研發(fā)的通用性病毒DNA/RNA提取試劑盒提取以上滅活樣本中的RNA作為模板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明這8種特異性參考品均未有典型的“S”型擴(kuò)增曲線，說(shuō)明該試劑盒特異性良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果參考圖5。